Научная статья на тему 'Комплексный подход к оценке цитотоксичности рибосом-инактивирующих белков на клеточной модели in vitro'

Комплексный подход к оценке цитотоксичности рибосом-инактивирующих белков на клеточной модели in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
1478
171
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ / ГОЛОГРАФИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ / МТТ / РИБОСОМ-ИНАК-ТИВИРУЮЩИЕ БЕЛКИ / ВИСКУМИН / ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ / CYTOTOXICITY / DIGITAL HOLOGRAPHIC MICROSCOPY / MTT-ASSAY / RIBOSOME-INACTIVATING PROTEIN / VISCUMIN / ANTINEOPLASTIC AGENT

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Синегубова Екатерина Олеговна, Дубровина И.А., Мясников В.А.

Современные технологии в молекулярной и клеточной биологии предоставляют возможность расширения знаний в различных отраслях науки. Так, сегодня основное внимание фармакологии перемещается с целостных организмов на клетки и молекулы. Начиная с 80-х годов прошлого века, усилия ученых направленны на максимальное сокращение количества животных и разработку альтернативных моделей и тест-систем в условиях in vitro, которые призваны заменить классические методы изучения фармакодинамики in vivo. Особое место в современных исследованиях уделяется созданию фармакологических препаратов с высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. Идея создания препарата, способного избирательно влиять только на атипичные клетки и элиминировать их из организма, продолжает оставаться предметом многочисленных исследований. С этой точки зрения активно изучается целенаправленная доставка растительных токсинов, которые инактивируют рибосомы, тем самым полностью останавливая синтез белка в клетке. В настоящей работе был использован вискумин, который активно используется в противоопухолевой терапии и находит в этой области все более широкое применение. В статье в качестве комплексного подхода рассмотрены два метода оценки цитотоксичности вискумина в экспериментах in vitro на двух клеточных линиях. Первый микротетразолиевый тест (МТТ), который используется как основной для определения концентрации, вызывающей потерю жизнеспособности 50% клеток (IC50), и второй, не использующий химических меток, метод голографической микроскопии.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Синегубова Екатерина Олеговна, Дубровина И.А., Мясников В.А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Complex approach to the estimation of cytotoxicity of ribosome-inactivating proteins on the cell model in vitro

Advanced technologies in molecular and cellular biology provide the possibility to develop knowledge in various branches of science. So today, the focus ofpharmacology is shifting from holistic organisms to cells and molecules. Since the 1980s, the efforts of scientists have been aimed at maximally reducing the amount of animals used in testing and instead developing alternative models and test systems in vitro. Systems, which are designed to replace classical methods of studying pharmacodynamics in vivo. A special place in modern research is given to the creation of pharmacological preparations with high specificity of action on cells or target molecules in the body. The idea of creating a perparate capable of selectively influencing only atypical cells and eliminating them from the body continues to be the subject of numerous studies. From this point of view, purposeful delivery ofplant toxins, which inactivate the ribosomes, thereby completely stopping the synthesis of protein in the cell, is being actively studied. In this work, we evaluated the cytotoxicity of viscumin, which is actively used in antitumor therapy and is becoming more and more widely used in this area. In the article, as an integrated approach, two methods for assessing the cytotoxicity of viscumin in in vitro experiments on two cell lines are considered. The first is the microtetrazolium test (MTT), which is used as the basis for determining the concentration that causes the loss of viability of 50% of the cells. The second, which does not use chemical labels, is the method of holographic microscopy.

Текст научной работы на тему «Комплексный подход к оценке цитотоксичности рибосом-инактивирующих белков на клеточной модели in vitro»

THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019

Синегубова Е.О., Дубровина И.А., Мясников В.А.

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ РИБОСОМ-ИНАКТИВИРУЮЩИХ БЕЛКОВ НА КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ IN VITRO

ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Министерства обороны РФ, 195043, г. Санкт-Петербург, Россия

Современные технологии в молекулярной и клеточной биологии предоставляют возможность расширения знаний в различных отраслях науки. Так, сегодня основное внимание фармакологии перемещается с целостных организмов на клетки и молекулы. Начиная с 80-х годов прошлого века, усилия ученых направленны на максимальное сокращение количества животных и разработку альтернативных моделей и тест-систем в условиях in vitro, которые призваны заменить классические методы изучения фармакодинамики in vivo. Особое место в современных исследованиях уделяется созданию фармакологических препаратов с высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. Идея создания препарата, способного избирательно влиять только на атипичные клетки и элиминировать их из организма, продолжает оставаться предметом многочисленных исследований. С этой точки зрения активно изучается целенаправленная доставка растительных токсинов, которые инактивируют рибосомы, тем самым полностью останавливая синтез белка в клетке. В настоящей работе был использован вискумин, который активно используется в противоопухолевой терапии и находит в этой области все более широкое применение. В статье в качестве комплексного подхода рассмотрены два метода оценки цитотоксичности вискумина в экспериментах in vitro на двух клеточных линиях. Первый - микротетразолиевый тест (МТТ), который используется как основной для определения концентрации, вызывающей потерю жизнеспособности 50% клеток (IC50), и второй, не использующий химических меток, - метод голографической микроскопии.

Ключевые слова: цитотоксичность; голографическая микроскопия; МТТ; рибосом-инак-тивирующие белки; вискумин; противоопухолевые препараты.

Для цитирования: Синегубова Е.О., Дубровина И.А., Мясников В.А. Комплексный подход к оценке цитотоксичности рибосом-инактивирующих белков на клеточной модели in vitro. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(1): 163-172.

Для корреспонденции: Синегубова Екатерина Олеговна, научный сотрудник ФГБУ «ГНИИИ ВМ» МО РФ, 195043, г. Санкт-Петербург. E-mail: gniiivm_2@mil.ru

Sinegubova E.O., Dubrovina I.A., Myasnikov V.A.

AN INTEGRATED APPROACH TO ASSESSING THE CYTOTOXICITY OF RIBOSOME-INACTIVATING PROTEINS ON A CELL MODEL IN VITRO

State scientific-research taste Institute of military medicine of Defense Ministry of the Russian Federation, St. Petersburg, 195043, Russia

Advanced technologies in molecular and cellular biology provide the possibility to develop knowledge in various branches of science. So today, the focus ofpharmacology is shifting from holistic organisms to cells and molecules. Since the 1980s, the efforts of scientists have been aimed at maximally reducing the amount of animals used in testing and instead developing alternative models and test systems in vitro. Systems, which are designed to replace classical methods of studying pharmacodynamics in vivo. A special place in modern research is given to the creation of pharmacological preparations with high specificity of action on cells or target molecules in the body. The idea of creating a perparate capable of selectively influencing only atypical cells and eliminating them from the body continues to be the subject of numerous studies. From this point of view, purposeful delivery ofplant toxins, which inactivate the ribosomes, thereby completely stopping the synthesis of protein in the cell, is being actively studied. In this work, we evaluated the cytotoxicity of viscumin, which is actively used in antitumor therapy and is becoming more and more widely used in this area. In the article, as an integrated approach, two methods for assessing the cytotoxicity of viscumin in in vitro experiments on two cell lines are considered. The first is the microtetrazolium test (MTT), which is used as the basis for determining the concentration

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

that causes the loss of viability of 50% of the cells. The second, which does not use chemical labels, is the method of holographic microscopy.

Keywords: cytotoxicity, digital holographic microscopy, MTT-assay, ribosome-inactivating protein, viscumin, antineoplastic agent.

For citation: Sinegubova E.O. , Dubrovina I.A. Myasnikov V.A. An integrated approach to assessing the cytotoxicity of ribosome-inactivating proteins on a cell model in vitro. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(1): 163-172. (In Russian).

For correspondence: Ekaterina О. Sinegubova, Researcher of State scientific-research taste Institute of military medicine of Defense Ministry of the Russian Federation, St. Petersburg, 195043, Russia. E-mail: gniiivm_2@mil.ru

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: February 5, 2019 Accepted: February 21, 2019

Введение

Действие вещества, которое приводит к нарушению функций живого организма, определяется как токсическое. Изучение биологической активности веществ на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Это в особой мере касается разрабатываемых лекарственных субстанций, исследование которых в доклинических испытаниях, в частности преследует цель обеспечить получение их полной токсикологической оценки [1].

Степень использования животных в экспериментальных исследованиях увеличивалась параллельно с развитием медицины и фармации. Открытие анестетиков и публикация Дарвина о происхождении видов, подтверждающая биологическое сходство между человеком и животным, способствовали широкому внедрению в науку экспериментов in vivo [2]. Возрастающий спрос на высококачественные модели животных вместе с критическим взглядом на их использование привели к разработке методики «Три R» (редукция (reduction); рафинирование (refinement) и замена (replacement)), которая была описана в книге, опубликованной в 1959 г. двумя учеными из Великобритании W.M.S. Russell и Rex Burch под названием «Принципы гуманных экспериментальных методов» (The Principles of Humane Expérimental Technique). Данная методика заключается в усовершенствовании Протоколов и сокращении использования экспериментальных животных с последующей их полной заменой на альтернативные методы. Пристальное внимание во

многих странах мира к использованию животных при проведении исследований привело к формированию законодательной базы, целью которой является решение вопроса о этичности проведения опытов in vivo в данном конкретном случае. Сегодня концепция «Три R» является наиболее актуальной в области научных исследований при планировании и проведении экспериментальных исследований [3-4].

Методы оценки цитоксичности являются альтернативой классическим тестам оценки токсичности in vivo. Методы in vitro с использованием клеточных культур позволяют решить как этические проблемы, связанные с гибелью экспериментальных животных, так и значительно сократить сроки доклинического исследования новых химических препаратов. Еще одним преимуществом клеточных моделей является возможность работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их экстраполяции на целостный организм [5-6].

В основе комплекса ответных реакций клеток, обеспечивающих первичную адаптацию клетки к любому раздражителю, в том числе и токсическому агенту, лежат единые фундаментальные механизмы, которые вызывают сходные изменения на молекулярном и морфологическом уровнях. Это делает перспективным применение моделей in vitro и стандартных тестов оценки жизнеспособности клеток при действии факторов различной природы.

Особое место в современных фармакологических исследованиях уделяется разработке принципиально новых методических подхо-

THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION

дов, а также усовершенствованию уже имеющихся способов терапии злокачественных новообразований. Достижения последних лет в области молекулярной и клеточной биологии определили основные направления исследований по созданию новых противоопухолевых препаратов. Многочисленные исследования посвящены созданию фармакологических препаратов с высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. Предполагается, что такие препараты должны обладать специфической направленностью, позволяя избирательно уничтожать клетки опухоли. Одной из перспективных разработок в этой области может стать система направленного транспорта.

В качестве потенциальных противоопухолевых препаратов активно исследуются рибосом-инактивирующие белки (РИБ), полностью блокирующие синтез белка в клетке. Их широкое применение в этой области обусловлено тем, что РИБ способны избирательно уничтожать опухолевые клетки и при этом менее вредны для нормальных [7-8].

Токсические лектины омелы (Viscum album L.) относятся к рибосом-инактивирующим белкам, в которых энзиматическая А-цепь (29кДа) соединена дисульфидной связью с лектиновой В-цепью (34кДа), обеспечивающей проникновение в цитозоль. А-субъединица токсина -специфическая РНК N-гликозидаза, которая избирательно выщепляет остаток аденина из консервативной области 28S рибосомальной РНК. Подобная рибосома больше не может связывать факторы элонгации, что предполагает остановку процесса трансляции и, следовательно, гибель клетки [9]. Исключительная токсичность вискумина для клеток человека создает предпосылки его применения для создания противоопухолевых препаратов направленного действия. Сегодня экстракты омелы белой (Viscum album) активно используются в Европе для общей иммуностимуляции при онкологических заболеваниях [10-11].

Таким образом, были созданы предпосылки для разработки на основе РИБ цитостатиков для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также противовирусных вакцин нового поколения. Глубокое понимание особен-

ностей взаимодействия рибосоминактивирую-щих белков с клеткой-мишенью, особенности токсического процесса, а также различные морфологические изменения на клеточном уровне позволят повысить качество фармакологических препаратов на их основе и расширить область применения.

Для исследования воздействия токсических веществ на культуры клеток используют различные маркеры, позволяющие оценить степень повреждения тех или иных структур и механизмов [2]. Нарушение той или иной жизненно важной функции, через определенное время оказывающей отрицательное воздействие на жизнеспособность клеток, позволяет проводить предварительную оценку степени цитотоксичности. Этот факт облегчает задачу, поскольку предполагает хотя бы на первом, оценочном этапе, использование ограниченного набора клеточных линий (стандартных), а также небольшого количества тестов, оценивающих их жизнеспособность. Разнообразие строения клеток в многоклеточном организме настолько существенно, что чувствительность разных клеток к токсикантам может отличаться в разы. Но все же можно выделить некоторые общие механизмы, лежащие в основе цитоток-сического действия. Традиционно принимают во внимание нарушение энергетического обмена, повреждение клеточных мембран, а также нарушение процессов синтеза белка и пролиферации. Но стоит все же отметить, что для постановки таких экспериментов необходим комплексный подход. Во-первых, проведение тестов, оценивающих несколько индикаторов жизнеспособности. Во-вторых, использование нескольких клеточных линий с учетом разных параметров действия токсических веществ (длительность, доза).

На сегодняшний день тесты, используемые для оценки цитотоксичности можно разделить на 2 группы. 1-я группа предполагает использование различных химических реагентов, взаимодействующих с определенными структурами внутри или снаружи клеток. Они позволяют определить степень повреждения и точку воздействия тестируемого вещества. 2-я группа тестов не использует метки (label-free), и оценка цитотоксичности происходит путем визуализа-

165

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Таблица 1 Методы оценки цитотоксичности в экспериментах in vitro

Метод Оборудование для регистрации Метод регистрации Механизм действия

С использованием маркеров (меток)

Измерение результатов по конечной точке:

MTT Спектрофотометр Тетразоловый краситель Активность митохондриаль-ных ферментов

МТС, XTT, WST Спектрофотометр Тетразоловый краситель Активность митохондриаль-ных ферментов

Annexin V-FITC/PI Проточная цитометрия Цитометрический анализ апоп-тотической клеточной гибели Оценка апоптоза/некроза клеток

окраска трипановым синим Прямой подсчет клеток Трипановый синий Определение количества живых клеток

поглощение нейтрального красного Спектрофотометр Нейтральный красный, поглощается и удерживается только живыми клетками Оценка активности трансмембранного переноса, фаголизосомальные функции

Измерение результатов в реальном времени (клетки живы):

Ресазурин Флуориметрический метод Синий краситель, который при восстановлении превращается в розовый флуоресцирующий резоруфин Активность митохондриальных ферментов

LDH Спектрофотометр Измерение активности лактатдегидрогеназы Присутствует в цитоплазме живых клеток и выделяется в среду через повреждения в мембране

Без использования меток (label-free)

Голографическая микроскопия Holomonitor M4 Xcelligence ACEA Голографический микроскоп, система детекции и регистрации Микроскопия Оценка морфологических изменений клеток

Измерение импеданса Не инвазивный мониторинг электрического импеданса для количественной оценки пролиферации клеток, изменения морфологии в режиме реального времени Оценка морфологических изменений клеток

ции и прямой детекции основных показателей жизнеспособности клеток.

В нашем исследовании в рамках комплексного подхода мы оценили два метода, позволяющие детектировать действие вещества на клеточном уровне. Первый - колометрический тест для оценки метаболической активности клеток, известный как микротетразолиевый тест (МТТ) [12]. Второй, относительно новый метод, не нашедший пока широкого примене-

ния на практике, - голографическая микроскопия, который предполагает создание гологра-фического изображения объекта с помощью прибора Holomonitor M4. Данный прибор позволяет прижизненно визуализировать клеточный монослой, что делает его уникальным для исследований на клеточных культурах [13].

Сравнительная характеристика основных методов изучения цитотоксичности in vitro представлена в табл. 1.

THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION

Материал и методы

Культуры клеток В работе использованы следующие перевиваемые клеточные линии: А-549, карциномы легкого человека и HEK293, клетки эмбриональной почки человека. Клетки культивировались при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5% CO2 (инкубатор Lamsistems ламинарные системы, Россия). Для проведения экспериментов клетки высевали в 96-луночные планшеты (Thermo Scientific Nunc, США) в количестве 10 х 104 клеток на 1 лунку в 150 мкл среды и в пластиковые флаконы S = 25 см2 (Thermo Scientific Nunc, США) в количестве 0,7 х 106 клеток в 10 мл среды. Для культивирования использовали среду DMEM (Lonza, Швейцария) содержащую 4 мМ L-глутамина, 1000 мг/л глюкозы, 10% фетальную бычью сыворотку FBS (HyClone, США) и антибиотик пенициллин/стрептомицин/амфотерицин В (Lonza, Швейцария). Через 1 сут проводили замену ростовой питательной среды на поддерживающую бессывороточную среду, содержащую изучаемые вещества.

Рибосом-инактивирующие белки Цитотоксический ответ индуцировали введением в среду инкубации вискумина (Sigma Aldrich, США) в концентрациях от 300 мкг/мл до 0,0006 мкг/мл. Препарат вводили в 10-кратных, а затем в 2-кратных разведениях вплоть до минимальных острых токсических доз, при которых не выявляются детектируемые различия с контрольной группой.

Методы

Степень повреждения клеточного монослоя оценивали с помощью микротетразолие-вого теста, который отражает ингибирование интенсивности клеточного дыхания. Клетки инкубировали с вискумином в течение 6, 12 и 24 ч, далее тщательно отмывали планшет и добавляли в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора тетразолия (0,5 мг/мл) и инкубировали 2 ч в условиях 37 °С увлажненной атмосферы с 5% CO2. После чего среду отбирали, в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО и экстрагировали образовавшийся формазан. Оптическую плотность полученного раствора формазана в диметилсульфоксиде (ДМСО)

измеряли на планшетном спектрофотометре (Thermo Scientific, США) при длине волны 535 нм. Измерение оптической плотности в растворе после воздействия ДМСО позволяет оценить количество жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях — специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным агентом. За 100% жизнеспособности принимали интенсивность окраски в лунках с клетками, не обработанными вискумином. Построение кривых цитотоксичности, определение концентрации, вызывающей потерю жизнеспособности 50% клеток (IC50), определение 95% доверительного интервала, проведение нелинейной регрессии осуществляли в программе GraphPad Prism 7.0. Показатель IC50 в дальнейшем использовали для изучения морфологических изменений клеток под воздействием вискумина.

Для оценки цитотоксического действия ви-скумина на морфологические характеристики клеток использовали метод голографической микроскопии. Данный метод позволяет прижизненно визуализировать клеточный монослой и фиксировать изменения с использованием прибора Holomonitor M4 (прибор Holomonitor M4, Phase Holographic Imaging PHI AB, Швеция). Клетки культивировали в количестве 0,7 х 106 (S 25 см2) во флаконах в среде DMEM с содержанием 10% FBS, через 48-72 ч после посадки клеток достигалась необходимая конфлюент-ность монослоя (70-80%). Далее производилась смена питательной среды DMEM на без-сывороточную с вискумином и в течение 24 ч производилась детекция морфологических изменений клеток под воздействием исследуемого вещества.

Затем оценивали морфологические изменения клеток при помощи программного обеспечения, предоставленного производителем прибора Holographic Imaging PHI AB.

Статистическая оценка полученных результатов

Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0 Для проверки гипотезы о соответствии распределения значений признака нормальному использовали критерий Шапиро-Уилка. Для сравнения двух независи-

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Оптимальное время воздействия вискумина на клеточную культуру Таблица 2

Время воздействия, ч Концентрация вещества, мкг/мл

0,0 (контроль клеток)* 0,3 3 30

6 0,35 ± 0,03 0,23 ± 0,04 0,29 ± 0,04 0,40 ± 0,08

12 0,25 ± 0,03 0,24 ± 0,08 0,31 ± 0,10 0,23 ± 0,06

24 0,42 ± 0,03 0,16 ± 0,06** 0,15 ± 0,05** 0,11 ± 0,01**

Примечание.* - контрольная группа для оценки значимых отличий в оптической плотности (ОП) с группами, обработанными исследуемыми веществами; ** - среднее значение ОП в группе, обработанной веществом, при статистической обработке результатов выявлены достоверные отличия от контрольной группы.

мых групп - непараметрический критерий и Манна-Уитни.

Результаты исследования

Определение оптимального времени воздействия вискумина на клеточную культуру.

Для оценки повреждающего воздействия рибосом-инактивирующих белков на метаболизм и морфологическую структуру клеток использовались две перевиваемые линии А-549 и НЕК293. Степень повреждения клеточного монослоя оценивали по снижению суммарной активности митохондриальных дегидрогеназ в МТТ-тесте, который отражает ингибирование интенсивности клеточного дыхания. Изменения морфологических характеристик клеток под воздействием предполагаемого токсического агента оценивали с помощью метода голо-графической микроскопии.

На первом этапе исследования необходимо было определить минимальное время воздействия вещества на клеточную культуру, при котором наблюдалась достоверная разница между группой контроля и обработанными клетками при использовании микротетразолиевого теста. Как видно в табл. 2 через 6 и 12 ч повреждение клеточного монослоя в экспериментальных группах не выявлялось и статистически не отличалось от группы контроля. Статистически значимые отличия проявлялись через 24 ч экспозиции клеток с вискумином. Уровень статистической значимости различий между значениями оптической плотности (ОП), полученными при обработке вискумином клеток А-549 в разные временные промежутки, опре-

деляли по критерию Манна-Уитни. С помощью критерия определили достоверны ли различия между группой контроля (не обработанные клетки) и исследуемыми группами с различной концентрацией токсических веществ. Статистически значимыми признавались значенияр < 0,05.

Определение концентрации вискумина, вызывающей 50% снижение жизнеспособности клеток (1С50).

После определения минимального времени повреждающего воздействия предполагаемого токсического агента на клеточные линии, определяли показатель 1С50, который в дальнейшем использовался для детекции морфологических изменений клеток методом голографической микроскопии.

Клеточную линию А-549 высаживали на 96-луночный планшет. Для эксперимента готовили серию разведений исследуемого вещества в концентрациях от 300 до 0,0006 мкг/мл. Через 1 сут после посадки клеток на планшеты производили замену питательной среды на бессывороточную, содержащую вискумин. Через 24 ч инкубации клеток с вискумином проводили микротетразолиевый тест. За 100% жизнеспособность принимали интенсивность окраски в лунках с клетками, не обработанными исследуемым веществом. На графике, отображающем зависимость количества жизнеспособных клеток от концентрации токсического вещества (рис. 1), представлены средние значения по данным двух экспериментов для клеточной линии А-549, каждый из которых выполнен в восьмикратной повторности. Установлено,

THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION

Рис. 1. Цитотоксический эффект вискумина на культуре клеток А-549 при 24-ч инкубации. Для оценки цитотоксического эффекта использовался тест на восстановление МТТ до МТТ-ф.

что концентрация, вызывающая потерю жизнеспособности 50% клеток (1С50), составляет 0,002 ± 0,00005 мкг/мл. На основании полученных данных был проведен эксперимент по изучению морфологических изменений клеток при воздействии на них исследуемым веществом в соответствующей концентрации - 1С.

Определение морфологических изменений клеточного монослоя в контрольной группе и при обработке вискумином

Морфология клеток и их количество являются важными параметрами при анализе цитоток-сического действия веществ. При помощи го-лографической микроскопии (Но1отопйог М4) были зафиксированы морфологические изменения клеток линии НЕК293 в контрольной группе и при обработке вискумином в концентрации 0,002 мкг/мл.

Жизнеспособные клетки имеют нерегулярную форму, уплощенные и прикреплены к поверхности культуральной посуды. Поврежденные клетки более однородны по форме, происходит открепление от подложки и уменьшение площади занимаемой поверхности, клетки плавают в культуральной среде. Основными для определения воздействия токсических веществ на клеточные популяции при использовании голографической микроскопии, позволяющей визуализировать клеточный монослой, являются параметры морфотипа [13].

Рис. 2. Динамика образования клеточного монослоя в контрольной группе.

На рис. 2 представлен монослой (а) в начале культивирования и через 24 ч (б). Как видно на данном рисунке клетки в начале культивирования уплощены и прикреплены к подложке, покрывают небольшую часть культуральной посуды (конфлюентность 23%). Через 24 ч культивирования конфлюентность монослоя достигает 56%.

При изучении изменений в морфологии клеток с использованием голографической микроскопии несомненным преимуществом является возможность прижизненной визуализации изменений, происходящих под воздействием токсических веществ. Для детекции изменений, происходящих с морфологической структурой клеток под воздействием предполагаемого токсического агента, клетки культивировали в течение 24 ч со средой DMEM и добавлением 10% FBS, после чего производили замену среды

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

0 ч

12 ч

24 ч

15,5 12,8 г. 10,1

го

X

I 7,38 о

4,68 1,98

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

я

0 -"' "¿Ч 1 ■ * 1 _ ■ ■э ■ ■ 4

ЯИШ" ч. ^ * "Г -

-0,01 0,13 0,27 0,41 0,56 0,7 Нерегулярность

15,5 12,8 * 10,1

го

н

I 7,38 о

4,68 1,98

■ ■ 0 ■ Я ■ ■ ■ % р . ■

К V-^ ' а» ° ■ ■ 1 ■

■ь ■ г V-- о

-0,01 0,13 0,27 0,41 0,56 0,7 Нерегулярность

15,5 12,8 * 10,1

го

н

I 7,38 о

4,68 1,98

■ ■ ■ ■ ■

■ ф ■ ■ ■ и

1 ■ и *. « : ■ ■ ■■ ■

Г \ .V-н ■ ■«■ Ф 1

0,01 0,13 0,27 0,41 0,56 0,7 Нерегулярность

Рис. 3. Голографическая визуализация клеточного монослоя НЕК293, обработанного вискумином в течение 24 ч.

THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION

на бессывороточную с добавлением вискумина в концентрации 0,002 мкг/мл. Далее в течение 24 ч производилась регистрация визуальных изменений клеточного монослоя с помощью прибора Но1отопйог М4. Морфологическая структура клеток подвергается изменениям относительно контрольной группы уже через 6 ч инкубации, в то время как при оценке цитоток-сичности с использованием МТТ, статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группами появлялись лишь через 24 ч после начала воздействия вещества. Это может быть связано с тем, что при оценке суммарной активности митохондриальных дегидрогеназ (тест МТТ) на ранних этапах не происходит значительного снижения активности клеточного дыхания, тогда как морфологические изменения, свойственные началу процесса клеточной гибели, уже видны.

На рис. 3 представлены голографические изображения и диаграммы рассеивания клеточной линии НЕК293 после непосредственной обработки вискумином и через 12 и 24 ч инкубации. Голографические изображения (левая колонка) демонстрируют, что при воздействии вискуми-ном в концентрации 0,002 мкг/мл отдельные клетки увеличиваются в размере, становятся более однородными по форме и начинают открепляться от дна культурального флакона. На диаграмме рассеивания (по оси абцисс -нерегулярность, по оси ординат - толщина) прослеживается динамика морфологических изменений клеточной линии под воздействием исследуемого вещества. С помощью гейтирования выделены зона мертвых клеток (оранжевая), зона уплощенных клеток с нерегулярной структурой (сиреневая), что соответствует живым клеткам, и небольшое количество неоднородных и увеличенных в размерах клеток (синяя). Через 24 ч клеточный монослой уменьшился в площади, а морфология клеток претерпела значительные изменения, в частности гибнущие стали более однородны и увеличились в толщине.

Заключение

Подбор основных тестов для изучения ци-тотоксичности является важным этапом планирования токсикологических исследований. Для постановки подобных экспериментов целесоо-

бразен комплексный подход, который состоит из «батареи» тестов как с использованием химических реагентов, так и без них, включающий несколько индикаторов жизнеспособности, наборов культур и различных сроков воздействия предполагаемых токсических веществ.

Была проведена оценка двух методов детекции токсичности вискумина. МТТ-тест позволил нам определить рабочие концентрации вещества для последующего более глубокого изучения его токсичности в экспериментах in vitro, тогда как применение метода голографической микроскопии сделало видимыми эффекты препарата на более ранних сроках.

Таким образом, использование двух разных подходов к оценке цитотоксичности позволило нам определить сразу несколько показателей, характеризующих жизнеспособность клеточного материала, что дало возможность более точно оценить степень повреждающего воздействия вискумина.

Несмотря на сложности в интерпретации данных, методы тестирования цитотоксич-ности in vitro приносят большую пользу благодаря своей простоте и экономической выгоде и могут быть использованы как скрининг-методы для сепарации фармакологических субстанций на ранней стадии изучения и выявления клеточных и молекулярных механизмов их биологической активности.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

(пп. 2-4, 8-9, 11-13 см. в REFERENCES)

1. Киселев О.И. и др. Оценка метаболических показателей in vitro как модельной системы тестирования цитотоксичности противовирусных препаратов. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006; 69(1): 65-70.

5. Данченко Е.О. Оценка цитотоксичности фармацевтических субстанций с использованием клеточных культур. Иммунопатология, аллергология, инфекто-логия. 2012; 2: 22.

6. Дмитруха Н.Н. Культура клеток как in vitro модель в токсикологических исследованиях. Киев. Medix anti-aging. 2013; 3: 33.

7. Корман Д.Б. Лектины омелы белой-противоопухоле-вые свойства и механизмы действия. Вопросы онкологии. 2011; 57(6): 689-98.

171

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

10. Корман Д. Б. Альтернативная лекарственная терапия рака. Злокачественные опухоли. 2012; 2(2): 67-75.

REFERENCES

1. Kiselev O.I., et al. Evaluation of metabolic parameters in vitro as a model system for testing the cytotoxicity of antiviral drugs. Eksperimental'naya i klinicheskaya far-makologiya. 2006; 69:1: 65-70. (in Russian).

2. Baumans V Use of animals in experimental research: an ethical dilemma? Gene therapy. 2004; 11(S1): 64.

3. Goldberg A.M. The principles of humane experimental technique: is it relevant today? ALTEX-Alternatives to animal experimentation. 2010; 27(2): 149-51.

4. Kandarova H., Letasiova S. Alternative methods in toxicology: pre-validated and validated methods. Interdisciplinary toxicology. 2011; 4(3): 107-13.

5. Danchenko E.O. Evaluation of the cytotoxicity of pharmaceutical substances using cell cultures . Immunopa-tologiya, allergologiya, infektologiya. 2012; 2: 22. (in Russian).

6. Dmitruha N.N. Cell culture as an in vitro model in toxi-cological studies . Kiev: Medix anti-aging. 2013; 3: 33 .

7. Korman D.B. White mistletoe lectins and antitumor

properties and mechanisms of action. Voprosy onkologii. 2011; 57( 6): 689-98. (in Russian).

8. Kleijnen J., Knipschild P. Mistletoe treatment for cancer review of controlled trials in humans. Phytomedicine. 1994; 1(3): 255-60.

9. Franz H. Mistletoe lectins and their A and B chains. Oncology. 1986; 43(1): 23-34.

10. Korman D.B. Alternative Cancer Drug Therapy. Zlo-kachestvennyye opukholi. 2012; 2(2): 67-75. (in Russian).

11. Harmsma M. et al. Effects of mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador on cell cycle and survival of tumor cells. Arzneimittelforschung. 2006; 56( 06): 474-82.

12. Berridge M. V., Herst P. M., Tan A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction . Biotechnology annual review. 2005; 11: 127-52.

13. Peter B. et al. Incubator proof miniaturized Holomonitor to in situ monitor cancer cells exposed to green tea polyphenol and preosteoblast cells adhering on nanostruc-tured titanate surfaces: validity of the measured parameters and their corrections. Journal of biomedical optics. 2015; 20(6): 067002.

Поступила 05.02.2019 Принята в печать 21.02.2019

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.