CC BY
46
А. С. Осипов1, Е. Б. Нечаева1, К. В. Ноздрин2
ПРИМЕНЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК С СОВРЕМЕННЫМИ ТИПАМИ СОРБЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА БУТИЛГИДРОКСИАНИЗОЛА И БУТИЛГИДРОКСИТОЛУОЛА
А. С. Осипов, Е. Б. Нечаева, К. В. Ноздрин
Резюме: Обобщены результаты опубликованных авторами в 2008-2012 гг. печатных работ. Исследовалась возможность применения монолитной колонки Chromolith Speed ROD RP-18e 50 для анализа антиоксидантов бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола в условиях изократической хроматографии и при возрастании скорости потока подвижной фазы. Применение монолитной колонки позволяет сократить время анализа антиоксидантов. Применение колонок с пентафторфенильными сорбентами позволяет также проводить анализ бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола в условиях изократической хроматографии. Хроматографирование на колонке Supelcosil LC-F существенно сокращает время анализа антиоксидантов. Хроматографирование на колонке Chiralcel OJ-RH с применением подвижных фаз метанол-вода (80:20) и ацетонитрил-вода (70:30) обеспечивает полное разделение 3-и 2-изомеров бутилгидроксианизола.
Ключевые слова: ВЭЖХ, бутилгидроксианизол, бутилгидрокситолуол.
Chromatographic columns with modern types of sorbents used for the analysis of butylhydroxyanisole and butylhydroxytoluene
A. S. Osipov, E. B. Nechaeva, K. V. Nozdrin
Abstract: The results described in the articles published in 2008-2012 have been summarized. We investigated the possibility of using a monolithic column Chromolith Speed ROD RP-18e 50 for the analysis of antioxidants butylhydroxyanisole and butylhydroxytoluene in isocr atic chromatography and when increasing the flow rate of mobile phase. The use of monolithic columns can reduce the time of antioxidants analysis. Using columns with pentafluorophenyl sorbents also allows to analyze butylhydroxyanisole and butylhydroxytoluene in isocratic chromatography. Chromatography on a column Supelcosil LC-F significantly reduces the time of antioxidants analysis. Chromatography on a column Chiralcel OJ-RH with methanol - water (80:20) and acetonitrile - water (70:30) mobile phase provides a complete separation of the 3-and 2-isomers of butylhydroxyanisole.
Key words: HPLC, Butylhydroxyanisole, Butylhydroxytoluene.
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва;
2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва
Бутилгидроксианизол (БОА; (1,1-диметилэтил)-4-метоксифенол) и бутилгидрокситолуол (БОТ; 2,6-бис (1,1-диметилэтил)-4-метилфенол) применяют в качестве антиоксидантов для предотвращения окисления лабильных лекарственных препаратов, в частности, ретинола пальмитата, других производных витамина А, сивмастатина, аторвастатина и некоторых других. Кроме того, БОА и БОТ применяют в пищевой и парфюмерной промышленности для
Осипов Алексей Сергеевич, кандидат биологических наук главный эксперт ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.
Нечаева Екатерина Борисовна, кандидат фармацевтических наук, начальник лаборатории. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. [email protected]
Ноздрин Константин Владимирович, кандидат фармацевтических наук, ассистент кафедры фармацевтической и токсикологической химии.
ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова. [email protected]
защиты от окисления лабильных компонентов продуктов питания и парфюмерных кремов (полиненасыщенные тригрицериды, производные витамина А). БОА и БОТ описаны в Британской и Американской Фармакопеях [1-3]. В качестве антиоксидантов БОА и БОТ часто применяют совместно [4]. В Британской Фармакопее указано, что основным антиоксидантом является 2-БОА изомер (2-(1,1-диметилэтил)-4-метоксифенол), а качестве примеси нормируется содержание 3-БОА изомера. Для определения 3-БОА и других примесей применяют метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). В соответствующей монографии Американской Фармакопеи содержание 3-БОА изомера отдельно не регламентировано. Для количественного определения применяют стандартный раствор, содержащий 2-БОА и 3-БОА изомеры в концентрации соответственно 9 мг/мл и 1 мг/мл. Анализ проводят методом газовой хроматографии. Количественное содержание анти-
оксиданта определяют как сумму 2-и 3-изомеров БОА.
В настоящее время для анализа подавляющего большинства лекарственных препаратов применяется метод ВЭЖХ. Наиболее часто для этого применяют хроматографические колонки с сорбентами С18 и С8. Ранее было показано, что при анализе БОА и БОТ на колонках с нитрильны-ми и фенильными сорбентами различие в гидрофобности соединений оказывает меньшее влияние на различие в коэффициентах ёмкости при хроматографировании, время анализа антиоксидантов на этих колонках сокращается. Необходимо отметить, что хроматографические колонки данных типов Диасфер 110 C10CN 250 x 4,0 мм, 5 мкм и Luna Phenyl-Hexyl 250 x 4,6 мм, 5 мкм позволяют разделять 3-изомер и 2-изомер БОА в условиях их совместного определения с БОТ [5].
Применение монолитной колонки Chromolith speed ROD RP-18E
Уменьшение времени анализа БОА и БОТ может быть достигнуто за счет повышения объемной скорости подвижной фазы. Однако при использовании традиционных, насыпных колонок, особенно с размером частиц 5 микрон и менее, это приводит к значительному повышению давления в гидравлической системе хроматографа. В отличие от насыпных колонок монолитные колонки позволяют проводить хроматографическое разделение при повышенных скоростях потока подвижной фазы без значительного возрастания давления. Это обусловлено особенностью строения сорбента, представляющего собой монолитный стержень, макро и микропоры которого обеспечивают низкое гидродинамическое сопротивление при сохранении высокой эффективности колонок. В нашем исследовании [6] использовался принцип градиента (увеличения) объемной скорости подвижной фазы в ходе проведения анализа. В таблице 1 приведены времена удерживания БОА и БОТ при применявшихся параметрах хроматографирования и максимальные значения давления в системе. Градиент объемной скорости элюен-та при применении подвижных фаз с метанолом был составлен таким образом,чтобы обеспечить элюирование БОА в изократических условиях при скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. Затем объемная скорость ПФ возрастала в 4-5 раз. При этом максимальное давление в системе не превышало рабочий диапазон давлений, обычно наблюдаемых, в жидкостной хроматографии. В наибольшей степени сокращение времени удерживания БОТ (в 1,92,3 раза) наблюдалось при использовании в качестве подвижной фазы смеси метанола и воды в соотношении 7:3. Увеличение объемной скорости не приводило к ухудшению формы пика БОТ, но приводило закономерно лишь к уменьшению его
Таблица 1. Времена удерживания БОА и БОТ на колонке Chromolith speed ROD RP-18E 50 х 4,6 мм
Режим элюирования, объемная скорость подвижной фазы (ПФ) Т (БОА), мин Т (БОТ), мин Р , бар
ПФ - метанол вода (8:2)
Изократический:1 мл/мин 1,03 2,53 28
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1 мин - 1 мл/мин; 4 мин - 5 мл/мин 1,03 1,97 140
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин - 1 мл/мин; 5 мин - 5 мл/мин 1,03 2,05 140
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин - 1 мл/мин; 2,4 мин - 4 мл/мин 1,03 1,76 111
ПФ - метанол вода (7:3)
Изократический:1 мл/мин 1,38 7,67 32
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин - 1 мл/мин; 5 мин - 5 мл/мин 1,38 3,99 162
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин- 1 мл/мин; 2,4 мин - 4 мл/мин 1,38 3,36 127
ПФ - ацетонитрил вода (7:3)
Изократический:1 мл/мин 0,93 5,16 19
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин - 1 мл/мин; 5 мин - 5 мл/мин 0,93 3,19 93
Градиент потока: 0 мин - 1 мл/мин; 1,4 мин - 1 мл/мин; 2,4 мин - 4 мл/мин 0,93 2,75 75
Т - время удерживания, мин; Рмах - максимальное давление в системе, бар.
Таблица 2. Селективность к паре БОТ/БОА и время удерживания БОТ на колонках с различными типами сорбентов
Условия анализа: колонка, состав подвижной фазы Селективность к паре БОТ/БОА Время удерживания БОТ, мин
5ире1со$И 1.С-Р 250 х 4,6 мм (5 мкм) ацетонитрил - вода (70:30) 1,62 4,50
5ире1со$И 1.С-Р 250 х 4,6 мм (5 мкм) метанол - вода (70:30) 1,91 6,40
Диасфер 110 Фенил 250 х 4,6 мм (5 мкм) ацетонитрил - вода (70:30) 2,38 7,44
Диасфер 110 Фенил 250 х 4,6 мм (5 мкм) метанол - вода (70:30) 3,49 15,71
Диасфер110-С18150 х 4,6 мм (5 мкм) метанол - вода (70:30) 9,72 38,65
Таблица 3. Хроматографические параметры анализа БОА и БОТ на колонке СЫга1ее1 ОЬ^Н 150 х 4,6 мм, 5 мкм
Состав подвижной фазы Время удерживания 3-изомера БОА, мин Время удерживания 2-изомера БОА, мин Время удерживания БОТ, мин Коэффициент разрешения 3-изомера БОА и 2-изомера БОА
метанол - вода (70:30) 17,62 29,32 Более 75 10,65
метанол - вода (80:20) 5,34 7,07 10,45 7,27
ацетонитрил - вода (70:30) 3,31 3,78 5,70 3,05
ацетонитрил - вода (75:25) 3,068 3,43 4,616 1,84
12
площади. Аналогичные результаты были получены и при использовании в качестве элюентов смесей метанола и воды 8:2 и ацетонитрила и воды 7:3.
Применение колонки БирекюБЦ ЬС-Р для анализа антиоксидантов
В последнее время многими фир-мами-изготовителями начат выпуск новых типов сорбентов, свойства которых существенно отличаются от традиционных сорбентов. Исследовалась колонка 5ире1со$Ц LC-F 250*4,6 мм, 5 мкм [7]. Сорбент данной колонки представляет собой гранулы силикагеля, поверхность которого модифицирована пентаф-торфенильными группами. Для сравнения применяли колонки Диасфер 110 Фенил 250*4,6 мм, 5 мкм (традиционный фенильный сорбент) и короткую колонку Диасфер 110-С18150 х 4,6 мм, 5 мкм (традиционный сорбент С18). В таблице 2 приведены некоторые параметры хроматографирования модельных растворов БОТ и БОА. Различие в гидрофобности БОА и БОТ в ещё более меньшей степени сказываются на различии во временах удерживания антиоксидантов на колонке SupeLcosU LC-F, чем на колонке Диасфер 110 Фенил (рис. 1 и 2). Для колонки Диасфер 110-С18 значение селективности к паре БОТ/БОА возрастает до 9,72, что совершенно неприемлемо для изократичекой хроматографии. При использовании подвижной фазы с метанолом разделение пары БОТ/БОА колонке SupeLcosiL LC-F занимает в 2,45 раз меньшее время, чем на колонке Диасфер 110 Фенил.
Условия анализа: скорость пото-
ка - 1,0 мл/мин; подвижная фаза метанол-вода 70:30; детектирование при 280 нм. 1 - БОА, 2 - БОТ Условия анализа: скорость пото-
ка - 1,0 мл/мин; подвижная фаза метанол-вода 70:30; детектирование при 280 нм. 1 - БОА, 2 - БОТ
Применение колонки СЫга1се1 О]- КИ для разделения изомеров бутилгидроксианизола
В настоящее время фирмами-изго-товителями выпускаются новые типы сорбентов, содержащих оптически-активные (хиральные) группировки. Данные сорбенты позволяют разделять рацематы и конфигурационные изомеры. Сорбент колонки СЫга1се1 OJ-RH 150 * 4,6 мм представляет собой гранулы силикагеля, модифицированные трис (4-метилбензоатом) целлюлозы. Ранее было предложено
проводить анализ БОА и БОТ на колонках с нитрильными и фениль-ными сорбентами. В частности, при использовании подвижной фазы метанол - вода (7:3) на колонке Диасфер 110 C10CN 250*4,0 мм, 5 мкм изомеры БОА полностью разделялись [5]. При использовании колонки с опти-чески-активным сорбентом Nucl.eodex Ье1а-РМ [8] коэффициент разрешения изомеров был больше (3,83), время удерживания БОТ составило 19,5 мин. На колонках других типов разделение изомеров БОА не наблюдалось. В таблице 3 приведены некоторые параметры разделения изомеров БОА, а также БОТ на колонке СЬігаІсеІ OJ-
Рис. 1. Хроматограмма разделения смеси стандартных образцов БОА и БОТ на колонке Диасфер 110 Фенил 250 х 4,6 мм, 5 мкм
1- БОА, 2- БОТ
Рис. 2. Хроматограмма разделения смеси стандартных образцов БОА и БОТ на колонке 5ире1со8Н ЬС^ 250 х 4,6 мм, 5 мкм
тДи
120
100
80
60
40
20
0
Условия анализа: скорость потока - 0,75 мл/мин; подвижная фаза ацетонитрил - вода (70:30); детектирование при 280 нм.
1- БОА, 2- БОТ
2
2
4
6
8
10
12
Рис. 3. Хроматограмма разделения смеси стандартных образцов БОА и БОТ на колонке СЫга1се1 О^Н 150 х 4,6 мм, 5 мкм
Условия анализа: скорость потока - 0,75 мл/мин; подвижная фаза метанол - вода (80:20); детектирование при 280 нм.
1-3-изомер БОА, 2-2-изомер БОА, 3 - БОТ
Рис. 4. Хроматограмма разделения смеси стандартных образцов БОА и БОТ на колонке СЫга1се1 OJ-RH 150 Х*4,6 мм, 5 мкм
тАи:
175: 2 „
150:
125:
100:
75:
50:
25:
: 1
0:______________________*
0
2
4
6
8
10
12
Условия анализа: скорость потока - 0,75 мл/мин; подвижная фаза ацетонитрил - вода (70:30); детектирование при 280 нм.
1-3-изомер БОА, 2-2-изомер БОА, 3 - БОТ
RH. На данной колонке при применении подвижной фазы метанол-вода (80:20) было достигнуто наиболее лучшее разделение изомеров БОА [9], при этом время удерживания БОТ составляло всего 10,45 мин. Для разделения изомеров БОА могут быть применены подвижные фазы, содержащие метанол (рис. 3) или ацетонитрил (рис. 4).
Выводы
Применение монолитной колонки Chromolith Speed ROD RP-18e позволяет проводить анализ бутилгидрок-сианизола и бутилгидрокситолуола при повышенных скоростях потока подвижной фазы в условиях изокра-тической хроматографии и таким образом сократить время анализа антиоксидантов. Хроматографирование бутилгидроксианизола и бутилги-дрокситолуола на колонке с пентаф-торфенильным сорбентом Supelcosil LC-F также существенно сокращает время анализа антиоксидантов. Хроматографирование на колонке с оптически-активным сорбентом Chiralcel OJ-RH с применением обеспечивает полное разделение 3-и 2-изомеров бутилгидроксианизола.
■
Литература
1. British Pharmacopeia 2009. Monograph: Butylated Hydroxyanisole.
2. United States Pharmacopeia 34 ed. Monograph: Butylated Hydroxyanisole.
3. British Pharmacopeia 2009. Monograph: Butylated Hydroxytoluene.
4. Гузев К.С., Ноздрин В.И. Новые отечественные лекарственные средства с ретиноидами. Москва. ФНПП «Ретиноиды».2003. С. 112.
5. Ноздрин К.В., Великородный А.А., Осипов А.С., Родионова Г. М. Оптимизация условий хроматографирования бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола при совместном присутствии.//Фармация. 2007. № 5. С. 7-10.
6. Ноздрин К. В., Осипов А. С., Родионова Г. М. Применение метода ВЭЖХ с использованием монолитной колонки в анализе антиоксидантов.//Фармация. 2008. № 5. С. 29-31.
7. Ноздрин К.В., Осипов А.С. Применение колонки Supelcosil LC-F для анализа бутилоксианизола и бути-локситолуола.//Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Выпуск 66. Пятигорск 2011. С. 430-432.
8. Осипов А.С., Ноздрин К.В. Применение колонки Nucleodex beta - PM для анализа бутилоксианизола и бутилокситолуола.//Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Выпуск 65. Пятигорск 2010. С. 366-368.
9. Ноздрин К.В., Осипов А.С. Применение колонки Chiralcel OJ-RH для анализа бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола.//Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Выпуск 67. Пятигорск 2012. С. 256-259.
