CC BY
88
щих параметрах: энергия ионизирующих электронов — 70 эВ, температура масс-селективного детектора — 173°С, число сканирований в секунду — 1,2, число выборок — 2; напряжение на электронном умножителе — 1635 В; ток эмиссии — 50 мкА. Идентификация органических соединений проведена с помощью библиотечного поиска в библиотеке ЫВБ 54 компьютера и по временам удерживания. Состав воздуха на разном расстоянии от ОАО "Северсталь" приведен в таблице.
Из таблицы видно, что в воздухе в районе размещения предприятия идентифицировано более 70 веществ, в частности 73 соединения на границе промплощздки, 28 на расстоянии 100 ми 14 — 2 км от предприятия. Основную долю (до 22%) в суммарной концентрации идентифицированных органических соединений составлял нафталин. Он обнаружен в концентрациях, превышающих ПДК: на границе промплощадки более чем в 300 раз, на расстоянии 100 м от предприятия до 10 раз. На расстоянии 2 км содержание нафталина в воздухе было ниже ПДК. Однако наряду с нафталином среди органических соединений в воздухе вблизи предприятия в значительных концентрациях выявлены производные нафталина, ароматические углеводороды, азотсодержащие соединения, в частности токсичные нитрилы. Обращает на себя внимание важный в гигиеническом отношении факт: для значительной части обнаруженных соединений не установлены гигиенические нормативы, из чего следует, что их влияние на здоровье населения оставалось бесконтрольным. Следовательно, разработанный хрома-то-масс-спектрометрический метод значительно расширил возможности существующего многокомпонентного метода контроля летучих органических веществ |3] и позволил идентифицировать и количественно определить в воздухе вблизи расположения металлургического предприятия наряду с нафталином более 70 соединений, влияние которых на здоровье населения не контролировалось.
Таким образом, разработаны хромато-масс-спектро-метрический и газохроматографический методы контро-
ля нафталина в воздухе с чувствительностью ниже уровня гигиенического норматива. Для совершенствования аналитического контроля качества атмосферного воздуха целесообразно проводить обзорный анализ методом хро-мато-масс-спектрометрии, ориентированный на расшифровку возможно более полного спектра загрязняющих веществ, и затем на основе оценки выявленного компонентного состава — текущий контроль ведущих компонентов целевым анализом методом газовой хроматографии.
Л итература
1. Быховская М. С., Гинзбург С. Л., Хализова О Д. // Методы определения вредных веществ в воздухе. — М., 1996. - С. 303-305.
2. Исидоров В. А. Органическая химия атмосферы. — Спб, 1992.
3. Малышева А. Г., Растянников Е. Г. // Определение концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе: Сб. метод, указаний. — М., 1997. — С. 217-228.
4. Маната М. Д., Салихджанова Р. М., Яворовская С. Ф. // Современные методы определения атмосферных загрязнений населенных мест. — М., 1980.
- С. 224.
5. Муравьева С. И., Казнина Н. И., Прохорова Е. К. // Справочник по контролю вредных веществ в воздухе. - М„ 1988. - С. 177.
6. Отсон Р., Мак-Маллен Э. // Экологическая химия.
- 1996. - № 5. - С. 49-51.
7. Перегуд Е. А., Гернет Е. В. // Химический анализ воздуха промышленных предприятий. — М., 1965. — С. 44-45.
8. Спенглер Джон // Экологическая химия. — 1994. — № 3. - С. 99-109.
9. Aqency for Toxic Substances and Disease Reqistry. — Atlanta, 1989-1990.
Поступила 15.06.01
С Г. Ю. МАЛЬЦЕВ. Н. В. ТЫШКО. 2002 УДК 614.7:616.153.1:577.152.1931-074
Г. Ю. Мальцев, Н. В. Тышко
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛУТАТИОНА И АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ
Институт питания РАМН. Москва
В настоящее время доказано, что антиоксидант-ная система (АОС) занимает одно из центральных мест при защите организма от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды физической, химической и биологической природы [6, 8, 10]. Определение антиоксидантного статуса широко используется при токсиколого-гигиенической характеристике загрязнителей воды, воздуха, продовольственного сырья и пищевых продуктов. Изучение функционального состояния АОС рекомендуется применять при медико-биологической оценке безопасности новых и генетически модифицированных источников пищи [2, 4, 5].
Как известно, система глутатион—глутатионпе-роксидаза (КФ 1.11.1.9) эритроцитов играет основную роль в обезвреживании гидроперекисей различных соединений эндо- и экзогенной природы, образование которых инициируется гидроксил-ра-дикалом (ОН ). Несмотря на то что в удалении избытка гидроперекисей может принимать участие и каталаза, главную роль в антиокислительной защите играет именно глутатионпероксидазная реак-
ция, скорость которой определяется в свою очередь скоростью регенерации восстановленной формы глутатиона с участием НАДФН, образующегося в пентозофосфатном пути окисления углеводов в эритроцитах.
Несмотря на наличие достаточно хорошо разработанных методик для измерения содержания глутатиона и его форм, а также активности глутатионперок-сидазы (ГП) [3, 7, 9|, имеется необходимость в совершенствовании их определения на малых биохимических анализаторах, в частности на этапе подготовки материала, в схеме сочетания и последовательности добавок реагентов, изменения фермент-субстратных соотношений, выбора режимов и условий работы.
Целью настоящего исследования является совершенствование методов детекции компонентов терминального пероксидазного звена системы антиок-сидантной защиты, включая оптимизацию определения активности ГП за счет сокращения эндогенной составляющей реакции, а также содержание общего глутатиона и его форм. Решение данной задачи наряду с ранее предложенными адаптациями опре-
деления глутатионредуктазы, каталазы и суперок-сиддисмутазы [1| для постоянно расширяющегося парка анализаторов малой производительности с исследовательскими возможностями необходимо для комплексной оценки антиоксидантного статуса.
Исследования проводили на гемолизатах эритроцитов, полученных из гепаринизированной крови в условиях клиники и эксперимента на крысах Вистар. Исходные гемолизаты готовили разведением осажденной при 1500 g в течение 10 мин эрит-роцитной массы дистиллированной водой в соотношении 1:1 с последующей однократной перемо-розкой гемолизата при -15—18°С.
Определение содержания глутатиона в гемолизатах эритроцитов осуществляли в соответствии с ранее принятой схемой определения [9| по образованию комплекса восстановленного глутатиона с реактивом Эллмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)), регистрируемого в области 412 нм (405 нм).
Учитывая то, что часто возникают задачи дифференцированного измерения концентрации глутатиона в плазме и эритроцитах, можно воспользоваться классической процедурой "быстрого" отделения эритроцитов [9] либо подойти к задаче путем определения содержания глутатиона в цельной крови и гемолизатах эритроцитов. В любом случае возникает проблема депротеинизации образцов, поскольку вклад неспецифической компоненты очень значителен.
В отличие от используемого ранее 10% раствора сульфосалициловой кислоты предлагается использовать метафосфорную кислоту в конечной концентрации 2,5%, которая дает лучшие показатели при осаждении фрагментов эритроцитов, а также других тканей, например гомогената печени.
Гемолизат эритроцитов (р = 2) смешивали с 5% метафосфорной кислотой в соотношении 1:1, затем центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин для осаждения белков. Далее реагент 1, состоящий из 0,143 М Na-фосфатного буфера (pH 7,5) с 6,3 мМ ЭДТА^ 0,022 мМ НАДФН, 6,7 межд. ед/мл глутатионредуктазы, смешивали в пропорции 450 мкл : 50 мкл гемолизата (р = 5).
Смесь инкубировали 5 мин при 37°С в измерительных ячейках инкубатора к анализатору ФП-901 (для анализатора "Stat Fax 1904+" объем смеси составляет 1 мл). Оптимальное время выхода реакции на плато, обусловленное полным восстановлением эндогенного глутатиона, можно подобрать с помощью применения кинетического режима работы, который в свою очередь может быть использован для оценки содержания окисленного глутатиона посредством измерения кинетики при стандартных концентрациях окисленного глутатиона.
Далее к 500 мкл смеси добавляли 50 мкл стартового раствора — 0,2 мМ реактива Эллмана, инкубировали и встряхивали еще 1 мин, затем определяли величину абсорбции на фильтре 405 нм. Расчет содержания общего глутатиона проводили стандартной процедурой с коэффициентом экс-тинкции комплекса е,2 = 13,6 мкмоль"1 • см"1 • л или е405 = 1 1 ,3 мкмоль'1 • см"1 - л либо по к&тибро-вочной кривой.
Предложенную методику можно использовать для измерения концентрации общего глутатиона в эритроцитах; содержание восстановленного глутатиона определяется напрямую, достаточно исключить из состава реагента 1 глутатионредуктазу и НАДФН.
Рис. 1. Зависимость содержания общего глутатиона от концентрации гемолизата эритроцитов (средние данные из 7 проб и 3 параллелей).
По оси абсцисс: здесь и на рис. 3 — концентрация гемолизата эритроцитов (в мкл/мл), по оси ординат — содержание общего глутатиона (в ед. опт. плоти).
Определение активности ГП эритроцитов производили в соответствии с принятой для трет-бу-тиловой перекиси — ТБП (С,Н9ООН) схемы: ГП
С4Н9ООН + 2GSH -> С4Н9ОН + GSSG + Н20; ГР
GSSG + 2НАДФН 2GSH + 2НАДФ+.
Перед определением 50 мл 67 мМ Na-фосфат-ного буфера (рН 7,2) с 3 мМ концентрацией ЭДТА-Na2, 0,1% концентрацией тритона Х-100 и 20 мМ азида натрия смешивали с 1 мл 4 мМ НАДФН, 1 мл раствора глутатионредуктазы (> 8 межд. ед/мл). Смесь стабильна 2—3 сут при 2—8°С. Дополнительно перед серией измерений готовили растворы 0,22% ТБП в 70% этаноле и стартовый раствор 8,3 мМ восстановленного глутатиона GSH.
В ходе реакции для анализатора ФП-901 0,49 мл основного раствора смешивали с 0,01 мл гемолизата эритроцитов (р = 20), добавляли 75 мкл раствора субстрата и встряхивали при 37"С. Далее запускали реакцию добавлением 50 мкл раствора восстановленного глутатиона. Время задержки 20 с, время измерения 120 с, длина волны 340 нм, кинетический режим, температура 37°С. Коэффициент экс-тинкции при 340 нм 5,66 мкмоль"'• см-1 - мл. Для анализатора типа "Stat Fax 1904+" объем реакционной среды должен быть увеличен вдвое.
Используемые реактивы: восстановленный глу-татион "Merck", НАДФН "Serva", глутатионредуктаза дрожжей "Sigma" (2500 межд. ед/мл), ТБП в воде "Fluka", дитиобиснитробензойная кислота "Serva".
Для оценки методики измерения концентрации общего глутатиона исследовали зависимость оптической плотности (А) конечного раствора после добавления реактива Эллмана от содержания исходных эритроцитов в гемолизированной среде, выраженную величиной, обратной разведению (в мкл эритроцитов/мл среды). Данные представлены на рис. 1.
Согласно данным рис. 1, зависимость может быть аппроксимирована линейной функцией, практически уходящей к нулю. Оптимальной надежной областью определения можно считать интервал от 0,015 до
0,05 мкл эритроцитов/мл среды. Исследование сходимости по показателю оценочной дисперсии относительно линии регрессии показало, что вариация данных не превышает 15% (отношение среднеоце-ночной дисперсии к средней по ординате). Таким образом, указанная ошибка определения вполне сопоставима с ошибкой при использовании лабораторных средств, в частности дозирующих устройств.
В другом исследовании была изучена зависимость оптической плотности реакции (А/мл) от содержания в среде восстановленного глутатиона "Merck" и типа используемого анализатора (рис. 2).
Соответствующие зависимости также достаточно хорошо аппроксимируются линейными функциями. На основе тщательного анализа установлено, что оптимальной областью определения можно считать область от 0,1 до 0,4 мМ восстановленного глутатиона, что при учете данных работы [9] о содержании общего глутатиона в цельной крови (1,2—1,5 мМ) и плазме (примерно 0,01 мМ) соответствует примерно 40—50-кратному разведению цельной крови и всего 2—3-кратному — плазмы крови.
Сравнительная оценка определения на анализаторах FP-901 и "Stat Fax+" показывает, что первый отличается большей чувствительностью (более крутой характер кривой, стремящейся к нулю (кривая 1). Оценочные величины сходимости по кривой 1 составляют: дисперсия относительно линии регрессии — 0,0235, коэффициент вариации — 10,5%; для кривой 2 — 0,0282 и 12,6% соответственно. Эти же величины примерно соответствуют доверительному коридору разбросов значений, хотя, как известно, в крайних точках области определения значения доверительных коридоров параболически увеличиваются.
Таким образом, предложенная методика определения содержания общего глутатиона либо восстановленного глутатиона с использованием нового депротеинизирующего осадителя, изменением фермент-субстратных отношений и некоторых условий реакции вполне адекватна задачам исследования глутатионового цикла в эритроцитах.
Измерение активности ГП также требует пересмотра некоторых параметров реакции, в частности
Рис. 2. Зависимость содержания общего глутатиона от концентрации восстановленного глутатиона (средние значения 3—4 независимых определений на точку).
По оси абсцисс — концентрация восстановленного глутатиона (в мМ), по оси ординат — содержание общего глутатиона (в А/мл). 1 — FP-901;
2- "Stat Fax 1904+".
Рис. 3. Зависимость активности ГП эритроцитов от концентрации гемолизата эритроцитов (средние данные 3— 4 независимых определений на точку).
По оси ординат — активность ГП эритроцитов (в ДА/мин/мл). 1 —
ТБП; 2 — GSH.
для минимизации уровня эндогенного окисленного глутатиона, что обычно приводит к необоснованно высоким значениям эндогенной реакции (высокие значения пересечения при нулевом содержании материала) и соответственно занижению чувствительности методики. Требуются также уточнения вклада каталазной реакции в пероксидазную реакцию с участием глутатиона в различных условиях.
Установлено, что при входных данных используемого буфера (молярность, рН), блокирование ка-талазы азидом натрия составляет порядка 26—28%.
Исследование зависимости скорости глутатион-пероксидазной реакции (в ДА/мин/мл эритроцитов) от содержания гемолизата показало (рис. 3), что действительно схема запуска реакции стартовым раствором восстановленного глутатиона эффективней, чем ранее предложенная [7] схема запуска субстратом, поскольку она позволяет снизить эндогенную составляющую реакции, заключающуюся в наличии органических веществ — окислителей глутатиона. Несмотря на то что их вклад здесь минимален, обычно принятые временные нормы для прединкубации весьма существенны для наработки окисленного глутатиона, что в последующем значительно маскирует реакцию.
Количественные критерии сходимости результатов в данном исследовании относительно регрессионной прямой показывают, что оценка дисперсии относительно линии 1 составляет 0,00102, коэффициент вариации — 6%; для линии 2 — 0,0012 и 7,06% соответственно. Схожие характеристики получены для анализатора "Stat Fax 1904+".
Таким образом, используемая модификация методики определения активности ГП в применении к анализаторам открытого типа с разной конфигурацией измерительного блока, с изменением фермент-субстратных отношений, последовательности добавок и условий измерения является более чувствительной для измерений основного компонента глутатионового звена, что позволяет точнее проводить оценку их состояния, расширяя возможности для индикации влияния чужеродных веществ на организм.
Литература
1. Мальцев Г. /О., Васильев А. В. // Вопр. питания. — 1999. - № 2. - С. 41-43.
2. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников: Метод, указания. — М., 2000.
3. Чернышов В. Н. // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 31.
4. Jonas D. А. // Microb. Ecol. H Ith Dis. - 2000. - Vol. 1, N 4. - P. 202-204.
5. Jonas D. A., Antignac E., Antonie J.-M. et al. // Food Chem. Toxicol. - 1996. - Vol. 34. - P. 931-940.
6. Markers of Oxidative Damage and Antioxidant Protection // 1LSI Europe Report Series. — Brussels, 2000. — P. 16-18.
7. Mille G. U J. Biol. Chem. - 1959. - Vol. 244. -P. 502-506.
8. Oxidants, Antioxidants, and Disease Prevention // ILSI Europe Report Series. — Brussels, 2000. — P. 1—4.
9. Tietze N. Y. // Anal. Biochem. - 1969. - Vol. 27. -P. 502-522.
10. Winterbourn С. C. // Clin. Exp. Pharmacol Physiol. — 1995. - Vol. 22, N 3. - P. 877-880.
Поступила 28 09.01
СЛ. В. ХРИПАЧ, 2002 УДК 614.7:615.917:547.84| 099
Л. В. Хрипач
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ДИОКСИНОВ И ФУРАНОВ НА СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ
НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
Полихлорированные дибензо-парадиоксины и ди-бензофураны (ПХДД/Ф) образуются в качестве побочных продуктов при многих технологических процессах, связанных с промышленным синтезом хлорсодержащих органических соединений (прежде всего при производстве пестицидов и гербицидов, лакокрасочных изделий, полихлорвинила), а также при отбеливании бумажной массы, хлорировании воды и низкотемпературной переработке муниципальных отходов [10, 13, 15]. Наиболее опасными источниками поступления этих соединений в окружающую среду являются нарушения технологических процессов и герметичности сооружений для хранения промотходов, а также аварии и пожары на соответствующих предприятиях. Средства массовой информации часто называют ПХДД/Ф суперэкотоксикантами, поскольку они очень медленно выводятся из организма (расчетный период полувыведения наиболее токсичных ПХДД/Ф для человека колеблется от 7 до 10 лет [ 10, 12, 29]; для гепта- и октазамещенных аналогов некоторые фармакокинетические модели предсказывают период полувыведения порядка 100—180 лет [ 13]> и при этом оказывают полиморфное токсическое действие, вызывая, в частности, иммунодепрессивный и эмбриотокси-ческий эффекты, нарушение гормональной регуляции, увеличение риска возникновения злокачественных новообразований [9, II, 15, 23]. Низкая скорость выведения полихлорированных диоксинов из организма связана с аномально высокими коэффициентами распределения в системе липид—вода (106 и выше) и в то же время с наличием стерических затруднений при окислении этих соединений цитохромом Р-450, особенно при хлорировании в положениях 2, 3, 7 или 8, по которым обычно происходит атака кислородом углеводоров подобного типа |13, 15]. Токсичность рахчичных представителей ПХДД/Ф широко варьирует в зависимости от количества и положения атомов хлора в молекуле вещества; в настоящее время для всех практически значимых аналогов определены и сведены в единую базу данных значения так называемых TEFs (Toxic Equivalency Factors, коэффициентов относительной токсичности по сравнению с наиболее биологически активным 2,3,7,8-тетрахлорди-бензо-парадиоксином (2,3,7,8-ТХДД) ]20, 30]. Используя эти коэффициенты, можно рассчитать суммарную токсичность смеси различных ПХДД/Ф в пробах почвы, воды, продуктах питания или образцах крови обследуемых людей в виде токсического эквивалента (TEQ) — соответствующей массы 2,3,7,8-ТХДД.
Одним из наиболее изученных молекулярных механизмов биологического действия диоксинов у лабораторных животных является индукция ими тех изоформ цитохрома Р-450, которые осуществляют окисление наиболее гидро-
фобных ксенобиотиков, в частности бензпирена. В экспериментах на мышах и крысах выявлена хорошая корреляция между относительной токсичностью различных аналогов ПХДД/Ф и их способностью индуцировать цито-хром Р-450 в печени ]13, 15, 23, 29]. Популяционные исследования показали, что индукция цитохромов семейства Р-450 выявляется и у контактировавших с диоксинами людей, хотя степень выраженности этого эффекта ниже, чем ожидалось, исходя из экспериментов на грызунах [13, 23]. Достаточно много экспериментальных исследований посвящено также изучению способности диоксинов вызывать в организме лабораторных животных состояние генерализованного оксидантного стресса [7, 8, 14, 25—27|. Оксидантным стрессом называется состояние, при котором в различных тканях происходит выраженное усиление интенсивности свободнорадикальных процессов, опосредованных активными формами кислорода.
При всей оживленности дискуссии по этому поводу вопрос о возможности перенесения полученных данных на человека оставался открытым, поскольку до последнего времени не было опубликовано ни одной работы, предпринятой с целью возможного выявления прооксидантного эффекта диоксинов у людей, имевших контакт с этими соединениями. В данной статье описываются результаты первой попытки изучения интенсивности свободнорадикальных процессов в биологических пробах, отобранных у 45 женщин, имевших различной степени профессиональный или бытовой контакт с диоксинами. Полученные результаты, доложенные ранее на нескольких научных конференциях [5, 17—19], свидетельствуют, что состояние оксидантного стресса является общим для людей и экспериментальных животных биологическим эффектом диоксинов. Более того, интенсивность люминолзависимой хемилюминесцен-ции (ЛЗХЛ) в пробах плазмы крови и слюны обследуемых доноров оказалась связанной с поглощенными дозами ПХДД/Ф простыми линейными зависимостями, что позволяет использовать хемилюминесцентные параметры в качестве маркеров состояния здоровья людей, проживающих в загрязненных диоксинами местностях.
Данное исследование выполнялось в качестве одного из фрагментов медико-биологического обследования состояния здоровья детей и взрослых, проживающих в одном из наиболее загрязненных диоксинами городов России Чапаевске (координатор обследования — доктор мед. наук. Б. А. Ревич, Центр демографии Института народно-хозяйственного прогнозирования РАН). Расположенный на окраине Чапаевска завод по производству сельскохозяйственных удобрений и пестицидов в течение многих лет являлся источником попадания в окружающую среду различных ПХДД/Ф по причинам, связанным с различными технологическими погрешностя-
