CC BY
20
УДК 612.084 DOI 10.24412/2311-6447-2022-1-62-67
Определение токсичности, наличия/отсутствия влияния разных концентраций раствора пектина производства КНР и Венгрии на монослой культуры перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ)
Determination of toxicity, the presence /absence of influence
of different concentrations of pectin solution produced by China and Hungary on monolayer cultures of transplanted
pig embryo kidney cells (SPEV)
Аспирант А.В. Макаева (Кубанский государственный аграрный университет им. И.Т. Трубилина) тел. +7(861)221-59-34
Postgraduate Student A.V. Makaeva (Kuban State Agrarian University named after I.T. Trubilin) tel. +7(861)221-59-34
Реферат. Исследовали два вида промышленного пектина, предназначенного для приема внутрь: пектин «Пекто» экстракт жидкий пектиновый яблочный производства Венгрии; сухой порошок промышленного быстрорастворимого яблочного пектина производства КНР. Цель эксперимента - изучение некоторых биологических свойств пектина на рост и пролиферацию клеточной культуры в условиях in vitro. Перевиваемая культура клеток представляла собой клетки млекопитающих, помещённые в ростовую среду in vitro и лишенные в этих условиях естественных факторов врожденного и адаптивного иммунитета. Они являются первой линией в изучении влияния на клетки вносимых извне различных продуктов. Как правило, в этих условиях на культурах клеток возможно изучение наличия или отсутствия токсичности и получение из изучаемого продукта пластических веществ для обеспечения жизнедеятельности и функции размножения (деления клеток). При проведение исследовании на живых клеточных культурах не была выявлена токсичность исследуемых веществ, растворы пектинов не оказывали острого и подострого токсического действия на растущие, делящиеся клетки млекопитающих -функции пролиферации клеточной культуры in vitro и скорость деления клеток на протяжении нескольких генерации клеток в пределах 1 пассажа оставалась неизменной.
Summary. Two types of industrial pectin intended for ingestion were studied: pectin "Pecto" extract of liquid pectin apple production in Hungary; dry powder of industrial instant apple pectin produced by China. The purpose of the experiment is to study some of the biological properties of pectin on the growth and proliferation of cell culture under in vitro conditions. The transposed cell culture was mammalian cells placed in the growth medium in vitro and deprived in these conditions of natural factors of innate and adaptive immunity. They are the first line in the study of the effect on cells of various products introduced from outside. As a rule, under these conditions, it is possible to study the presence or absence of toxicity on cell cultures and obtain plastic substances from the studied product to ensure vital activity and reproduction function (cell division). When conducting studies on living cell cultures, the toxicity of the test substances was not revealed, pectin solutions did not have an acute and subacute toxic effect on growing, dividing mammalian cells - the functions of cell culture proliferation in vitro and the rate of cell division over several cell generations within 1 passage remained unchanged.
Ключевые слова: пектин, полисахариды, спортивные напитки, токсичность, клеточные культуры.
Keywords: pectin, polysaccharides, sports drinks, toxicity, cell cultures.
За последние семьдесят лет удалось сделать большой шаг к пониманию того, как и почему различные продукты питания и пищевые добавки могут помочь людям в улучшении их физических показателей. Вероятно, накопленное количество
(О А.В. Макаева, 2022
информации и большая ее значимость привели к началу производства функционального питания, рассчитанного на совершенствование большого разнообразия факторов, влияющих на потенциал человеческого организма. Возросшая популярность функционального питания позволяет проводить множество исследовании" на предмет того, как современные и наиболее часто используемые ингредиенты способствуют избавлению от физических дисфункций посредством надлежащего дозирования и времени приема таковых.
Однако механизм воздействия различных веществ, используемых в функциональном питании до конца не изучен, одним из наиболее интересных универсальных компонентов, проявляющих разнообразные связывающие свойства, является пектин и пектиновые вещества.
Согласно исследованиям на животных и людях большая часть перорально вводимого пектина проходит через желудок и тонкую кишку для разложения или метаболизма в толстой кишке. Поскольку пектин не деполимеризуется (не переваривается) кишечными ферментами у животных и людей частичная деградация, которая происходит в желудке и тонкой кишке, может быть вызвана физико-химическими условиями в этих органах (Но11о№ау ШО.,1983). Например, кишечные микроорганизмы имеют ферменты (например, пектат-лиаза, полигалактуроназа, пектинэстераза), которые перерезают длинную цепь пектина, что приводит к более коротким, более абсорбируемым олигомерам. Вместе с тем исследования на животных показали, что в содержимом толстой кишки и кала не было обнаружено или было обнаружено очень мало галактуронана в результате более или менее интенсивной ферментативной активности кишечных микроорганизмов (Оо^оуувк! О., 2002). Пектин сильно влияет на желудочно-кишечные ткани. Хорошо известно, что пектин может стимулировать пролиферацию кишечных клеток и активность ферментов пограничной мембраны (кишечных микроворсинок) (Рикипа§аТ., 2003).
В спорте высоких достижений и бытовом поддержании спортивной формы и здоровья существует множество нюансов, связанных с подбором индивидуального рациона питания, в том числе функциональных продуктов и напитков, призванных стимулировать решение тех или иных функциональных задач организма, а также существует ряд проблем, с которыми сталкиваются спортсмены при подготовке к турнирам и в штатном режиме тренировок, таких, как: обезвоживание, поддержание гликемического индекса, диспергируемое высвобождение активных веществ внутри желудочно-кишечного тракта, кишечные колики, метаболический синдром, расстройства желудочно-кишечного тракта.
При составлении комбинированного напитка для спортсменов в качестве основного компонента предложено рассмотреть пектин, изучить его свойства. До настоящего времени исследования взаимодействия пектина и монослоя культуры перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) не проводились или автору не известно о таковых. Основными параметрами при проведение исследования на живых клеточных культурах СПЭВ мы определили: выявление токсичности исследуемых веществ, выявление механизмов и степени воздействия на клеточные культуры исследуемых веществ, выявление ранее неизученных свойств исследуемых веществ.
Эксперимент проводился в два этапа, сначала оценивали токсичность, а также наличие/отсутствие влияния разных концентраций раствора пектина производства КНР на СПЭВ, затем производства Венгрии.
Этап 1. Исходный пектин в виде быстрорастворимого промышленного порошка производства КНР растворяли в физрастворе до 1 % концентрации и стерилизовали УФ-излучателем с длинной волны 290 нм в течение 6 мин. Посев 1 % раствора пектина на слабощелочной агар показал отсутствие роста микроорганизмов, то есть был стерильным. Далее из 1 % раствора пектина путём разведения стерильным физраствором были получены 0,10 и 0,01 % рабочие растворы пектина, использованные в работе.
Перевиваемая культура клеток СПЭВ в виде монослоя из одного флакона ёмкостью 250 мл была пересеяна с кратностью 1:4 на четыре аналогичных флакона 5.08.2019 г. Данная культура имеет высокий пролиферативный индекс, обеспечивающий образование на 4-й день в каждом флаконе плотного монослоя клеток (рис. 1), который и использовали в работе 9.08.2019 г.
Перед добавлением пектина все флаконы тщательно трёхкратно промывали раствором Хенкса для удаления остатков сыворотки КРС, необходимой для роста клеток. Далее в первый флакон добавляли 25 мл среды 199 и 2,5 мл 1 %-ного раствора пектина, восстанавливая таким образом первоначальный объём жидкости, в которой выросли клетки СПЭВ. Во второй флакон добавляли такое же количество среды 199 и 2,5 мл 0,1 %-ного раствора пектина. В третий флакон добавляли 25 мл среды 199 и 0,01 %-ный раствор пектина. В четвёртый контрольный флакон после промывки была добавлена только среда 199 без сыворотки и пектина. Эксперимент имел продолжительность 28 дней.
Этап 2. Изучали влияние раствора жидкого пектина «Пекто» (экстракт пектиновый яблочный) производства ВЕНГРИИ на монослой культуры перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).
Для эксперимента использовали перевиваемую культуру почки эмбриона свиньи, имеющую высокий пролиферативный индекс (при пересеве флакона емкостью 250 мл с кратностью 1:4 плотный монослой клеток образуется на 4-й день). Всего взято три флакона в опыт и один флакон контрольный. В четвёртый контрольный флакон после промывки была добавлена среда 199 с сывороткой и без пектина 11.11.2019 г. Исследовали концентрации пектина 1,0, 0,10, 0,01%. После трехкратного промывания клеток от сыворотки КРС во флаконы добавляли поддерживающую среду 199. В каждый флакон с культурой клеток добавляли раствор пектина: 2,5 мл 10 %, 2,5 мл 1 %, 0,25 мл 1 %, получая конечные концентрации пектина на культуре клеток 1,0, 0,10, 0,01 %. Срок контрольного наблюдения - 28 дней с визуальной и микроскопической регистрацией изменении цвета и прозрачности поддерживающей среды, целостности и характера монослоя, морфологии и размеров клеток, поверхности клеточной стенки и видимых внутриклеточных включений, характерных для интактной здоровой культуры, межклеточных границ, характера пролиферации и скорости роста на пограничных областях монослоя.
Рис. 1. Плотный монослой клеток Рис. 2. Плотный монослой клеток
СПЭВ. Этап 1 СПЭВ. Этап 2
На первом этапе наблюдения вели визуально и микроскопически в течение 4 недель, регистрируя изменения монослоя в целом и состояние клеток в частности. Первые 2 недели наблюдения показали, что количество клеток и их морфология во всех флаконах было примерно одинаковым. К концу третьей недели в контрольном флаконе стали появляться признаки деградации целостности клеточного монослоя (рис. 3). А во флаконах 1, 2 и 3 клетки ещё сохранялись в виде монослоя (рис. 4). Деградация в них стала появляться только к концу 4-й недели (рис. 5).
Рис. 3. Частичная деградация клеточной культуры контрольного образца. Этап 1
Рис. 4. Сохранность монослоя образцов 1,2,3. Этап 1
Рис. 5. Частичная деградация монослой образцов 1,2,3. Этап 1
На втором этапе на 16 день наблюдения отмечены изменения монослоя клеток в виде его уплотнения и легкого пожелтения среды во всех 4 группах. Начальная деградация целостности монослоя стала появляться в контрольном флаконе на 19-й день наблюдения. К этому сроку в испытуемых группах с концентрациями пектина 1,0, 0,1, 0,01 % сохранялся монослой клеток с ровными межклеточными границами, визуально гладкой поверхностью клеточной стенки, четко различимым ядром. Размеры клеток были уменьшены на 15-20 % в силу того, что при сохранившейся способности к делению клеток контактное торможение окружающего монослоя не дает клетке сохранить оптимальную величину. Типичные размеры молодых растущих клеток наблюдаются в пограничных областях монослоя. Поддерживающая среда -почти прозрачная, желто-розовая.
Изменения в испытуемых флаконах начали наблюдаться на 25-й день в группе клеток с концентрацией пектина 1 %. Появились редкие нарушения целостности монослоя размером в 1-2 мм. При этом разные концентрации пектина давали разную микроскопическую картину клеточного пласта. Более интенсивное пожелтение среды наблюдалось в концентрации 1 %, что свидетельствовало:
- о возможно более токсическом действие пектина в концентрации 1 %, чем в концентрации 0,10 и 0,01 %;
- о более высоком метаболизме клеток в присутствии данной концентрации пектина. При усиленном делении клеток, потреблении питательных веществ из раствора возрастает и происходит закисление среды, изменение цвета ее" индикатора -в данном случае изменение цвета с розового на желтый (рис. 6).
Рис. б. Изменение цвета в испытуемом флаконе с концентрацией пектина 1 % с розового на желтый. Этап 2
Пожелтение ростовой среды во флаконах с концентрациями пектина 0,10 и 0,01 % происходило не так интенсивно, цвет среды описывается как розово-желтый. Целостность монослоя не нарушена. Межклеточные границы плотные, поверхность клеток гладкая, размеры клеток соответствуют клеткам зрелого плотного монослоя. На границе монослоя - распластанные полигональные клетки, часть из которых делится. Характер роста монослоя, динамика его изменении□ позволяют предположить, что клетки не испытывают дефицита веществ на протяжении 1 пассажа. В течение срока наблюдения в условиях данного опыта раствор пектина определенно восполнил какую-то функцию отсутствующей сыворотки КРС: питательную, пластическую, метаболическую, регуляторную, стимулирующую или пр., возможно совокупность некоторых функции□. Изменения в контроле происходили стандартно соответственно культурам, находящимся в поддерживающей и в ростовой среде (рис. 7).
Рис. 7. Контрольный образец монослоя на 25-е сут. В центре заметны нарушения целостности. Этап 2
Изучение действия пектина «Пекто» в разных конечных концентрациях на клетки млекопитающих на модели культуры клеток СПЭВ в условиях наблюдения генераций клеток 1 пассажа получены следующие результаты.
1) Образцы пектина «Пекто», представленные для изучения, являются стерильными: ни один из исследуемых образцов не дал пророста в течение срока наблюдения 28 дней при температуре 36-37 °С.
2) Конечная концентрация пектина 0,10 и 0,01 % (в среде, растворе, субстрате и пр.) не оказывает острого и подострого токсического действия на растущие, делящиеся клетки млекопитающих - функции пролиферации клеточной культуры in vitro и скорость деления клеток на протяжении нескольких генераций клеток в пределах 1 пассажа (срок наблюдения 28 дней), оставалась неизмененной, сопоставимой с контролем.
3) Действие конечных концентраций пектина «Пекто» в условиях эксперимента на одном пассаже идентично с действием сыворотки крови, являющейся необходимым компонентом при выращивании клеток млекопитающих. Клетки пролифериро-вали, росли и сохраняли функции клеточного сообщества in vitro так же, как культура клеток в присутствии 10 % сыворотки КРС. В рамках эксперимента невозможно определить, какая из функций сыворотки была замещена в первую очередь, регуля-торная, стимулирующая, пластическая. Однако, учитывая результаты исследования, можно сделать вывод о некоторой стимулирующей, регуляторной и метаболической роли пектина или его фрагментов в клеточном обмене. Роль пектина в обмене веществ высших биологических отрядов, несмотря на его широкую распространенность, мало изучена. Есть работы, показывающие прямое участие пектинов в метаболизме, но в приложении к человеку биохимические трансформации пектина и их участие в регулировке клеточного обмена прискорбно малочисленны.
Результаты обоих этапов оказались сопоставимы и малоразличны. В описании результатов второго этапа приводится расширенная характеристика наблюдений эксперимента, которая также соответствует результатам наблюдения первого этапа.
Растворы продемонстрировали возможность замещения некоторых функций сыворотки, но определить, какая из функций была замещена в первую очередь ре-гуляторная, стимулирующая, пластическая в рамках данного эксперимента не являлось возможным.
Данные обоих экспериментов можно считать сопоставимыми, значимых различий в процессе проведения обоих экспериментов не выявлено. Полисахариды, включая пектин, являются широко распространенным классом биологических соединений, продуцируемых представителями растительного и животного мира. Как выяснилось, эти вещества обладают не только питательной ценностью и специфической физиологической активностью, но и влияют на отдельные системы организма в том числе и иммунную.
Данное исследование показало, что возможных областей применения исследуемых образцов пектина может быть очень много, как добавки для различных питательных субстанций (функциональные продукты питания), в фармакологии (лечебные и питательные крема и др. композиции), а также применение пектинов в период реабилитации больных, требующих очень облегчённую диету (после тяжёлых операций, например, на желудочно-кишечном тракте), в восстановительном периоде рациона питания для спортсменов высоких достижений.
Наличие в составе пектина простых Сахаров обусловило сохранность монослоя клеток более длительное время, чем в контроле. Такое возможно лишь в случае, когда клетки способны использовать эти простые сахара для своего непосредственного питания. Последний вывод имеет большое значение, особенно при использовании пектина для создания различных функциональных продуктов питания, в том числе спортивного назначения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dongowski G et al. The degree of methylation influences the degradation of pectin in the intestinal tract of rats and in vitro. J Nutr. 2002.
2. Fukunaga T et al. Effects of the soluble fibre pectin on intestinal cell proliferation, fecal short chain fatty acid production and microbial population. Digestion. 2003.
REFERENCES
1. Dongowski G et al. The degree of methylation influences the degradation of pectin in the intestinal tract of rats and in vitro. J Nutr. 2002.
2. Fukunaga T et al. Effects of the soluble fibre pectin on intestinal cell proliferation, fecal short chain fatty acid production and microbial population. Digestion. 2003.
