CC BY
24
Для корреспонденции
Марков Павел Александрович - кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ РК» Минздрава России
Адрес: 121099, Российская Федерация, г. Москва,
ул. Новый Арбат, д. 32
Телефон: (985) 979-94-22
E-mail: p.a.markov@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-4803-4803
Марков П.А.1, Волкова М.В.2, Хасаншина З.Р.2, Мартинсон Е.А.2, Попов С.В.3
Противовоспалительное действие высоко-и низкометилэтерифицированных яблочных пектинов in vivo и in vitro
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 121099, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Вятский государственный университет», 610000, г. Киров, Российская Федерация
3 Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Коми научный центр Уральского отделения Российской академии наук», 167982, Республика Коми, г. Сыктывкар, Российская Федерация
1 National Medical Research Centre for Rehabilitation and Balneology' of the Ministry of Health of Russian Federation, 121099, Moscow, Russian Federation
2 Vyatka State University, 610000, Kirov, Russian Federation
3 Institute of Physiology of Komi Science Centre of The Urals Branch of the Russian Academy of Sciences, 167982, Syktyvkar, Russian Federation
Один из механизмов противовоспалительного действия пектинов обусловлен ингибированием чрезмерной провоспалительной активности макрофагов - клеток, регулирующих интенсивность воспаления и процессы репаративной регенерации. Показано, что таким действием обладают пектины с низкой степенью метилэтерификации карбоксильных групп галактуронановой цепи макромолекулы. Кроме лейкоцитов, в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника участвуют клетки эпителия кишечника. Однако к настоящему времени работ, посвященных исследованию влияния метилэтерификации пектинов на воспалительный ответ клеток эпителия кишечника, проведено недостаточно.
Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Марков П.А., Волкова М.В., Хасаншина З.Р., Мартинсон Е.А., Попов С.В. Противовоспалительное действие высоко-и низкометилэтерифицированных яблочных пектинов in vivo и in vitro // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 6. С. 92-100. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-92-100
Статья поступила в редакцию 02.07.2021. Принята в печать 26.10.2021.
Funding. The work was carried out at the expense of subsidies for the implementation of a state task Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For citation: Markov P.A., Volkova M.V., Khasanshina Z.R., Martinson E.A., Popov S.V. Anti-inflammatory activity of high and low methoxylated apple pectins, in vivo and in vitro. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (6): 92-100. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-92-100 (in Russian)
Received 02.07.2021. Accepted 26.10.2021.
Anti-inflammatory activity of high and low methoxylated apple pectins, in vivo and in vitro
Markov P.A.1, Volkova M.V.2, Khasanshina Z.R.2, Martinson E.A.2, Popov S.V.3
Цель исследования - оценить влияние степени метилэтерификации пектинов на воспаление стенки кишки у мышей при пероральном введении и на воспалительный ответ клеток эпителия толстой кишки человека линии Сасо-2 в условиях in vitro.
Материал и методы. В проспективном исследовании использовали 40 самцов мышей BALB/c с массой тела 20-25 г, по 10 животных в каждой группе. Растворы яблочных пектинов (200 мг/0,2 мл) вводили мышам перорально через пластиковый катетер за 24 ч до индукции колита, мыши контрольной группы получали воду, в качестве положительного контроля использовали преднизолон в дозе 5 мг/кг массы тела. Воспаление толстой кишки у мышей вызывали разовым ректальным введением 5% уксусной кислоты (0,1 мл). Через сутки оценивали степень и площадь поражения с помощью светового микроскопа, активность миелопероксидазы в стенке толстой кишки спектрофотометрически. С использованием клеток Сасо-2 оценивали влияние пектинов на метаболическую активность, межклеточную проницаемость, генерацию фактора некроза опухоли а и активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в клетках.
Результаты. Установлено, что при пероральном введении низкометилэтерифицированный пектин AU701, имеющий в своем составе более 70% свободных карбоксильных групп, ингибирует развитие кишечного воспаления у мышей. Высокометилэтерифицированный пектин AU201, у которого более 70% карбоксильных групп замещены метиловым эфиром, не влияет на воспаление стенки толстой кишки. Выявлено, что предварительная обработка клеток Caco-2 пектинами AU701 и AU201 предотвращает индуцированное липополисахаридом увеличение межклеточной проницаемости и снижает провоспалительный ответ клеток налипополисахарид. Выявлено, что после инкубации клеток Caco-2 с пектином AU701 скорость гидролиза р-нитрофенилфосфата, субстрата ЩФ, увеличилась на 40%, активность ЩФ в клетках не изменяется после их инкубации с пектином AU201.
Заключение. Установлено, что низкометилэтерифицированный пектин AU701 ингибирует воспаление как в условиях in vivo, так и in vitro. Высокометилэтерифицированный пектин AU201 подавляет провоспалительные реакции только в условиях in vitro. Способность пектинов ингибировать кишечное воспаление имеет многофакторную природу и может быть обусловлена в том числе их способностью стимулировать экспрессию ЩФ клетками кишки.
Ключевые слова: пектин, метилэтерификация, воспаление, толстая кишка, Caco-2, щелочная фосфатаза, фактор некроза опухоли а, липополисахариды, межклеточная проницаемость
One of the possible mechanisms of the anti-inflammatory action of pectins is associated with the inhibition of excessive pro-inflammatory activity of macrophages - the cells that regulate inflammation intensity and reparative regeneration. It has been found that pectins with a low degree of methyl esterification of the carboxyl groups of the galacturonan core of the macromolecule exhibit this effect. In addition to leukocytes, intestinal epithelial cells are also involved in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases. However, to date, there have been insufficient studies of the effect of pectin methyl esterification on the inflammatory response of enterocytes. The aim of the research was to evaluate the effect of the degree of pectin methyl esterification on inflammation of the colon in mice after oral administration and on the inflammatory response of human colon epithelium cells of the Caco-2 line in vitro. Material and methods. In a prospective study, 40 male BALB/c mice weighing 20-25 g were used, 10 animals in each group. Solutions of apple pectins (200 mg/0.2 ml) were orally administered to mice through a plastic catheter 24 h before the induction of colitis. The control mice received water, and prednisone administration at a dose of 5 mg/kg of body weight was used as a positive control. Colon inflammation in mice was induced by a single rectal administration of 5% acetic acid (0.1 ml). A day later, the degree and area of the lesion was assessed using a light microscope, the activity of myeloperoxidase in the wall of the colon was determined by spectrophotometry. The effect of pectins on metabolic activity, intercellular permeability, Tumor Necrosis Factor a generation and alkaline phosphatase (ALP) activity in Caco-2 cells was assessed.
Results. It was found that low-methyl esterified pectin AU701, which contains more than 70% of free carboxyl groups, inhibited colon inflammation in mice. High methyletherified pectin AU201, in which more than 70% of the carboxyl groups are replaced by methyl ester, didn't affect inflammation. It was revealed that pretreatment of Caco-2 cells with AU701 and AU201 pectins prevented lipopolysaccharide-induced increase in intercellular permeability and reduced the pro-inflammatory response of Caco-2 cells to LPS. After incubation of Caco-2 cells with AU701 pectin, the rate of hydrolysis of p-nitrophenylphosphate (an alkaline phosphate substrate) increased by 40%. Pectin AU201 had no effect on the alkaline phosphatase activity of enterocytes.
Conclusion. Thus, it was found that low-methyl esterified pectin AU701 inhibits inflammation both in vivo and in vitro. High-methyl esterified pectin AU201 suppresses pro-inflammatory reactions only in vitro. The ability of pectins to inhibit intestinal inflammation has a multifactorial nature, and is due, inter alia, to their ability to stimulate the expression of alkaline phosphatase by enterocytes. Keywords:pectin, methyl esterification, inflammation, colon, Caco-2, alkaline phosphatase, tumor necrose factor-alpha, lipopolysaccharide, intercellular permeability
Пектиновые вещества (пектины) входят в большую группу гликаногалактуронанов, кислых растительных полисахаридов, главную углеводную цепь которых составляют 1,4-связанные остатки а-О-галактуроновой кислоты [1]. Хорошо известно, что включение пектинов в рацион питания человека и экспериментальных животных снижает риск возникновения воспалительных заболеваний кишечника [2-4].
Молекулярно-клеточные основы противовоспалительного действия пектинов еще не изучены. Один из
механизмов такого их воздействия предполагает, что, попадая в полость кишечника, пектины влияют на функциональную активность макрофагов - клеток, регулирующих интенсивность воспаления и процессы репара-тивной регенерации тканей. Например, в экспериментах in vitro показано, что пектины, выделенные из корневища кустарника Смилакс (Smilax), листьев очитка древовидного (Sedum dendroideum) и плодов зеленого сладкого перца (Capsicum annuum), ингибируют высвобождение провоспалительных медиаторов [интерлейкин-1р
(ИЛ-Iß), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли а (ФНОа), окись азота (NO)] макрофагами в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС). Установлено, что такое действие обусловлено ингибированием пектинами взаимодействия ЛПС с Toll-подобными рецепторами (Toll-like receptor, TLR) макрофагов [5-8].
Показано, что противовоспалительное действие оказывают пектины с низкой степенью метилэтерификации карбоксильных групп галактуронановой цепи. Увеличение степени метилирования пектинов вызывает снижение их противовоспалительной активности. Влияние степени метилэтерификации на противовоспалительное действие пектинов показано как в условиях in vivo, на модели индуцированного воспаления толстой кишки экспериментальных животных [9, 10], так и in vitro, с использованием культур клеток, главным образом макрофагов линии моноцитарных клеток человека, полученной от пациента с острым моноцитарным лейкозом (THP-1), и макрофагоподобной клеточной линии, полученной от мышей BALB/c (RAW264.7) [6, 11, 12].
Известно, что, кроме лейкоцитов, в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника участвуют клетки эпителия кишечника. Однако к настоящему времени работ, посвященных исследованию влияния метилэ-терификации пектинов на воспалительный ответ эн-тероцитов, проведено недостаточно. Кроме того, следует отметить, не всегда структурные элементы пектинов, обусловливающие их биологическую активность в условиях in vitro, будут иметь значение для реализации противовоспалительного потенциала пектинов в условиях in vivo.
Цель исследования - оценить влияние степени метилэтерификации пектинов на воспаление стенки кишки у мышей при пероральном введении и на воспалительный ответ клеток колоректальной аденокарциномы человека линии Сасо-2 в условиях in vitro.
Материал и методы
В работе были использованы яблочные пектины с низкой (AU701) и высокой (AU201) степенью метилэтерификации (Herbstreith & Fox KG, Германия), химический состав которых был охарактеризован ранее [13]. Клетки аденокарциномы толстой кишки человека, линия Сасо-2, предоставлены ФГБУН Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург).
Эксперимент in vivo. В проспективном исследовании использовали 40 самцов мышей BALB/c с массой тела 20-25 г (по 10 животных в каждой группе). Животных содержали в пластиковых клетках по 10 особей и имели свободный доступ к пище и питьевой воде. Животные были получены из питомника экспериментальных животных Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Животных включали в исследование после 14-дневного карантина. В комнате содержания поддерживали постоянную температуру 25±2 °С и влажность воздуха 55%. Животных содержали при 12-часовом световом
периоде (8:00-20:00). Животные получали стандартную диету AIN-93M, с энергетической ценностью 3,3 ккал/г, состоящую из белка (14,6%), жира (2,8%), углеводов (59%) и пищевых волокон (5%) [14]. Исследование было одобрено комитетом по биоэтике при ИФ ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Все экспериментальные процедуры проводили с 9:00 до 14:00.
Растворы пектинов (200 мг/0,2 см3) вводили мышам перорально через пластиковый катетер за 24 ч до индукции колита. Мыши контрольной группы получали воду. В качестве положительного контроля использовали преднизолон в дозе 5 мг/кг массы тела. Воспаление толстой кишки у мышей вызывали разовым ректальным введением 0,1 см3 5% уксусной кислоты, которую вводили через мягкий пластиковый катетер [15]. Через сутки после индукции воспаления животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации, после чего извлекали толстый кишечник, промывали и освобождали его от содержимого. С помощью светового микроскопа определяли степень и площадь поражения стенки кишки. Степень поражения выражали в баллах. Площадь поражения выражали в процентах от общей площади фрагмента кишки [16].
Интенсивность инфильтрации стенки толстой кишки нейтрофилами оценивали по активности миелоперокси-дазы (МПО). Показано, что в данной модели воспаления активность МПО в стенке кишки прямо пропорциональна числу гранулоцитов в ткани кишечника [17]. Активность МПО определяли спектрофотометрически с использованием орто-фенилендиамина [18], рассчитывали, используя калибровочный график, построенный для перокси-дазы хрена, и выражали в ед/мг сырой ткани.
Противовоспалительный потенциал пектинов оценивали по интенсивности воспаления (ИВ). Для расчета данного интегрального показателя использовали 3 составляющие: активность МПО в стенке толстой кишки, степень и площадь повреждения стенки кишки. За 100% принимали ИВ в стенке кишки после ректального введения уксусной кислоты животным контрольной группы.
Эксперимент in vitro
Оценка метаболической активности клеток Са^-2.
Для оценки цитотоксического действия пектинов использовали клетки линии СаСо-2. Клетки высевали в 96-луночный планшет в плотности 10 тыс./шт. на лунку и инкубировали в питательной среде [среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (ДМЕМ) («Биолот», РФ), 10% фетальная бычья сыворотка (ФБС) («HyClone», США)] в течение 24 ч при стандартных условиях (37 °С, 5% СО2). Затем питательную среду заменяли на среду, содержащую пектины в концентрациях от 0,5 до 5 мг/см3. Клетки с пектинами инкубировали сутки при стандартных условиях. Через сутки раствор сливали и в лунки вносили 100 мкл среды ДМЕМ, содержащей 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид («ПанЭко», РФ) в концентрации 5 мг/см3. Инкубировали в стандартных условиях 4 ч, после чего раствор заменяли на 10% раствор додецилсульфата натрия, со-
держащего 0,01 М HCl, затем планшеты инкубировали в течение ночи. Оптическую плотность раствора измеряли при 530 нм с использованием планшетного спектрофотометра Power Wave-200 (BioTek Instruments, США) [19].
Оценка образования фактора некроза опухоли а и проницаемости монослоя клеток Сасо-2. Клетки Сасо-2 высевали с плотностью 100 тыс. на полиэтилен-терефталатную мембранную вставку для 12-луночного планшета с диаметром пор 1 мкм (Jet Biofil, Китай). Клетки инкубировали при стандартных условиях в питательной среде (ДМЕМ, 10% ФБС). После достижения плотности монослоя 100%, питательную среду заменяли на среду ДМЕМ, содержащую пектины в конечной концентрации 1 мг/см3. Через сутки среду с пектинами заменяли на свежую и добавляли липополисахарид E. coli 0111:B4 (ЛПС; Sigma, США) в конечной концентрации 1 мкг/см3. Через сутки часть среды извлекали для оценки количества ФНОа. Затем с апикальной стороны лунки вносили 100 мкм3 трипанового синего. Через 1, 3, 6 и 24 ч инкубации с базолатеральной стороны лунки среду извлекали и с использованием спектрофотометра Power Wave-200 измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 585 нм. Концентрацию ФНОа в пробах определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа («Протеиновый контур», РФ).
Определение активности щелочной фосфатазы в клетках Сасо-2. Клетки Сасо-2 высевали в 12-лу-ночный планшет в плотности 100 тыс./шт. в лунке и инкубировали при стандартных условиях в течение суток. Затем к адгезированным клеткам добавляли пектины, растворенные в ДМЕМ, в конечной концентрации 1 мг/см3. Клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 1, 2, 3 и 14 сут. Через каждые 48 ч среду с пектинами заменяли на свежую. По завершении периода инкубации в лунки добавляли детергент [12 мМ Трис-HCl рН 7,2, содержащий 1% Тритон Х-100 и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид PMSF (Sigma, США)] и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Удельную активность ЩФ измеряли согласно протоколу производителя набора («Ольвекс диагности-кум», РФ). Содержание белка определяли по методу Лоури.
1 см
Рис. 1. Фото фрагментов толстой кишки у мышей до индукции язвенного колита (А) и через 24 ч после ректального введения уксусной кислоты (Б-Д). За 1 сут до индукции воспаления животные получали воду (Б), преднизолон (В), пектин AU701 (Г) или пектин AU201 (Д)
Fig. 1. Photo of fragments of the mice colon before (A) and 24 hours after rectal administration of acetic acid (B-E). Mice were treated one day previously with water (B), prednisolone (C), pectin AU701 (D) or pectin AU201 (E)
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Статистическую значимость различий оценивали по U-критерию Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
В работе были использованы пектины, различающиеся степенью метилэтерификации карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты. Противовоспалительный потенциал пектинов оценивали по ИВ.
Ректальное введение уксусной кислоты мышам вызывало повреждение стенки толстой кишки, первые признаки которого появлялись уже в течение первого часа после индукции воспаления. В течение последующих 24 ч воспаление в стенке кишки приобретало более тяжелый характер, слизистая слущивалась, образовывались язвы, кровотечения (рис. 1).
Рис. 2. Интенсивность воспаления стенки толстой кишки у мышей через сутки после ректального введения уксусной кислоты (М±а, n=10). За 1 сут до индукции язвенного колита мыши получили воду (iUC), преднизолон (ПН), пектин яблочный AU701 или AU201
* - статистически значимое (p<0,05) отличие по сравнению с группой контроля (iUC).
Fig. 2. Intensity of inflammation of the colon wall in mice one day after rectal administration of acetic acid (M±o, n=10). The day before the induction of ulcerative colitis, peroral pretreatment of mice with water (iUC), prednisolone (PN), AU701 or AU201 apple pectin
* - statistically significant (p<0.05) difference compared to the control group (iUC).
120 n
<= 100
.o
о
t-S
80 60 4020-
iUC
ПН / PN AU701 AU201
*
1
0
s ^
Çj
g."
il §i
120-1 10080604020-
Контроль Control
rti
0,5
AU701, мг/мл AU701, mg/ml
0,5
AU201, мг/мл AU201, mg/ml
Рис. 3. Метаболическая активность клеток Сасо-2 через 1 сут соинкубации с растворами пектинов (Ы±а, п=7). Данные выражены в % к контролю
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от контроля; Аи701 - высоко-, ЛЦ201 - низкометилэтерифицированный яблочный пектин.
Fig. 3. Metabolic activity of Caco-2 cells after a day of co-incubation with pectin solutions (M±a, n=7). Data are expressed as % of control
* - statistically significant (p<0.05) difference from control; AU701 -high-, AU201 - low-methyl etherifiedapple pectin in concentration from 0.5 to 5 mg/ml.
■
*
1
5
5
Установлено, что противовоспалительное действие пектинов зависит от степени метилэтерификации карбоксильных остатков галактуроновой кислоты. Низ-кометилэтерифицированный яблочный пектин AU701, имеющий в своем составе более 70% свободных карбоксильных групп, ингибировал развитие кишечного воспаления у мышей. Высокометилэтерифицированный пектин AU201, у которого более 70% карбоксильных групп замещены метиловым эфиром, не влиял на ИВ (рис. 2).
Ранее сообщалось, что цитрусовый пектин CU701, обладающий низкой степенью метилэтерификации кар-
боксильных групп, оказывает противовоспалительное действие [4, 9]. Результаты проведенной работы согласуются с данными литературы и указывают на то, что противовоспалительная активность пектинов определяется структурными особенностями строения пектиновых макромолекул и не зависит от источника выделения пектинов.
На следующем этапе исследования было оценено влияние этерификации пектинов на барьерные свойства эпителиальных клеток кишечника человека линии Сасо-2 и синтез ими ФНОа в ответ на ЛПС. С целью выявления концентраций пектинов, совместимых
А/А
Б/B
1 6 24
Продолжительность, ч Duration, h
ЛПС / LPS -о- Контроль / Control
1,0-1
о £
S3 о с
» ю со
i: *
n o
е0,8-
0,6-
5 0,4-
он m
■ S
съ g
a, б
Контроль AU701 AU201 Control
□ ФБР / PBS ИЛПС / LPS
Рис. 4. Проницаемость клеточного монослоя клеток Сасо-2 для трипанового синего после внесения в среду ЛПС (А); влияние пектинов на ЛПС-индуцированную проницаемость монослоя клеток (Б) (Ы±о, п=7)
Статистически значимое (р<0,05) отличие: * - по сравнению с предыдущей точкой измерения; а - по сравнению с контролем; б - по сравнению с АЦ201. Здесь и на рис. 5: ФБР - фосфатно-буферный раствор; ЛПС - липополисахарид; АЦ1701 - высоко-, АЦ201 - низкометилэтерифицированный яблочный пектин.
a
Fig. 4. Permeability of the Caco-2 cell monolayer for trypan blue after adding LPS to the medium (A); effect of pectins on LPS-induced permeability of a cell monolayer (B) (M±o, n=7)
Statistically significant (p<0.05) difference: * - compared with the previous measurement point; a - compared with the control; 6 - compared with AU201. Here and in Fig. 5: LPS - lipopolysaccharide; PBS - phosphate buffered saline, control; AU701 - high-, AU201 - low-methyl etherified apple pectin.
Рис. 5. Влияние пектинов на генерацию клетками Сасо-2 фактора некроза опухоли а (ФНОа) до и после внесения липополисахари-да в культуральную среду (M±a, n=7)
* - статистически значимое (p<0,05) отличие от контроля.
Fig. 5. Effect of pectins on the generation of tumor necrosis factor а (TNF-а) by Caco-2 cells before and after the introduction of lipopoly-saccharide into the culture medium (M±a, n=7)
* - statistically significant (p<0.05) difference from control.
250 -,
200-
Ре
t ¡а i= 150-
s s
100-
efc
50-
0-
Контроль AU701 Control
AU201
Контроль AU701 Control
AU201
ФБР / PBS
ЛПС/LPS
■
■
с жизнедеятельностью клеток, проведена оценка влияния пектинов на метаболическую активность клеток. Установлено, что в концентрации до 1 мг/см3 пектины не влияли на метаболическую активность клеток. С увеличением концентрации пектина жизнеспособность клеток снижалась (рис. 3). Концентрация полумаксимального ингибирования пектинами метаболической активности клеток Сасо-2 составила 5,4±0,3 мг/см3 и не зависела от типа пектина. Таким образом, на основе полученных результатов для дальнейших исследований использовали концентрацию пектинов 1 мг/см3.
В мировой практике при исследовании противовоспалительной активности веществ в качестве индуктора воспаления чаще всего используют ЛПС. Действие ЛПС на функциональное состояние клеток опосредуется через рецепторы ^Я-семейства. Связываясь с на поверхности энтероцитов, ЛПС вызывает каскад функциональных реакций, таких как увеличение межклеточной проницаемости [20-22] и синтез ФНОа, цитокина острой фазы воспаления [23, 24].
Установлено, что через 1 ч после внесения ЛПС проницаемость монослоя клеток Сасо-2 увеличивалась более чем в 4 раза. Повышенная межклеточная проницаемость сохранялась на всем протяжении периода наблюдения (рис. 4А). Предварительная обработка клеток Сасо-2 пектинами А11701 и А11201 предотвращала ЛПС-индуцированное увеличение межклеточной проницаемости соответственно на 44±8 и 25±5% (рис. 4Б). Инкубация пектинов с клетками Сасо-2 не вызывала изменений в межклеточной проницаемости (см. рис. 4Б).
Через 1 сут после внесения ЛПС к клеткам Сасо-2 концентрация ФНОа в культуральной среде увеличивалась более чем в 3 раза. Предварительная обработка клеток пектином А11701 снижала их ответ на ЛПС почти в 2 раза, в то время как обработка А11201 только на 30% (рис. 5).
Ранее было показано, что действие пектинов на ЛПС-стимулированный воспалительный ответ может быть обусловлено блокированием взаимодействия ЛПС с его рецептором [3]. Однако, по сообщениям ряда авторов, в качестве дополнительного противовоспалительного фактора также может выступать и ЩФ, локализованная на щеточной кайме энтероцитов. Известно, что ЩФ способна гидролизовать ЛПС и снижать тем самым его провоспалительный потенциал [25, 26].
Результаты проведенных нами экспериментов по характеристике влияния этерификации пектинов на активность ЩФ клеток Сасо-2 показали, что пектин А11701 увеличивал удельную активность ЩФ. После инкубации клеток с пектином А11701 скорость гидролиза р-нитрофенилфосфата, субстрата ЩФ, увеличилась на 40%. Пектин А11201 не оказывал влияние на активность ЩФ энтероцитов человека (рис. 6). Следует отметить, что пектин А11701 оказывает влияние на активность ЩФ только в первые 48 ч совместной инкубации.
Таким образом, установлено, что низкометилэтерифи-цированный яблочный пектин защищает стенку толстой кишки от кислотно-индуцированного повреждения. Противовоспалительное действие пектинов реализуется не только через изменение функциональной активности лейкоцитов, как было показано ранее, но и через повышение устойчивости эпителиального барьера клеток кишки к повреждающим факторам.
,250 200
* is 150
I- ^
Щ 100
ш О
1 f 50
-5
15 А
rfl
Hh
ril
Г"1~|
■
0 12 3
□ Контроль / Control ■ AU701 ■ AU201
14 Дни Days
Рис. 6. Влияние пектинов на активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в клетках Сасо-2 (M±a, n=7). Данные выражены в % к контролю в день измерения
* - статистически значимое (p<0,05) отличие от контроля.
Fig. 6. Effect of pectins on alkaline phosphatase activity in Caco-2 cells (M±a, n=7). Data are expressed as % of control
* - statistically significant (p<0.05) difference from control.
Заключение
В проведенном исследовании выявлено, что низкоме-тилэтерифицированный яблочный пектин AU701 инги-бирует воспаление как в условиях in vivo, так и in vitro. Высокометилэтерифицированный пектин AU201 подавляет провоспалительные реакции только в условиях in vitro. Полученные результаты указывают на то, что при пероральном поступлении пектинов в организм степень
метилэтерификации карбоксильных остатков галакту-роновой кислоты, при прочих равных структурных характеристиках пектинов, имеет решающее значение для их проявления противовоспалительного действия. Способность пектинов ингибировать кишечное воспаление имеет многофакторную природу и может быть обусловлено в том числе их способностью усиливать барьерную функцию клеток эпителия и стимулировать экспрессию щелочной фосфатазы клетками кишечника.
Сведения об авторах
Марков Павел Александрович (Pavel A. Markov) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела биомедицинских технологий ФГБУ «НМИЦ РК» Минздрава России (Москва, Российская Федерация) E-mail: p.a.markov@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-4803-4803
Волкова Марина Викторовна (Marina V. Volkova) - младший научный сотрудник кафедры биотехнологии Института биологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Вятский государственный университет» (Киров, Российская Федерация) E-mail: biotech.volkova@list.ru https://orcid.org/0000-0001-5966-3026
Хасаншина Зухра Рамилевна (Zukhra R. Khasanshina) - младший научный сотрудник кафедрой биотехнологии, директор Института биологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Вятский государственный университет» (Киров, Российская Федерация) E-mail: hasanchinazr@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-0065-1853
Мартинсон Екатерина Александровна (Ekaterina A. Martinson) - кандидат технологических наук, заведующий кафедрой биотехнологии, директор Института биологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Вятский государственный университет» (Киров, Российская Федерация) E-mail: martinson@vyatsu.ru https://orcid.org/0000-0002-0364-4106
Попов Сергей Владимирович (Sergey V. Popov) - доктор биологических наук, доцент, заведующий Отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, Российская Федерация) E-mail: s.v.popov@inbox.ru https://orcid.org/0000-0003-1763-8898
Литература
Ovodon Yu.S. Current views on pectin substances // Bioorg. Chem. 2009. Vol. 35, N 3. P. 269-284. DOI: https://doi.org/10.1134/ S1068162009030017
Popov S.V., Ovodova R., Golovchenko V.V., Khramova D.S., Markov P.A., Smirnov V.V. et al. Pectic polysaccharides of the fresh plum Prunus domestica L. isolated with a simulated gastric fluid and their anti-inflammatory and antioxidant activities // Food Chem. 2014. Vol. 143, N 15. P. 106-113. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2013.07.049
Tan H., Nie S. Deciphering diet-gut microbiota-host interplay: Investigations of pectin // Trends Food Sci. Technol. 2020. Vol. 106, N 12. P. 171-181. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.tifs.2020.10.010 Elshahed M.S., Miron A., Aprotosoaie A.C., Farag M.A. Pectin in diet: Interactions with the human microbiome, role in gut homeo-stasis, and nutrient-drug interactions // Carbohydr. Polym. 2021. Vol. 255, N 12. Article ID 117388. DOI: https://doi.org/10.1016/j. carbpol.2020.117388
de Oliveira A.F., do Nascimento G.E., Iacomini M. Cor-deiro L.M.C., Cipriani T.R. Chemical structure and anti-inflammatory effect of polysaccharides obtained from infusion of Sedum dendroideum leaves // Int. J. Biol. Macromol. 2017. Vol. 105, N 1. P. 940-946. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.07.122 Zhang Y., Pan X., Ran S., Wang K. Purification, structural elucidation and anti-inflammatory activity in vitro of polysaccharides
10.
11.
from Smilax china L. // Int. J. Biol. Macromol. 2019. Vol. 139, N 15. P. 233-243. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.07.209 do Nascimento G.E., Winnischofer S.M.B., Ramirez M.I., Iacomini M., Cordeiro L.M.C. The influence of sweet pepper pectin structural characteristics on cytokine secretion by THP-1 macrophages // Food Res. Int. 2017. Vol. 102, N 1. P. 588-594. DOI: https://doi.org/10.1016Zi.foodres.2017.09.037 Sahasrabudhe N.M., Beukema M., Tian L., Troost B., Scholte J., Bruininx E. et al. Dietary fiber pectin directly blocks toll-like receptor 2-1 and prevents doxorubicin-induced ileitis // Front. Immunol. 2018. Vol. 9, N 3. P. 383-391. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2018.00383
Popov S.V., Markov P.A., Popova G.Yu., Nikitina I.R., Efimova L., Ovodov Yu.S. Anti-inflammatory activity of low and high methoxylated citrus pectins // Biomed. Prev. Nutr. 2013. Vol. 3, N 1. P. 59-63. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bionut.2012.10.008 Sabater C., Molina-Tij eras J. A., Vezza T., Corzo N., Montilla A., Utrilla P. Intestinal anti-inflammatory effects of artichoke pectin and modified pectin fractions in the dextran sulfate sodium model of mice colitis. Artificial neural network modelling of inflammatory markers // Food Funct. 2019. Vol. 10, N 12. P. 7793-7805. DOI: https://doi.org/10.1039/c9fo02221j
Chen L., Liu J., Zhang Y., Dai B., An Y., Yu L.L. Structural, thermal, and anti-inflammatory properties of a novel pectic
1.
7.
2.
8.
4
9
5
6.
polysaccharide from alfalfa (Medicago sativa L.) stem // J. Agric. Food Chem. 2015. Vol. 63, N 12. P. 3219-3228. DOI: https://doi. org/10.1021 / acs.jafc.5b00494
12. Tamiello C.S., do Nascimento G.E, Iacomini M., Cordeiro L.M. Arabinogalactan from edible jambo fruit induces different responses on cytokine secretion by THP-1 macrophages in the absence and presence of proinflammatory stimulus // Int. J. Biol. Macro-mol. 2018. Vol. 107, N 3. P. 35-41. DOI: https://doi.org/10.1016/). ijbiomac.2017.08.148
13. Vityazev F.V., Khramova D.S., Saveliev N.Y., Ipatova E.A., Bur-kov A.A., Beloserov V.S. et al. Pectin-glycerol gel beads: preparation, characterization and swelling behaviour // Carbohydr. Polym. 2020. Vol. 238, N 15. P. 238-246. DOI: https://doi.org/10.1016/). carbpol.2020.116166
14. Reeves P.G. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76A diet // J. Nutr. 1997. Vol. 127, N 5. P. 838S-841S. DOI: https://doi.org/10.1093/jn/127.5.838S
15. Itoh H., Kataoka H., Tomita M., Hamasuna R., Nawa Y., Kita-mura N. et al. Upregulation of HGF activator inhibitor type 1 but not type 2 along with regeneration of intestinal mucosa // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2000. Vol. 278, N 4. P. G635-G643. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpgi.2000.278AG635
16. Mahgoub A.A., El-Medany A.A., Hager H.H., Mustafa A.A., El-Sabah D.M. Evaluating the prophylactic potential of zaflrlukast against the toxic effects of acetic acid on the rat colon // Toxicol. Lett. 2003. Vol. 145, N 1. P. 79-87. DOI: https://doi.org/10.1016/ s0378-4274(03)00269-8.
17. Krawisz J.E., Sharon P., Stenson W.F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models // Gastroenterol-ogy. 1984. Vol. 87, N 1. P. 1344-1350. PMID: 6092199.
18. Пинегин Б.В., Бутаков А.А., Челкина Т.Л. Экологическая иммунология. Комплекс методов для определения функциональной активности фагоцитов. Москва : ВНИРО, 1995. 264 с.
19. Kumar P., Nagarajan A., Uchil P. Analysis of cell viability by the MTT assay // Cold Spring Harb. Protoc. 2018. Vol. 1, N 6. P. 216-228. DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505
20. Wu X.X., Huang X.L., Chen R.R., Li T., Ye H.J., Xie W. et al. Paeoniflorin prevents intestinal barrier disruption and inhibits lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in Caco-2 cell monolayers // Inflammation. 2019. Vol. 42, N 6. P. 2215-2225. DOI: https://doi.org/10.1007/s10753-019-01085-z
21. Chen G., Ran X., Li B., Li Y., He D., Huang B. et al. Sodium butyr-ate inhibits inflammation and maintains epithelium barrier integrity in a TNBS-induced inflammatory bowel disease mice model // EBioMedicine. 2018. Vol. 30, N 12. P. 317-325. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2018.03.030
22. Teixeira T.F., Souza N.C., Chiarello P.G., Franceschini S.C., Bressan J., Ferreira C.L. et al. Intestinal permeability parameters in obese patients are correlated with metabolic syndrome risk factors // Clin. Nutr. 2012. Vol. 31, N 5. P. 735-740. DOI: https://doi. org/10.1016/j.clnu.2012.02.009
23. Stephens M., von der Weid P.Y. Lipopolysaccharides modulate intestinal epithelial permeability and inflammation in a species-specific manner // Gut Microbes. 2020. Vol. 3, N 11. P. 421-432. DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2019.1629235
24. Billmeier U., Dieterich W., Neurath M.F., Atreya R. Molecular mechanism of action of anti-tumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases // World J. Gastroenterol. 2016. Vol. 22, N 42. P. 9300-9313. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v22.i42.9300
25. Singh S.B., Carroll-Portillo A., Coffman C., Ritz N.L., Lin H.C. Intestinal alkaline phosphatase exerts anti-inflammatory effects against lipopolysaccharide by inducing autophagy // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, N 1. P. 3107. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-59474-6
26. Liu W., Hu D., Huo H., Zhang W., Adiliaghdam F., Morrison S. et al. Intestinal alkaline phosphatase regulates tight junction protein levels // J. Am. Coll. Surg. 2016. Vol. 222, N 6. P. 1009-1017. DOI: https://doi.org/10.1016/jjamcollsurg.2015.12.006
References
1. Ovodon Yu.S. Current views on pectin substances. Bioorg Chem. 2009; 35 (3): 269-84. DOI: https://doi.org/10.1134/S1068 162009030017
2. Popov S.V., Ovodova R., Golovchenko V.V., Khramova D.S., Markov P. A., Smirnov V.V., et al. Pectic polysaccharides of the fresh plum Prunus domestica L. isolated with a simulated gastric fluid and their anti-inflammatory and antioxidant activities. Food Chem. 2014; 143 (15): 106-13. DOI: https://doi.org/10.1016/j.food-chem.2013.07.049
3. Tan H., Nie S. Deciphering diet-gut microbiota-host interplay: Investigations of pectin. Trends Food Sci Technol. 2020; 106 (12): 171-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2020.10.010
4. Elshahed M.S., Miron A., Aprotosoaie A.C., Farag M.A. Pectin in diet: Interactions with the human microbiome, role in gut homeo-stasis, and nutrient-drug interactions. Carbohydr Polym 2021; 255 (12): 117388. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117388
5. de Oliveira A.F., do Nascimento G.E., Iacomini M. Cor-deiro L.M.C., Cipriani T.R. Chemical structure and antiinflammatory effect of polysaccharides obtained from infusion of Sedum dendroideum leaves. Int J Biol Macromol. 2017; 105 (1): 940-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.07.122
6. Zhang Y., Pan X., Ran S., Wang K. Purification, structural elucidation and anti-inflammatory activity in vitro of polysaccharides from Smilax china L. Int J Biol Macromol. 2019; 139 (15): 233-43. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.07.209
7. do Nascimento G.E., Winnischofer S.M.B., Ramirez M.I., Iacomini M., Cordeiro L.M.C. The influence of sweet pepper pectin structural characteristics on cytokine secretion by THP-1 macrophages. Food Res Int. 2017; 102 (1): 588-94. DOI: https://doi. org/10.1016/j.foodres.2017.09.037
8. Sahasrabudhe N.M., Beukema M., Tian L., Troost B., Scholte J., Bruininx E., et al. Dietary fiber pectin directly blocks tolllike receptor 2-1 and prevents doxorubicin-induced ileitis. Front Immunol. 2018; 9 (3): 383-91. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2018.00383
9. Popov S.V., Markov P.A., Popova G.Yu., Nikitina I.R., Efimova L., Ovodov Yu.S. Anti-inflammatory activity of low and high methox-ylated citrus pectins. Biomed Prev Nutr. 2013; 3 (1): 59-63. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bionut.2012.10.008
10. Sabater C., Molina-Tijeras J. A., Vezza T., Corzo N., Montilla A., Utrilla P. Intestinal anti-inflammatory effects of artichoke pectin and modified pectin fractions in the dextran sulfate sodium model of mice colitis. Artificial neural network modelling of inflammatory markers. Food Funct. 2019; 10 (12): 7793-805. DOI: https:// doi.org/10.1039/c9fo02221j
11. Chen L., Liu J., Zhang Y., Dai B., An Y., Yu L.L. Structural, thermal, and anti-inflammatory properties of a novel pectic poly-saccharide from alfalfa (Medicago sativa L.) stem. J Agric Food Chem. 2015; 63 (12): 3219-28. DOI: https://doi.org/10.1021 / acs. jafc.5b00494
12. Tamiello C.S., do Nascimento G.E, Iacomini M., Cordeiro L.M. Arabinogalactan from edible jambo fruit induces different responses on cytokine secretion by THP-1 macrophages in the absence and presence of proinflammatory stimulus. Int J Biol Macromol. 2018; 107 (3): 35-41. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.08.148
13. Vityazev F.V., Khramova D.S., Saveliev N.Y., Ipatova E.A., Bur-kov A.A., Beloserov V.S., et al. Pectin-glycerol gel beads: preparation, characterization and swelling behavior. Carbohydr Polym. 2020; 238 (15): 238-46. DOI: https://doi.org/10.1016/j.carb-pol.2020.116166
14. Reeves P.G. Components of the AIN-93 diets as improvements in 21. the AIN-76A diet. J Nutr. 1997; 127 (5): 838S-41S. DOI: https://
doi.org/10.1093/jn/127.5.838S
15. Itoh H., Kataoka H., Tomita M., Hamasuna R., Nawa Y., Kitamu-ra N., et al. Upregulation of HGF activator inhibitor type 1 but not
type 2 along with regeneration of intestinal mucosa. Am J Physiol 22. Gastrointest Liver Physiol. 2000; 278 (4): G635-43. DOI: https:// doi.org/10.1152/ajpgi.2000.278.4.G635
16. Mahgoub A.A., El-Medany A.A., Hager H.H., Mustafa A.A., El-Sabah D.M. Evaluating the prophylactic potential of zafirlukast against the toxic effects of acetic acid on the rat colon. Toxicol 23. Lett. 2003; 145 (1): 79-87. DOI: https://doi.org/10.1016/s0378-4274(03)00269-8.
17. Krawisz J.E., Sharon P., Stenson W.F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assess- 24. ment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 1984; 87 (1): 1344-50. PMID: 6092199.
18. Pinegin B.V., Butakov A.A., Chelkina T.L. Environmental immunology. A set of methods for determining the functional activity
of phagocytes. Moscow, 1995: 136-64 (in Russian) 25.
19. Kumar P., Nagarajan A., Uchil P. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018; 1 (6): 216-28. DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505
20. Wu X.X., Huang X.L., Chen R.R., Li T., Ye H.J., Xie W., et al. Paeoniflorin prevents intestinal barrier disruption and inhibits 26. lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in Caco-2 cell monolayers. Inflammation. 2019; 42 (6): 2215-25. DOI: https://doi. org/10.1007/s10753-019-01085-z
Chen G., Ran X., Li B., Li Y., He D., Huang B., et al. Sodium butyrate inhibits inflammation and maintains epithelium barrier integrity in a TNBS-induced inflammatory bowel disease mice model. EBioMedicine. 2018; 30 (12): 317-25. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2018.03.030
Teixeira T.F., Souza N.C., Chiarello P.G., Franceschini S.C., Bressan J., Ferreira C.L., et al. Intestinal permeability parameters in obese patients are correlated with metabolic syndrome risk factors. Clin Nutr. 2012; 31 (5): 735-40. DOI: https://doi.org/10.1016/j. clnu.2012.02.009
Stephens M., von der Weid P.Y. Lipopolysaccharides modulate intestinal epithelial permeability and inflammation in a species-specific manner. Gut Microbes. 2020; 3 (11): 421-32. DOI: https:// doi.org/10.1080/19490976.2019.1629235
Billmeier U., Dieterich W., Neurath M.F., Atreya R. Molecular mechanism of action of anti-tumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 2016; 22 (42): 9300-13. DOI: https://doi.org/10.3748/wjg.v22. i42.9300
Singh S.B., Carroll-Portillo A., Coffman C., Ritz N.L., Lin H.C. Intestinal alkaline phosphatase exerts anti-inflammatory effects against lipopolysaccharide by inducing autophagy. Sci Rep. 2020; 10 (1): 3107. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-59474-6
Liu W., Hu D., Huo H., Zhang W., Adiliaghdam F., Morrison S., et al. Intestinal alkaline phosphatase regulates tight junction protein levels. J Am Coll Surg. 2016; 222 (6): 1009-17. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jamcollsurg.2015.12.006
