CC BY
5
Литература
1. Мальцев Г. /О., Васильев А. В. // Вопр. питания. — 1999. - № 2. - С. 41-43.
2. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников: Метод, указания. — М., 2000.
3. Чернышов В. Н. // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 31.
4. Jonas D. А. // Microb. Ecol. H Ith Dis. - 2000. - Vol. 1, N 4. - P. 202-204.
5. Jonas D. A., Antignac E., Antonie J.-M. et al. // Food Chem. Toxicol. - 1996. - Vol. 34. - P. 931-940.
6. Markers of Oxidative Damage and Antioxidant Protection // 1LSI Europe Report Series. — Brussels, 2000. — P. 16-18.
7. Mille G. U J. Biol. Chem. - 1959. - Vol. 244. -P. 502-506.
8. Oxidants, Antioxidants, and Disease Prevention // ILSI Europe Report Series. — Brussels, 2000. — P. 1—4.
9. Tietze N. Y. // Anal. Biochem. - 1969. - Vol. 27. -P. 502-522.
10. Winterbourn С. C. // Clin. Exp. Pharmacol Physiol. — 1995. - Vol. 22, N 3. - P. 877-880.
Поступила 28 09.01
СЛ. В. ХРИПАЧ, 2002 УДК 614.7:615.917:547.84| 099
Л. В. Хрипач
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ДИОКСИНОВ И ФУРАНОВ НА СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ
НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
Полихлорированные дибензо-парадиоксины и ди-бензофураны (ПХДД/Ф) образуются в качестве побочных продуктов при многих технологических процессах, связанных с промышленным синтезом хлорсодержащих органических соединений (прежде всего при производстве пестицидов и гербицидов, лакокрасочных изделий, полихлорвинила), а также при отбеливании бумажной массы, хлорировании воды и низкотемпературной переработке муниципальных отходов [10, 13, 15]. Наиболее опасными источниками поступления этих соединений в окружающую среду являются нарушения технологических процессов и герметичности сооружений для хранения промотходов, а также аварии и пожары на соответствующих предприятиях. Средства массовой информации часто называют ПХДД/Ф суперэкотоксикантами, поскольку они очень медленно выводятся из организма (расчетный период полувыведения наиболее токсичных ПХДД/Ф для человека колеблется от 7 до 10 лет 110, 12, 29); для гепта- и октазамещенных аналогов некоторые фармакокинетические модели предсказывают период полувыведения порядка 100—180 лет [13]) и при этом оказывают полиморфное токсическое действие, вызывая, в частности, иммунодепрессивный и эмбриотокси-ческий эффекты, нарушение гормональной регуляции, увеличение риска возникновения злокачественных новообразований [9, II, 15, 23|. Низкая скорость выведения полихлорированных диоксинов из организма связана с аномально высокими коэффициентами распределения в системе липид—вода (106 и выше) и в то же время с наличием стерических затруднений при окислении этих соединений цитохромом Р-450, особенно при хлорировании в положениях 2, 3, 7 или 8, по которым обычно происходит атака кислородом углеводоров подобного типа [13, 15]. Токсичность рахчичных представителей ПХДД/Ф широко варьирует в зависимости от количества и положения атомов хлора в молекуле вещества; в настоящее время для всех практически значимых аналогов определены и сведены в единую базу данных значения так называемых TEFs (Toxic Equivalency Factors, коэффициентов относительной токсичности по сравнению с наиболее биологически активным 2,3,7,8-тетрахлорди-бензо-парадиоксином (2,3,7,8-ТХДД) [20, 30]. Используя эти коэффициенты, можно рассчитать суммарную токсичность смеси различных ПХДД/Ф в пробах почвы, воды, продуктах питания или образцах крови обследуемых людей в виде токсического эквивалента (TEQ) — соответствующей массы 2,3,7,8-ТХДД.
Одним из наиболее изученных молекулярных механизмов биологического действия диоксинов у лабораторных животных является индукция ими тех изоформ цитохрома Р-450, которые осуществляют окисление наиболее гидро-
фобных ксенобиотиков, в частности бензпирена. В экспериментах на мышах и крысах выявлена хорошая корреляция между относительной токсичностью различных аналогов ПХДД/Ф и их способностью индуцировать цито-хром Р-450 в печени [13, 15, 23, 29]. Популяционные исследования показали, что индукция цитохромов семейства Р-450 выявляется и у контактировавших с диоксинами людей, хотя степень выраженности этого эффекта ниже, чем ожидалось, исходя из экспериментов на грызунах [13, 23]. Достаточно много экспериментальных исследований посвящено также изучению способности диоксинов вызывать в организме лабораторных животных состояние генерализованного оксидантного стресса [7, 8, 14, 25—27|. Оксидантным стрессом называется состояние, при котором в различных тканях происходит выраженное усиление интенсивности свободнорадикальных процессов, опосредованных активными формами кислорода.
При всей оживленности дискуссии по этому поводу вопрос о возможности перенесения полученных данных на человека оставался открытым, поскольку до последнего времени не было опубликовано ни одной работы, предпринятой с целью возможного выявления прооксидантного эффекта диоксинов у людей, имевших контакт с этими соединениями. В данной статье описываются результаты первой попытки изучения интенсивности свободнорадикальных процессов в биологических пробах, отобранных у 45 женщин, имевших различной степени профессиональный или бытовой контакт с диоксинами. Полученные результаты, доложенные ранее на нескольких научных конференциях [5, 17—19], свидетельствуют, что состояние оксидантного стресса является общим для людей и экспериментальных животных биологическим эффектом диоксинов. Более того, интенсивность люминолзависимой хемилюминесцен-ции (ЛЗХЛ) в пробах плазмы крови и слюны обследуемых доноров оказалась связанной с поглощенными дозами ПХДД/Ф простыми линейными зависимостями, что позволяет использовать хемилюминесцентные параметры в качестве маркеров состояния здоровья людей, проживающих в загрязненных диоксинами местностях.
Данное исследование выполнялось в качестве одного из фрагментов медико-биологического обследования состояния здоровья детей и взрослых, проживающих в одном из наиболее загрязненных диоксинами городов России Чапаевске (координатор обследования — доктор мед. наук. Б. А. Ревич, Центр демографии Института народно-хозяйственного прогнозирования РАН). Расположенный на окраине Чапаевска завод по производству сельскохозяйственных удобрений и пестицидов в течение многих лет являлся источником попадания в окружающую среду различных ПХДД/Ф по причинам, связанным с различными технологическими погрешностя-
ми, а также с нарушением правил хранения отходов вследствие износа производственных мощностей. Это привело к тревожному увеличению заболеваемости, в том числе и онкологической, населения города в сравнении со средними показателями по Самарской обл. в целом. При экологическом биомониторинге на территории города был выявлен градиент постепенного снижения степени загрязнения проб почвы диоксинами по мере удаления от завода |24). Эти данные послужили основой для формирования следующих 3 групп жительниц Чапа-евска для углубленного медико-биологического обследования: 1-я — 15 работниц химического завода, имевших профессиональный контакте диоксинами, 2-я — 16 жен-шин, проживающих на расстоянии 1—3 км от завода, 3-я — 14 женщин, проживающих в центре города на расстоянии 5—7 км от завода. Последние 2 группы обследуемых в течение всей своей жизни не имели профессионального контакта с диоксинами. Средний возраст обследованных 31 ± 7 лет. В пробах венозной крови 14 из 45 обследованных было определено содержание различных ПХДД/Ф методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии (анализ проведен Е. С. Бродским и А. Н. Клюевым — сотрудниками НИИ эволюции и экологии животных им. А. Н. Северцова).
Отобранные в Чапаевске образцы венозной крови и смешанной слюны обследованных транспортировали в Москву в специальном контейнере, при температуре'2— 4"С. Длительность транспортировки при этом составляла 1 сут для проб от 31 из 45 обследованных и 2 сут для проб от остальных 14 человек. Сразу после прибытия в Москву часть крови из каждой пробы отбирали для определения величины спонтанного перекисного гемолиза, которое проводили в тот же день. Оставшуюся часть крови и слюну центрифугировали для удаления клеток, после чего образцы плазмы и слюнной жидкости хранили в замороженном состоянии до момента завершения стадии отбора проб. Интенсивность ЛЗХЛ определяли сразу после размораживания соответствующей партии проб, тщательно рандомизированных во избежание артефактов.
Метод перекисного гемолиза [16] дает информацию об устойчивости мембран эритроцитов донора к активным формам кислорода. Источником активных форм кислорода в данной модификации метода является не-скомпенсированный процесс спонтанного метгемогло-бинообразования, ускоряющегося при инкубации эритроцитов в солевой среде без сыворотки.
Методика. К 200 мкл цельной крови добавляли 2,8 мл забуференного физиологического раствора (140 мМ NaCl, 20 мМ Na-фосфатного буфера рН 7,4) и центрифугировали для осаждения клеток. Осадок ресуспендировали в 2,8 мл той же свежей среды По 150 мкл суспензии эритроцитов разливали в пробирки, добавляли по 2,85 мл забуференного физиологического раствора и инкубировали 3 ч при 37°С в водяной бане с шейкером. После осаждения неразрушенных эритроцитов в супернатанте определяли концентрацию гемоглобина при длине волны 409 нм. Величину спонтанного перекисного гемолиза рассчитывали как процентное отношение вышедшего из разрушенных клеток гемоглобина к его исходному содержанию в пробе.
Измерение интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови позволяет определить интенсивность свободнорадикаль-ной реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы или сыворотки крови в ответ на добавление индуктора, в данном случае перекиси водорода [6|. Люми-нол (амино-2,3-дигидро-1,4-фталазин-дион) добавляется при этом в качестве люминесцируюшего индикатора общей концентрации активных форм кислорода в тест-системе. Интенсивность хемилюминесцентного сигнала зависит от соотношения в пробе про- и антиоксидантов; такие патологические состояния, как атеросклероз сосудов, активные аутоиммунные процессы и воспалительные заболевания различной этиологии, сопровождаются усилением ХЛ сыворотки крови донора.
Методика. К 900 мкл инкубационной среды, содержащей 140 мМ Na-фосфатного буфера, 1 мМ Na^-ЭДТА и
I
т
Распределение 3 свободнорадикапьных параметров ок-сидантного статуса в выборке 45 обследованных жительниц Чапаевска (положение медианы, верхнего и нижнего квартилей и диапазон изменения переменных).
/ — интенсивность ЛЗХЛ плазмы крови; 2 — интенсивность ЛЗХЛ слюны; 3 — величина перекисного гемолиза; -inj — трансформированные переменные I и 2(натуральные логарифмы соответствующих значений).
50 мкМ люминола, добавляли 10 мкл сыворотки. Запуск свободнорадикальной реакции производили добавлением 100 мкл 0,2% перекиси водорода (конечная концентрация 6 мМ). Интенсивность ХЛ регистрировали с помощью отечественного люминометра "Биотокс-7", автоматически регистрирующего светосумму сигнала за период между 10 и 20 с после добавления перекиси водорода.
В настоящее время делаются попытки использовать в методе ЛЗХЛ слюнную жидкость вместо сыворотки крови с целью разработки неинвазивного способа оценки окси-дантного статуса организма [1— 3|. Слюна содержит небольшое количество липидов [22|, которые могут служить субстратом индуцированной свободнорадикальной реакции [I |, а также антиоксидантные ферменты (супероксид-дисмутазу и каталазу), антиоксидантные витамины (А, С, Е) и многие биологически активные вещества, известные как модуляторы свободнорадикальных реакций (адреналин, стероиды, серогонин и т. п.). Одним из основных прооксидантных компонентов слюнной жидкости является фермент пероксидаза, секретируемая как нейтрофила-ми слюны, так и клетками слюнных желез [4, 21, 28].
Методика. К 850 мкл инкубационной среды, содержащей 140 мМ Ыа-фосфатного буфера и 50 мкМ люминола, добавляли 50 мкл слюны. Запуск свободнорадикальной реакции производили добавлением 100 мкл 2% перекиси водорода (конечная концентрация 59 мМ). Интенсивность ХЛ измеряли с помощью люминометра "Биотокс-7", автоматически регистрирующего светосумму сигнала за период между 10 и 20 с после добавления перекиси водорода.
Данные, полученные в результате применения 3 вышеописанных методов оценки оксидантного статуса обследованных доноров, обрабатывали статистически с использованием компьютерных программ Statistica v.5.0 и SPSS v.8.0.
На рисунке представлены диаграммы, отображающие положение медианы и характер вариационного размаха для каждого из 3 измеренных свободнорадикальных параметров оксидантного статуса в обследованной выборке 45 жительниц Чапаевска. Эти диаграммы показывают, что для обоих хемилюминесцентных параметров (ЛЗХЛ плазмы и ЛЗХЛ слюны, см. рисунок, / и 2) наблюдалась резкая асимметрия распределения значений переменной в выборке со сдвигом медианы почти до положения нижнего квартиля. Такие переменные при статистической обработке данных принято подвергать логарифмической трансформации, замещая исходные значения соответствующими натуральными логарифмами. При этом, как правило, получаются распределения, близкие к нормальным с точки зрения соответствующих статистических критериев (например, критерия Колмогорова—Смирнова), что позволяет при дальнейшем анализе оперировать не только
Значения коэффициентов линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Снирмсиа, характеризующие степень взаимосвязи между содержанием полнхлорированных дибензо-пара-ди-океннов и дибен юфуранов (ПХДД/ПХДФ) в липилах плазмы крови и свободнорадикальными параметрами оксидантного статуса обследованных доноров (л = 14)
Содержание ПХДД и Интенсивность ЛЗХЛ плазмы крови Интенсивность ЛЗХЛ слюны Спонтанный псрскисный гемолиз
ПХДФ в плазме крови Пирсон (R, Спир-мен (R. Пирсон / и Спир-мен (R. Пирсон (R. Спир-мен
Р) Р) (К. Р) Р) Р) (R .Р)
Общее содер-
жание, пгна
1 г липидов 0,537 0,468 -0,591 -0,591 0,035 0.141
Р 0.048* 0.091 0,026* 0.026* 0,905 0.631
Диоксино-
вый эквива-
лент (ТЕО) 0,446 0,547 -0,608 -0.666 0,067 -0,004
Р 0.110 0.043* 0,021* 0,009* 0,821 0,988
2,3,7,8-ТХДД.
пг на I г ли-
пидов 0,750 0,655 -0,616 -0,641 0,156 0,216
Р 0,002* 0,011* 0,019* 0,013* 0,595 0.459
Примечание. Звездочка — р < 0,05.
непараметрическими критериями, но и их более мощными параметрическими аналогами. В данном случае после применения логарифмической трансформации значения Э-статистики Колмогорова—Смирнова снизились с 0,350 (р < 0,01) до 0,136 (р > 0,20) для ЛЗХЛ плазмы крови и с 0,328 {р < 0,01) до 0,129 (р > 0,20) для ЛЗХЛ слюны, т. е. оба достоверно отличающиеся от нормальных распределений (см. рисунок, / и 2) превратились в близкие к нормальным (см. рисунок, 4 и 5). По отношению к хемилю-минесцентным параметрам процедура логарифмической трансформации имеет также и физический смысл, поскольку свободнорадикальные процессы представляют собой разветвленные цепные реакции с порядком, значительно большим единицы относительно количества точек инициации. Далее мы везде будем оперировать трансформированными переменными, сохранив за ними прежние названия интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови и слюны.
Для анализа зависимости между значениями измеренных свободнорадикальных параметров и поглощенной дозой диоксинов мы располагали данными о содержании диоксинов в липидах плазмы крови для 14 из 45 обследованных женщин (4 работницы химического завода; 6 женщин, проживающих на расстоянии 1—3 км от завода, и 4 женщины, проживающие на расстоянии 1—3 км от завода). В таблице представлены данные соответствующего корреляционного анализа, для которого были использованы коэффициенты линейной корреляции Пирсона (параметрический критерий) и Спирмена (непараметрический ранговый критерий). Как следует из таблицы, интенсивность ЛЗХЛ плазмы крови достоверно коррелирует с содержанием и расчетной токсичностью содержащейся в крови обследованных смеси различных ПХДД/Ф; при этом максимальные коэффициенты корреляции (Л = 0,750; р = 0,002 по критерию Пирсона и Л = 0,655; /> = 0,011 по критерию Спирмена) наблюдаются по отношению к содержанию в крови наиболее активного аналога — 2,3,7,8-ТХДД. О возрастании интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови доноров по мере увеличения риска их контакта с диоксинами свидетельствуют и межгрупповые различия, полученные при обследовании всех 45 доноров. Достоверная корреляция была выявлена между интенсивностью ЛЗХЛ плазмы крови и внутригрупповым риском контакта с диоксинами (Л = 0,378;р = 0,036). Относительные риски при этом оценивались как 413:80:24 для обследованных 1-й (работницы завода), 2-й (1—3 км от завода) и 3-й (5—7 км) групп соответственно, исходя из средних значений диоксинового эквивалента в крови у той части доноров каждой группы, где
эта величина определялась методом масс-спектрометрии. Непараметрический тест Манна—Уитни оценивает степень достоверности различий по интенсивности ЛЗХП плазмы крови между группами доноров с максимальным и минимальным рисками как тенденцию к повышению в 1,5 раза для всех 29 человек (р = 0,150) и достоверное увеличение в 1,6 раза для тех 20 из них, образцы крови которых транспортировались в течение 1 сут (/? = 0,007).
Таким образом, полученные при обследовании жительниц Чапаевска данные об интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови впервые демонстрируют, что диоксины вызывают состояние генерализованного оксидантного стресса в организмах контактирующих с ними людей. Этот эффект был предсказан многочисленными опытами на животных в течение более чем 10 лет, но непосредственно в популяции человека выявлен впервые. Наследственно обусловленный баланс про/антиоксидантных реакций является базовым параметром для самых различных молекулярных и клеточных систем организма человека и животных, таких как мсмбранно-связанные процессы энергообеспечения клеток, элиминации чужеродных соединений, фагоцитоза, иммунного ответа и т. п. Поэтому выявленные дозозависимые изменения этого баланса в сторону преобладания некомпенсированных прооксидантных процессов могут по крайней мере теоретически лежать в основе самых различных нарушений в состоянии здоровья людей, имеющих профессиональный контакте диоксинами или проживающих на загрязненных этими токсикантами территориях.
Устойчивость мембран эритроцитов доноров к окси-дантному повреждению, оцениваемая по величине спонтанного перекисного гемолиза, не имела значимых коэффициентов линейной корреляции ни с содержанием диоксинов в крови (л = 14, см. таблицу), ни с внутри-групповым риском контакта с диоксинами (я = 45, R = -0,029; р = 0,849). Не различались значимо и средние величины перекисного гемолиза для групп доноров, имевших разный риск контакта с диоксинами (1,23 ± 0,52; 1,29 ± 0,67 и 1,23 ± 0,30% для работниц завода и женщин, проживающих на расстоянии 1—3 и 5— 7 км от завода соответственно). С помощью рангового дисперсионного анализа Фридмана удается выявить тенденцию к некоторому увеличению оксидантной стабильности мембран эритроцитов при увеличении риска контакта доноров с диоксинами: сумма рангов 33; 27,5 и 23,5 для 3-й (5—7 км), 2-й (1—3 км) и 1-й (работницы завода) групп соответственно (р < 0,19).
Эти данные свидетельствуют, что адаптационные возможности организма обследованных доноров, имеющих профессиональный контакт с диоксинами, не вполне исчерпаны и позволяют частично компенсировать интенсификацию свободнорадикальных реакций в плазме крови за счет усиленной репопуляции кровяного русла более стабильными юными эритроцитами из костного мозга.
Для интенсивности ЛЗХЛ слюны была выявлена даже более тесная корреляционная связь с содержанием диоксинов в организме доноров (см. таблицу) и внутригрупповым риском контакта с диоксинами (R = -0,477; р = 0,007), чем для интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови, однако направление изменений этого параметра поддей-ствием диоксинов было противоположным. Анализ межгрупповых различий с помощью критерия Манна—Уитни показал, что у обследованных 1-й группы (л = 15) интенсивность ЛЗХЛ слюны была достоверно снижена в 1,5 раза (р < 0,022), по сравнению с обследованными 3-й группы, минимально контактировавшими с диоксинами (л = 14). После удаления из анализа данных для проб с временем транспортировки более 1 сут этот же критерий выявляет еще более выраженное снижение интенсивности ЛЗХЛ слюны у 9 обследованных 1-й группы по сравнению с 11 жительницами центра города — в 2,8 раза (р < 0,003). Как было показано выше, для ЛЗХЛ плазмы крови достоверность различий по критерию Манна— Уитни между 1-й и 3-й группами для всех 29 доноров представляла собой тенденцию с р = 0,150 и только по-
еле удаления из анализа данных для проб с временем транспортировки более 1 сут межгрупповые различия становились достоверными (р = 0,007*). Отсюда следует, что хемилюминесцентные показатели слюны гораздо менее чувствительны к различным организационным накладкам, в той или иной степени практически неизбежным при биомониторинге в отдаленных регионах. Объясняется это тем, что в отличие от крови слюна не содержит легко повреждаемых эритроцитов, а высокое содержание в ней мукопротеидов служит своеобразным консервантом для сохранения целостности эпителиальных клеток и нейтрофилов во время транспортировки проб. Из таблицы следует также, что ЛЗХЛ слюны в целом дает гораздо более стабильные коэффициенты корреляции Пирсона и Спирмена с суммарным содержанием диоксинов и фуранов в крови доноров, чем ЛЗХЛ плазмы крови. Этот факт можно также объяснить лучшей транспортабельностью проб слюны. Таким образом, можно предположить, что информативная ценность этого относительно нового хемилюминесцентного параметра при биомониторинге населения отдаленных регионов даже несколько выше, чем традиционно используемая для оценки оксидантного статуса организма хемшпоми-несценция плазмы или сыворотки крови.
Если считать, что люминолзависимая хемилюминес-ценция плазмы крови и слюны отражает процесс ПОЛ этих 2 биологических жидкостей, то наличие отрицательного знака перед коэффициентами корреляции между ЛЗХЛ слюны и содержанием в крови доноров диоксинов объяснить практически невозможно. Однако, как уже говорилось выше, состав слюнной жидкости существенно отличается от состава плазмы крови высоким содержанием пероксидазы на фоне низкого содержания липи-дов. Вклад пероксидазы в развитие хемилюминесцентного сигнала в ответ на добавление к слюне перекиси водорода настолько высок, что в некоторых работах (например, [211) его полностью отождествляют с активностью пероксидазы в этой биологической жидкости. В норме клетки слюнных желез и взвешенные в слюнной жидкости нейтрофилы примерно поровну участвуют в секреции соответственно миело- и лактопероксидазы в слюну [28]. Не исключено, что под влиянием диоксинов дозозависимо снижается секреторная функция клеток обоих типов — например, если нарушаются какие-то общие механизмы белкового транспорта. Можно также предположить существование более конкретного механизма исходя из общепринятых представлений о том, что длительная гиперфункция клеток и тканей, как правило, сменяется состоянием соответствующей функциональной недостаточности. С этой точки зрения наличие в организме любых трудновыводимых токсичных соединений должно сопровождаться постоянной гиперфункцией фагоцитов, уничтожающих в тканях поврежденные клетки; так как это состояние затягивается на годы, гиперфункция фагоцитов может смениться се запредельным торможением, особенно в пограничной жидкости, в которой нейтрофилы и в отсутствие токсикантов постоянно активированы наличием большого количества микробных клеток. Таким образом, одним из выводов данного исследования является констатация следующего факта: биологический смысл результатов измерения интенсивности ЛЗХЛ плазмы крови и слюны может быть совершенно различным, характеризуя баланс про- и ан-тиоксидантных реакций в 2 различных средах организма. Тем не менее в качестве маркеров изменения состояния организма под действием диоксинов эти хемилюминесцентные параметры равноценны, поскольку каждый из них имеет высокодостоверную корреляционную связь с поглощенной дозой ПХДД/Ф
Таким образом, впервые было продемонстрировано непосредственно в популяционном исследовании, что ПХДД/Ф вызывают состояние генерализованного оксидантного стресса в организмах контактирующих с ними людей. Это подтверждает предположение об одной из ведущих ролей прооксидантного повреждения в механизме
токсического действия диоксинов, сделанное ранее на основании более чем 15-летних экспериментальных исследований влияния диоксинов на баланс оксидантных реакций у грызунов. Наличие достоверных линейных корреляций между интенсивностью ЛЗХЛ биологических жидкостей и поглощенной дозой диоксинов свидетельствует, что хемилюминесцентные параметры могут быть адекватными маркерами состояния здоровья населения при биомониторинге загрязненных диоксинами регионов. При этом неинвазивный метод ЛЗХЛ слюны дает возможность более широкого и экономичного обследования, не уступая по информативности инвазивному методу ЛЗХЛ плазмы или сыворотки крови.
Л итература
1. /Сомова М. В., Луговая Е. М.. Пине/и/с И. С. // Новые методы диагностики и результаты их внедрения в стоматологию. — М., 1991. - С. 123-125.
2. Лукаш А. И., Внуков В. В., Кучеренко А. О. и др. // Физиология человека. — 1997. — № 6. — С. 106— 109.
3. Маник А. П. // Женский и детский организм в горных условиях. — Фрунзе, 1983. — с. 144—145.
4. Ткаченко Е. К. Регуляторная функция и патогенное значение пероксидазы слюны: Автореф. дис.... канд. мед. наук. — М., 1985.
5. Хрипач Л. В., Ревазова Ю. А., Бродский Е. С., Ревич Б. А. // Тезисы докл. 1-го съезда токсикологов России. - М„ 1998. - С. 260.
6. Шее таков В. А.. Бойчевская Н. О., Шерстнев М П. // Вопр. мед. химии. - 1979. - № 2. - С. 132-137.
7. Alsharif N. Z, Lawson Т., Stohs S. J. // Toxicology. — 1994. - Vol. 92. - N 1-3. - P. 39-51.
8. Alsharif N. Z, Schlueter W. J., Stohs S. J. // Arch. En-vironm. Contain. Toxicol. — 1994. — Vol. 26. — P. 392-397.
9. Bertazzi A., Pesatori A. C., Consommi D. et al. // Epidemiology. - 1993. - Vol. 5. - P. 398-406.
10. Flesch-Janys D., Becher //., Gum P. et al. // J. Toxicol. Environm. Hlth. - 1996. - Vol. 47. - P. 363-378.
11. Flesch-Janys D., Steindirf K., Gurn P. et al. // Environm. Hlth Perspect. - 1998. - Vol. 106. - Suppl. 2. -P. 655-662.
12. Geyer H. J., Schramm K.-W., Scheunert /. et al. // Di-oxin'99. Organohalogen Compounds. — 1999. — Vol. 42. - P. 173-176.
13. Grossman J. A., Masten S. A., Walker N. J. et al. // Environm. Hlth Perspect. — 1998. — Vol. 106. - Suppl. 2. - P. 761-775.
14. Hassoun E. A., Witt S. C., Devito M. J. et al. // Toxicol. Sci. - 1998. - Vol. 42. - P. 23-27.
15. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Polychlorinated Dibenzo-Para-Diox-ins and Polychlorinated Dibenzofurans. — Lyon, 1997.
- Vol. 69.
16. Kellogg E. W. 3d, Fridovich I. //J. Biol. Chem. - 1977.
- Vol. 252. - T 19. - P. 6721-6728.
17. Khripach L. V.. Ravazova J. A., Revich B. A. // Environmental Genotoxicology. Field and Human Studies in the Nordic/Baltic Region. - Vilnius, 1999. - P. 69-70.
18. Khripach L. V., Revazova J. A., Revich В. A. I I Pharmacol. and Toxicol. - 1999. - Vol. 85. - Suppl. 1. -P. 10.
19. Khripach L„ Zhurkov V., Revazova J. et al. // Dioxin'99. Organohalogen Compounds. — 1999. — Vol. 42. — p. 445-448.
20. Kimbrough R. D // Teratogen, Carcinogen and Mutagen. - 1997. - Vol. 17. - N. 4-5. - P. 265-273.
21. Kou F„ Takahama U. // Arch. Oral Biol. - 1995. -Vol. 40, N 1. - P. 15-22.
22. Larsson В., Olivecrona G., Ericson T. // Ibid. — 1996. — Vol. 41, N 1. - P. 105-110.
23. Neubert D. // Teratogen, Carcinogen and Mutagen. — 1997-98. - Vol. 17. - N 4-5. - P. 157-215.
24. Re vie h B., Brodsky E., Solskov Y. // Dioxin'99. Organo-halogen. Compounds. - 1999. - Vol. 44. - P. 383.
25. Shertzer H. G., Nebert D. W., Puga A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol. 253. - P. 44-48.
26. Stohs S. J. // Free Radie. Biol. Med. - 1990. - Vol. 9. - N 1. - P. 79-90.
27. Stohs S. J., Hassan M. Q., Murray W. J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - Vol. 111. - P. 854-859.
28. Thomas E. L., Jefferson M. M., Joyner R. E. et al. // J. Dent. Res. - 1994. - N 2. - P. 544-555.
29. Van den Berg M., De Jongh J, Poiger H. et al. I I Crit. Rev. Toxicol. - 1994. - Vol. 24. - P. 1-74.
30. Van den Berg M., Birnbaum L„ Bosveld А. Т. C. et al. // Environm. Hlth Perspect. - 1998. - Vol. 106, N 12. -P. 775-792.
Поступила 10.01.01
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2002 УДК 613.287:616-002.5-078
М. М. Додонов, Э. А. Федотов, И. X. Ягудина, Л. Ф. Зыкин, Ю. А. Попов
ЭКСПЕРТИЗА МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова; Государственное медицинское учреждение "Центр-СПИД", Саратов: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов
В настоящее время повсеместно наблюдается рост заболеваемости туберкулезом. Заболеваемость людей увеличилась с 1993 по 1996 г. на 13%. Ежегодно в мире регистрируется 7—8 млн свежих случаев туберкулеза, погибают 2—3 млн человек, из них 100 тыс. детей [13]. Туберкулезом заболевают ежегодно более 6 млн сельскохозяйственных животных |6[.
По данным Департамента ветеринарии Саратовской обл. МСХ и П на 1998 г., туберкулез распространен в 15 районах области и охватывает 130 неблагополучных пунктов, особенно в Аткарском, Базарно-Карабулак-ском, Екатерининском, Калининском, Петровском, Ртищевском и Энгельсском районах.
При туберкулезе крупного рогатого скота хозяйства несут экономические потери от снижения продуктивности или преждевременного убоя животных, утилизации туш, а также затрат на оздоровление ферм (пастеризация молока, дезинфекция, санитарный ремонт помещений, туберкулинизации).
Очень важную роль играет оздоровление хозяйств от туберкулеза в эпидемиологическом отношении, поскольку больные животные нередко являются источником возбудителя инфекции у людей [7]. Примерно 25% случаев туберкулеза у людей вызывают М. bovis [2, 4] и связаны они с заражением через продукты питания или с контактом с инфицированными животными, поэтому экспертиза продуктов на присутствие микобактерий туберкулеза важна в практическом плане.
Современная лабораторная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота основана на бактериоскопии патологического материала, его бактериологическом исследовании и постановке биопроб.
При бактериоскопии (окраска мазков по методу Ци-ля—Нильсена) положительный результат удается получить при наличии в 1 г (мл) исследуемого материала более 100 тыс. микобактерий, т. е. этот метод малочувствителен. Бактериологические посевы на питательные среды позволяют получить положительный результат при наличии нескольких десятков микобактерий в 1 г (мл) исследуемого материала [5]. Этот метод выявляет мико-бактерии лишь у 50% больных животных, т. е. также недостаточно чувствителен. К тому же он занимает в среднем до 1,5—2 мес, что значительно его обесценивает, особенно в эпизоотологическом плане. Постановка биопроб является дорогостоящим методом и также занимает около месяца.
Появившиеся в 80-х годах методы генодиагностики (ДНК-зонды и полимеразная цепная реакция — ПЦР) значительно повысили качество лабораторной диагностики туберкулеза и имеют явное преимущество перед традиционными методами лабораторной диагностики. ПЦР обладает высокой разрешающей способностью, выявляет единичные клетки микроорганизмов, ее проведение занимает не более 5—6 ч. Кроме того, ПЦР основана
на другом принципе — выявляется геном клетки, а не ее антигены.
ПЦР широко используется в нашей стране для диагностики туберкулеза у людей [1, 4, 8, 9, 12]. Но в ветеринарии этот метод только начинает применяться [10, 11 ] для обнаружения туберкулезных микобактерий в кормах и продуктах животноводства.
Цель нашей работы — исследование молока крупного рогатого скота на наличие микобактерий туберкулеза. Молоко отбирали из неблагополучного по туберкулезу хозяйства — АО "Энгельсское" от положительно реагирующих на туберкулин коров. У крупного рогатого скота не наблюдалось выраженных клинических признаков заболевания или отставания в росте и снижения продуктивности.
Всего было исследовано 64 пробы молока с помощью бактериоскопии, посевов на среды Левенштейна— Йен-сена и Школьниковой с последующей прямой люминесцентной микроскопией после окраски аурамином-рода-мином по методике Прайса |3] и ПЦР (использовали тест-системы "Политуб" производства НПФ "Литех", Москва и "Амплитест" производства ЦНИИ эпидемиологии, Москва).
Перед микроскопией и посевом на питательные среды молоко центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин, осадок обрабатывали 4% серной кислотой и промывали физиологическим раствором. Перед постановкой ПЦР образцы молока обрабатывали согласно инструкции по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса М. tuberculosis и М. bovis методом ПЦР.
Каждый цикл ПЦР состоит из 3 стадий с различными температурными режимами. Для обнаружения микобактерий туберкулеза с помощью тест-системы "Политуб" эти циклы амплификации проводили следующим образом: 5 циклов при условии: — 93°С — 30 с, 93"С — 10 с, 64°С - 10 с, ITC - 20 с и 40 циклов при условии: 93°С -10 с, 62°С - 10 с, ITC - 20 с, ITC - I мин.
Для тест-системы "Амплитест" эти режимы несколько другие: 10 циклов при условии: 95*С — 2 мин, 95°С — 1 мин, 60"С — 1 мин, 72°С — 1 мин и 35 циклов при условии: 95'С - 30 с, 60'С - 30 с, 72'С - 30 с.
В тест-системе "Политуб" для диагностики микобактерий туберкулеза подобрана система праймеров, комплементарных участку гена МРВ 64, позволяющая ам-плифицировать фрагмент, специфичный только для микобактерий туберкулезного комплекса, и не выявляющая атипичные виды микобактерий.
При бактериоскопии и посевах на среду Левенштейна—Иенсена положительных результатов зафиксировано не было. При люминесцентной микроскопии в одной пробе были обнаружены палочки золотисто-оранжевого цвета, что характерно для туберкулезных микобактерий.
