Определение токоферолов и токотриенолов в растительных маслах и некоторые особенности их состава Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.544.5.068.7:54.061

Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2006, вып. 4

А. Ю. Ещенко, И. Г. Зенкевич ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКОФЕРОЛОВ

И ТОКОТРИЕНОЛОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЛАХ И НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИХ СОСТАВА

Токоферолы и токотриенолы представляют собой соединения группы витамина Е. Токоферолы являются гомологами 2Н-метил-2-(4'Н,8'Н,12'-триметилтридецил)-6-хроманола (токола), а их структурные аналоги - токотриенолы имеют три двойные связи в триметилтридецильном фрагменте молекулы. Приведем структурные формулы соединений группы витамина Е:

Токоферолы Токотриенолы

Р я"

и = в/ = В" = н (токол); Б, = В/ = Б." = СН3 (а-токоферол); В/ = Н; В = В" = СН3 (/3-токоферол); В" = Н; В = В' = СНз (7-токоферол); В = В" = Н; В = СНз (¿-токоферол) В = В' = В" = СНз (а-токотриенол); В' = Н; В = В" = СНз (/3-токотриенол); В" = Н; В = В' = СНз (7-токотриенол); В = В" = Н; Я = СНз (¿-токотриенол)

Соединения группы витамина Е содержатся как в составе растений, так и в организмах животных, где локализованы преимущественно в липопротеиновых мембранах клеток и субклеточных органелл [1].

Некоторые растительные масла являются богатыми источниками витамина Е. Например, суммарное содержание токоферолов в таких маслах как пальмовое, отрубей риса, зародышей пшеницы, ячменя, овсяных зерен, кокосовое, бобов сои, сафлора, арахисовое, какао, оливковое оценивают от 1 до 220 мг%. Количество токотриенолов в указанных маслах составило от 0,2 до 91 мг% [2] . Наибольшее содержание токоферолов обнаружено в масле зародышей пшеницы - от 200 до 600 мг% [1].

Токоферолы и особенно токотриенолы обладают значительной антиоксидантной активностью. Они препятствуют радикальному окислению белков и липидов в тканях растений и животных (за счет собственного окисления) [2]. При этом а-токотриенол задерживает окисление липидов в 40-60 раз быстрее, чем изоструктурный токоферол; 5-токотриенол препятствует развитию раковых клеток, а 7-токотриенол способствует снижению кровяного давления. Применение масел, в состав которых входят соединения группы витамина Е, в косметологии связано именно с их способностью к нейтрализации свободных радикалов (предотвращение старения кожи) и защитой от ультрафиолетовой радиации (использование в солнцезащитных кремах).

ВЭЖХ-анализ соединений группы витамина Е. В соответствии с известными литературными данными, токоферолы и токотриенолы можно разделять в режимах как нормально-фазовой, так и обращенно-фазовой ВЭЖХ [2, 3]. В варианте нормально-фазовой ВЭЖХ можно разделить все гомологи токоферолов и соответствующих токотриенолов, в

Этот сайт (март 2006 г.) содержит информацию о биологической активности и метода« анализа преимущественно для токотриенолов.

© А. Ю. Ещенко, И. Г. Зенкевич, 2006

обращенно-фазовой ВЭЖХ - только шесть (ß- и 7-структуры разделить сложно, так как они имеют близкие коэффициенты гидрофобности). В данной работе хроматографическое разделение соединений группы витамина Е проводили в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.

По литературным данным известно несколько вариантов разделения токоферолов и токот-риенолов. Например, изократическое элюирование смесью метанол / буферный раствор (0,5 M ацетат лития, pH 4,75) (95:5 об.) [4]. В работе [2] предложены условия изократического элюирования смесью ацетонитрил / метанол / хлористый метилен (60:35:5). Градиентное элюирование смесью ацетонитрил / н-пропиловый спирт (65:35 об.) - фаза В и буферный раствор (20 мМ NaClC>4+5 мМ НСЮ4) / ацетонитрил (10:90 об.) - фаза А с линейным изменением концентрации фазы В от 10 до 100 % за 20 мин [5].

Для идентификации токотриенолов методом ВЭЖХ-МС и ЯМР-спектроскопии были выбраны условия разделения на колонке Сзо, изократическое элюирование 100%-ным метанолом

И-

Регистрацию пиков токотриенолов проводили с флуоресцентным детектированием при длинах волн возбуждения 296 нм и испускания 330 нм, элюентом служила смесь ацетонитрил / тетрагидрофуран (3:2 об.) [2].

Для анализа шести соединений группы витамина Е были выбраны условия изократического элюирования 100%-ным метанолом с УФ-детектированием как наиболее воспроизводимые.

Экспериментальная часть. Анализ методом ВЭЖХ проводили на хроматографе «Beckman» с УФ-детектором при длине волны детектирования 296 нм и колонкой Luna Cíe (150 ж 4,6 мм) (размер частиц сорбента 5 мкм) с предколонкой длиной 20 мм, заполненной тем же сорбентом. Использован режим изократического элюирования 100%-ным метанолом. Скорость потока элюента - 1,0 мл/мин. Дозируемый объем образцов - 20 мкл. Время анализа около 15 мин. Идентификацию и количественный анализ токоферолов осуществляли методом внешнего стандарта с использованием стандартных образцов 7-токоферола [Supelco (более 99%), CAS 54-28-4], ¿-токоферола [Supelco (более 99%), CAS 119-13-1] и а-токоферола [Fluka (более 99%), CAS 59-02-9]. На первом этапе работы из-за отсутствия стандартных образцов токотриенолов (относятся к труднодоступным и дорогостоящим) идентификацию проводили расчетными способами. В дальнейшем в качестве образца сравнения был использовал масляный препарат с 30%-ным содержанием <5-, 7- и а- токотриенолов (Tocotrienol, 30%, Spain, «Monteloeder s.l. 03201»).

УФ-спектры токоферолов в качестве дополнительных аналитических параметров, были получены на спектрофотометре «Shumadzu» UV-1100.

Расчет коэффициентов гидрофобности log Р осуществляли с помощью программного обеспечения ACD, построение графических зависимостей - ORIGIN 4.1.

Пробы препаратов готовили растворением около 0,1 г (точная навеска) в 2 мл хлороформа; стандартные образцы токоферолов - 20 мг (точная навеска) - растворяли в 50 мл изопропило-вого спирта, образец токотриенолов - 0,1 г (точная навеска) - растворяли в 25 мл хлороформа.

Были проанализированы лекарственные препараты на основе природных масел: препарат «Масло зародышей пшеницы. Особое с витамином Е» (Bional) (1); препарат «Виардо» (2); препарат «Простамол» (экстракт пальмы Сабаля) (Berlin-Chemie) (3); препарат «Germ oil» (China) (4); препарат «Тыквеол» (Европа-Биофарм) (5); масло «Злата Пальма» (6); масло «Льняное» (Тверское «Эколен») (7); масло зародышей пшеницы (ОАО «Диод», Москва) (8); Saw Palmetto oil. (9); Extr. Sabalis «Euromed» (10).

Результаты и их обсуждение. УФ-спектры токоферолов и соответствующих токотриенолов характеризуются полосами поглощения с максимумами в диапазоне 292-298 нм [б]. Максимум поглощения в УФ-спектрах у всех трех стандартных образцов токоферолов составил 296 нм, поэтому хроматографический анализ проводили при длине волны детектирования 296 нм.

На рис. 1 представлены хроматограммы стандартных образцов токоферолов, образца токотриенолов и растительного масла (на примере препарата «Бионал»).

Опт. плотность 5

ОД

Опт; плотность

0,15 -

Б 3

4

0,0

0,6

2L-1-1

\-1-U

0,0

20,0

0,0 15,0

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма смеси стандартных образцов токоферолов и токо-триенолов (Л) и типичная хроматограмма растительного масла (на примере препарата «Бионал») (Б).

А: 1-3 - <5-, 7- и а-токотриенолы, - 8-, 7- и а-токоферолы соответственно; Б: 1 -¿-токотриенол, 2 - 7-токоферол, 3 - а-токоферол (в порядке элюирования).

Идентификация токотриенолов. Идентификация «экзотических» соединений (труднодоступных или дорогостоящих) в отсутствие образцов сравнения (стандартных) является одной из актуальных проблем современной аналитической химии. В работе [7] предложен способ идентификации босвеллиевых кислот в отсутствие стандартных образцов по относительным временам удерживания.

Как отмечено выше, на первом этапе работы из-за отсутствия стандартных образцов токотриенолов для их идентификации был применен способ с использованием значений логарифмов коэффициентов гидрофобности (коэффициенты распределения рассматриваемых соединений в системе октанол/вода log Р). Такой подход был предложен ранее для идентификации фитостеринов - также биологически активных веществ растительных масел [8].

В отсутствие образцов сравнения для идентификации одной и той же группы соединений (структурных аналогов, изомеров) можно рассматривать зависимость параметров удерживания (исправленных времен удерживания - £д/) от log Р. В условиях изократического элюирования теоретически должна выполняться зависимость

tR, мин

10,8 11,0 11,2 11,4 11,6 11,8 12,0

logP

Рис. 2. Зависимость экспериментальных параметров удерживания токоферолов от коэффициентов гидрофобности (по уравнению (2)).

у = ах + Ь\ а = 2,9 ± 0,2; Ь = - 24,9 ± 2,0; г = 0,998; = 0,12.

logik = alogP + 6. (1)

Однако в относительно небольших интервалах изменения log Р и tR можно применять более простые линейные соотношения

¿я = а'^Р + Ъ'. (2)

Полученные коэффициенты уравнения использовали для расчета абсолютных времен удерживания неидентифицированных фитостеринов.

Такой способ расчета параметров удерживания был применен для подтверждения правильности идентификации токотриенолов. Зависимость абсолютных времен удерживания токоферолов от их коэффициентов гидрофобности иллюстрирует рис. 2.

Используя полученные коэффициенты, можно оценить значения абсолютных времен удерживания токотриенолов. Из табл. 1 следует, что среднее абсолютное отклонение расчетных и экспериментальных времен удерживания токотриенолов составляет от 0,6 до 0,9.

На рис. 3 представлены зависимости абсолютных времен удерживания токоферолов и токотриенолов от их коэффициентов гидрофобности. Из него вытекает, что рассматриваемые зависимости токотриенолов и токоферолов от их коэффициентов гидрофобности по отдельности характеризуются высокими коэффициентами корреляции. Однако для объединенной зависимости токоферолов и токотриенолов от соответствующих коэффициентов гидрофобности коэффициент корреляции низкий - 0,977. Возможно, это связано с тем, что токотриенолы имеют три двойные связи в алифатической цепи молекулы, которые изменяют характер удерживания этих компонентов.

Таблица 1. Параметры удерживания токоферолов и токотриено-лов (расчетные и экспериментальные данные)

Соединение Средние значения ± стандартное отклонение

logP ¿л(эксп.), мин Мпо (1)) Ыпо (2))

i-Токотриенол 9,8 ± 0,4 4,1 ± 0,1 4,7 ± 0,1 3,6 ± 0,4

/З-Токотриенол, 7-токотриенол 10,3 ± 0,4 4,7 ± 0,1 5,6 ± 0,1 5,0 ± 0,3

а-Токотриенол 10,7 ± 0,4 5,3 ± 0,1 6,4 ± 0,2 6,2 ± 0,1

¿-Токоферол 10,9 ± 0,3 6,7 ± 0,2 6,8 ± 0,4 6,7 ± 0,1

/З-Токоферол, 7-токоферол 11,4 ± 0,3 8,3 ± 0,1 8,1 ± 0,7 8,2 ± 0,1

а-Токоферол 11,9 ± 0,3 9,6 ± 0,1 9,7 ± 1,2 9,6 ± 0,1

Примечание. log Р - расчетные значения логарифмов коэффициентов распределения рассматриваемых соединений в системе октанол/вода, ¿я(эксп.) - абсолютные времена удерживания образцов сравнения.

Следовательно, для идентификации индивидуальных соединений в многокомпонентных образцах одних только параметров удерживания недостаточно.

В работах [9,10] в качестве дополнительного критерия идентификации флавоноидов использовали относительные оптические плотности при разных фиксированных длинах волн. Относительные оптические плотности (Л0Тн) при разных фиксированных длинах волн рассчитывают по следующему соотношению:

А>тн = 4(А1)М(А2) « 5(Л1)/5(А2) « #(А1)/#(А2),

где 5(л1) и 5(л2) ~ площади пиков; Н(м) и #(А2) ~ высоты пиков анализируемого соединения при детектировании на разных длинах волн.

Результаты определения относительных оптических плотностей токоферолов и то-котриенолов при длинах волн 296 и 254 нм представлены в табл. 2.

Таблица 2. Относительные оптические плотности токоферолов и токотриенолов

Гомолог соединения А (296 /254)

Токотриенол Токоферол

6 7 а 0,77 ± 0,03 1,43 ± 0,05 1,61 ± 0,05 0,22 ± 0,01 0,35 ± 0,02 0,61 ± 0,02

Таким образом, используя значения относительных оптических плотностей и расчетные величины абсолютных времен удерживания по значениям log Р, можно проводить идентификацию соединений группы витамина Е в многокомпонентных природных маслах в отсутствие образцов сравнения.

Количественная характеристика идентифицированных токоферолов и токотриенолов в анализируемых масляных препаратах. Количественный анализ 10 препаратов на основе природных масел был проведен методом внешнего стандарта с использованием стандартных образцов токоферолов. При этом, вопреки ожидани-72

/„, мин

1о еР

Рис. 3. Зависимости абсолютных времен удерживания от коэффициентов гидрофобности токоферолов (1) и токотриено-лов (2).

Параметры уравнения = а^Р + Ь: 1 - а = 2,9 ± 0,2, Ь = -24,9 ± 2,0, г = 0,998, 50 = 0,12; 2 - а = 1,3 ± 0,1, Ь = -8,9 ± 0,9, г = 0,998, 50 = 0,06.

ям, только в пяти из 10 образцов были обнаружены соединения группы витамина Б. В табл. 3 приведены содержания токоферолов и токотриенолов в растительных маслах.

Таблица 3. Содержания идентифицированных токоферолов и токотриенолов (масс.%) в масляных препаратах

Образец ¿-Токотриенол* ¿-Токоферол 7-Токоферол а-Токоферол

1 0,020 ± 0,001 - 0,081 ± 0,001 3,2 ± 0,3

2 - - 0,008 ± 0,001 0,15 ± 0,03

4 - - 0,16 ± 0,02 0,54 ± 0,02

7 0,020 ± 0,001 0,051 ± 0,002 - -

8 - - 0,074 ± 0,003 0,24 ± 0,01

Примечание. Тире - содержащие соединений ниже предела обнаружения метода (около 0,001 масс.%), * - содержание в пересчете на ¿-токоферол, в образцах 3, 5, 6, 9, 10 токоферолы и токотриенолы не обнаружены.

Кале было отмечено выше, биологическую активность токоферолов и токотриенолов связывают с их способностью эффективно взаимодействовать с радикалами, образующимися при окислении липидов (высокая антирадикальная активность). Предполагается, что этот процесс включает одноэлектронный перенос атома водорода фенольной гидроксильной группы на такие радикалы, что фактически эквивалентно их восстановлению. Тем самым витамины группы Е предотвращают окисление ненасыщенных липидов и предохраняют от разрушения биологические мембраны. Такой механизм подтверждается отчетливо выраженным влиянием количества метальных групп (обладают положительным индуктивным эффектом и, следовательно, стабилизируют образующиеся токоферильные радикалы) в бензопироновых фрагментах молекул рассматриваемых соединений на их антиоксидантную активность. Например, активность

73

Б ,Ь-а-токоферола (рацемическая смесь) составляет 40% от активности природного Б-а-токоферола (три метильных заместителя), /3- и 7-токоферолов (два метальных заместителя) - 20 - 30 и 10% соответственно, а ¿-токоферола (одна метильная группа) -около 1% [И].

Высокая антиоксидантная активность токоферолов и их структурных аналогов имеет непосредственное отношение к проблеме сохранности этих соединений в растительных маслах при длительном хранении. Хорошо известны и подробно охарактеризованы процессы радикального окисления липидов, содержащих остатки непредельных жирных кислот (пальмитолеиновой 16:1, олеиновой 18:1, линолевой 18:2, линоленовой 18:3 и др.), растворенным в маслах кислородом воздуха, наиболее интенсивно протекающие на свету. Однако, в соответствии со сказанным выше, если растительные масла содержат токоферолы и токотриенолы, эффективно препятствующие окислению липидов, то содержание соединений именно этой группы должно резко снижаться в процессе хранения масел за счет их преимущественного окисления.

Кроме того, следует специально подчеркнуть элементы структурной аналогии между токотриенолами (I) и непредельными жирными кислотами, входящими в состав липидов, например линоленовой (П):

(I)

НО

(II)

В обеих молекулах присутствуют три изолированные двойные связи С=С в алифатической цепи. Однако из приведенных структурных формул легко видеть, что в непредельных жирных кислотах такие связи являются дизамещенными (в конфигурации), а в токотриенолах - трехзамещенными. Поскольку активность двойных связей С=С в реакциях как электрофильного, так и радикального присоединения (основные типы химических реакций, протекающих в процессе перекисного окисления липидов) в первую очередь зависит от числа заместителей, то токотриенолы закономерно должны быть значительно более активными, нежели соединения с линейным углеродным скелетом.

Следовательно, наблюдаемое низкое содержание этих веществ (особенно токотрие-нолов) в образцах различных растительных масел можно объяснить именно длительными сроками их хранения в неудовлетворительных условиях. Количественное определение содержания токоферолов и токотриенолов должно проводиться для образцов с минимальными сроками хранения либо при соблюдении специальных мер предосто-74

рожности при хранении и транспортировке проб (любой контакт с воздухом должен быть исключен), а также в оптимальных условиях подготовки проб для анализа. Для сохранения активности препаратов и продуктов питания, содержащих витамин Е, необходимо соблюдать не только условия хранения, но и технологию их производства и условия анализа.

Таким образом, в данной работе были подобраны оптимальные условия разделения шести соединений группы витамина Е (¿-токотриенол, 7-токотриенол, ск-токотриенол, 5-токоферол, 7-токоферол, а-токоферол) в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Из-за отсутствия стандартных образцов токотриенолов предложены два способа идентификации: расчет параметров удерживания по значениям log Р и использование относительных оптических плотностей при разных фиксированных длинах волн. При обсуждении проблемы сохранения биологической активности препаратов и продуктов питания, содержащих соединения группы витамина Е, из-за быстрого окисления токотриенолов на свету в присутствии кислорода воздуха, установлено, что необходимы специальные условия их технологии и транспортировки.

Summary

Eshchenko A. Yu., Zenkevich I. G. Determination of tocopherols and tocotrienols in plant oils and some features of their composition.

The optimal conditions for separation of three tocopherols and three tocotrienols are selected using reversed phase HPLC. The correlation between retention parameters and log P values of tocopherols and tocotrienols with relative UV-absorbencies is recommended in their identification. The problem of biological activity of preparations and food products containing vitamin E is discussed.

Литература

1. Надиров H. К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве. М., 1991. 2. http://www.tocotrienol.org. 3. Christen St., Jiang Q., Shigenaga M.// J. Lipid Res. 2002. Vol. 43. P. 1978-1985. 4. Cert A. // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 881. P. 131-149. 6. Waraska J., Goodall E. // Nutra Buyres Guide. Anal. Technol. 1999. P. 28-31. 6. Витамины / Под ред. M. И. Смирнова. М., 1974. 7. Ещенко А. Ю., Зенкевич И. Г. // Материалы II Всерос. конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул, 2005. С. 434-439. 8. Зенкевич И. Г., Пименов А. ИМакаров В. Г. // Материалы 7-го Междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», «Фитофарм-2003». СПб.; Пушкин, 2003. С. 344-351.

9. Зенкевич И. Г., Косман В. М. // Журн. прикл. химии. 1997. Т. 70, вьш. 11. С. 1861-1869.

10. Зенкевич И. Г., Косман В. М. // Журн. аналит. химии. 1996. Т. 51, вып. 8. С. 870-874.

11. Kagan V. Е., Serbinova Е. А. // J. Lipid Res. 1992. Vol. 33. P. 385-397.

Статья поступила в редакцию 19 мая 2005 г.