CC BY
124
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 259-264.
УДК 674.032.14
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ УРОНОВЫХ КИСЛОТ В ПОЛИСАХАРИДАХ МАТЬ-И-МАЧЕХИ, КЛЕВЕРА, ДЕВЯСИЛА
© А.П. Корж1, А.М. Гурьев1, М.В. Белоусов1, М.С. Юсубов1,2
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, 634052 (Россия), e-mail: [email protected]
2Национальный исследовательский Томский политехнический университет, пр. Ленина, 30, Томск, 634050 (Россия)
Из листьев мать-и-мачехи, корневищ с корнями девясила высокого и травы клевера лугового выделены и разделены на DEAE-целлюлозе полисахаридные комплексы. Установлено, что суммарное содержание кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе из корневищ с корнями девясила - 55,6%; суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот - 44,4%. Суммарное содержание кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе из травы клевера - 87,1%; суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот - 12,9%; кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе из листьев мать-и-мачехи - 48,39%; нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот -51,61%.
Ключевые слова: полисахариды растений, мать-и-мачеха, клевер, девясил, уроновые кислоты.
Введение
В ранее проведенных нами исследованиях было установлено, что водорастворимые полисахариды из листьев мать-и-мачехи, корневищ с корнями девясила высокого и травы клевера лугового проявляют выраженные иммунотропные свойства и перспективны для создания на их основе новых лекарственных средств для лечения атопических заболеваний [1, 2]. Наряду с этим имеются данные о том, что иммуно-тропная активность во многих случаях обусловлена наличием кислых полисахаридов (полиуронидов) [3].
Цель настоящей работы - определение содержания уроновых кислот в полисахаридных фракциях из листьев мать-и-мачехи обыкновенной, травы клевера лугового, корневищ с корнями девясила высокого.
Экспериментальная часть
Растительный материал. В работе использована трава клевера лугового (Trifolium pretense L.), листья мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.), собранные в местах естественного произрастания на территории Томской области и Алтайского края. После сбора растительное сырье высушивалось на воздухе, под навесом, при температуре 15-25 °С в течение 3-10 сут.
Корневища и корни второго года жизни девясила высокого (Inula helenium L.) были собраны в августе-сентябре 2009 г. в Алтайском крае. Выкопанные корни отряхивали от земли, промывали в воде, отрезали стебли и небольшие корни, после чего разрезали на куски длиной 10-15 см и толщиной 1-2 см. Приготовленное сырье провяливали на воздухе и сушили при температуре не выше 40 °С. Высушенные корни снаружи серо-буроватого цвета, на разрезе желтовато-белого цвета.
Общие аналитические методы. Содержание уроновых кислот в ПСК и во фракциях определяли карба-зольным методом (модификация с добавлением сульфаминовой кислоты) [4] с применением градуировочного графика, построенного для галактуроновой кислоты; белка - по методу Лоури [5] с применением градуировочного графика для бычьего сывороточного альбумина, нуклеиновых кислот - по методу Спирина [6].
Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Unico 2800.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Выделение полисахаридного комплекса (ПСК). ПСК выделяли из сырья растений по следующей методике: 20,0 г сырья экстрагировали раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной НС1 (pH = 4,0) при соотношении сырье : экстрагент - 1:20, при нагревании на кипящей водяной бане и периодическом перемешивании в течение 3 ч. После отделения частиц сырья путем фильтрования через многослойный тканевый фильтр фильтрат упаривали на роторном испарителе при температуре не более 50 °С до 1/5 от исходного объема. К полученному раствору добавляли троекратный объем 96% этанола и отстаивали 24 ч при температуре 2-4 °С, затем осадок отфильтровывали через бумажный фильтр и растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Нерастворившийся остаток, представляющий собой мельчайшие частицы сырья и денатурированный белок, отделяли центрифугированием (4000 об/мин, в течение 30 мин). Центрифугат диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа в течение 48 чв 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали.
Ионообменная хроматография на DEAE-цeллюлoзe. Навеску ПСК (300 мг) растворяли в воде (20 мл) и наносили на колонку (24*2,5) с БЕАЕ-целлюлозой. В качестве элюента использовали растворы №С1 по 100 мл каждой молярности (0,01; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 и 1 М) №С1 (скорость 46 мл/ч, отбор фракций по 20 мл). Полисахариды в растворе обнаруживали по положительной реакции с фенолом в концентрированной серной кислоте [7]. Для удаления низкомолекулярных веществ использовали метод ультрафильтрации [8].
Определение содержания уроновых кислот (УК) в ПСК и во фракциях. 0,025 г (т.н.) ПСК (полисахаридной фракции) помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 10 мл воды очищенной и перемешивают до растворения ПСК (фракции), далее доводят до метки водой очищенной (раствор А).
В две пробирки помещают по 0,01 мл 4 М сульфаминовой кислоты. В первую пробирку прибавляют
0,25 мл раствора А (анализируемый раствор), во вторую 0,25 мл воды очищенной (раствор сравнения). Пробирки с содержимым тщательно перемешивают, затем при 0-2 °С по стенке пробирки медленно добавляют 1,5 мл раствора натрия тетрабората в серной кислоте, охлажденного до 40 °С, перемешивают, нагревают на кипящей водяной бане 6 мин, затем пробирки остужают до комнатной температуры, добавляют по
0,05 мл 0,2% раствора карбазола, тщательно перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Далее пробирки с содержимым охлаждают до комнатной температуры.
Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют относительно раствора сравнения при длине волны 535±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в интервале от 0,001 до 0,05%. Определяемый минимум 0,01 мг/мл в пересчете на галактуроновую кислоту. Содержание уроновых кислот в ПСК и во фракциях (X) вычисляют по формуле
Cx х 25 х 1,81x100%
X —--------------------,
0,025 х 0,25 х 1000
где Сх - количество УК, найденное по градуировочному графику, мг/мл; 25, 1,81 - разведения; 0,25 - объем анализируемого раствора, взятый для анализа, мл; 0,025 - точная масса ПСК (полисахаридной фракции), г; 1000 - перевод гр. в мг.
Построение градуировочного графика для галактуроновой кислоты. Около 0,05 г (точная навеска) галактуроновой кислоты (Sigma-A1drich СИете вшЪН, Германия) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 10 сут. Готовят серию растворов галактуроновой кислоты с постепенно возрастающей концентрацией (0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мг/мл). В пробирки помещают по 0,25 мл каждого из разведений галактуроновой кислоты, добавляют по 0,01 мл 4 М сульфаминовой кислоты, тщательно перемешивают. Затем при 0-2 °С по стенке пробирки медленно добавляют 1,5 мл раствора натрия тетрабората в серной кислоте, охлажденного до 40 °С, перемешивают, нагревают на кипящей водяной бане 6 мин, затем пробирки остужают до комнатной температуры, добавляют по 0,05 мл 0,2% раствора карбазола, тщательно перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Далее пробирки с содержимым охлаждают до комнатной температуры.
Измеряют оптическую плотность каждого из приготовленных растворов галактуроновой кислоты при Х535 и строят график зависимости Б = f (С).
Обсуждениерезулътатов
ПСК из травы T. pratense, листьев T. farfara, корневищ с корнями I. helenium получали экстракцией горячей водой с последующим осаждением полисахаридов 96% спиртом этиловым и диализом через полупроницаемую мембрану. Выход ПСК и их характеристика представлены в таблице.
Как видно из таблицы, в ПСК T. pretense содержание белка не превышает 1%, НК находятся в следовых количествах (0,018%), наряду с этим наблюдается высокое содержание УК (74,64%). В ПСК T. farfara выявленные количества белка (0,16%) и НК (0,029%); содержание УК более 20%. В ПСК I. helenium отмечено содержание белка около 1% и минорные количества НК; содержание УК около 50%. Содержание небольших количеств белка и НК говорит о достаточно хорошей очистке ПСК растений при их получении (диализ, повторное переосаждение 96% этанолом).
Полученные ПСК из указанных растений были подвергнуты дальнейшему фракционированию с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. В результате получены по 32 водорастворимые полисахаридные фракции, выход которых представлен на рисунках 1-3.
Как видно из рисунка 1, преобладающими компонентами ПСК I. helenium являются 6 фракций: ПС-17, ПС-19, ПС-23, ПС-25, ПС-28, ПС-30. Они были получены при элюировании 0,3; 0,3; 0,4; 0,4; 0,5; 0,5 М растворами NaCl соответственно. Фракции I. helenium представляют собой белые пористые массы.
Из рисунка 2 следует, что преобладающими компонентами ПСК T. pratense являются 5 фракций: ПС-1, ПС-15, ПС-20, ПС-24, ПС-29, Они были получены при элюировании 0,01; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 М растворами NaCl соответственно. Фракции T. pretense представляют собой белые пористые массы.
На рисунке 3 показано, что преобладающими компонентами ПСК T. farfara являются 6 фракций: ПС-2, ПС-8, ПС-15, ПС-20, ПС-24, ПС-30, Они были получены при элюировании 0,01; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 М растворами NaCl соответственно. Фракции T. farfara представляют собой белые пористые массы.
Для выяснения природы ПСК растений было определено содержание УК во фракциях (рис. 4-6).
Как видно из рисунка 4, преобладающие компоненты ПСК I. helenium (ПС-17, ПС-19, ПС-23, ПС-25, ПС-28, ПС-30) содержат в своем составе 58,7; 54,73; 45,07; 21,04; 2,7; 1,13% УК соответственно. Таким образом, фракции ПС-17, ПС-19, ПС-23, ПС-25 можно отнести к кислым полисахаридам; ПС-28, ПС-30 - к полисахаридам с низким содержанием УК и/или нейтральным полисахаридам. Кроме того, в составе ПСК
I. helenium содержатся компоненты с высоким содержанием УК (более 50%). Это ПС-14 (55,86%); ПС-15 (54,11%); ПС-20 (70,95%); ПС-22 (87,86%); ПС-24 (54,86). Учитывая, что фракции ПС-14 и ПС-15 элюировались 0,2 М раствором NaCl и содержат практически одинаковое количество УК, мы предполагаем, что они представляют собой одно вещество с содержанием УК 54,99±0,86%.
Преобладающие компоненты ПСК T. pratense (ПС-1, ПС-15, ПС-20, ПС-24, ПС-29) содержат в своем составе 13,31; 16,44; 40,99; 48,98; 13,24% УК соответственно (рис. 5). Таким образом, ПС-20 и ПС-24 можно отнести к фракциям с высоким содержанием УК (более 40%). Также в составе ПСК T. pretense содержатся компоненты с высоким содержанием уроновых кислот (более 50%) - это ПС-17 (63,66%); ПС-18 (64,01%); ПС-19 (92,81%); ПС-21 (67,04%); ПС-25 (51,25%). Учитывая, что фракции ПС-17 и ПС-18 элюировались
0,3 М раствором NaCl и содержат практически одинаковое количество УК, мы предполагаем, что они представляют собой одно вещество с содержанием УК 63,84±1,43%.
На рисунке 6 показано, что преобладающие компоненты ПСК T. farfara (ПС-2, ПС-8, ПС-15, ПС-20, ПС-24, ПС-30) содержат в своем составе 1,13; 2,49; 1,02; 13,14; 4,4% УК соответственно. Эти фракции можно отнести к фракциям с низким содержанием УК. В составе ПСК T. farfara также найдены компоненты с высоким содержанием уроновых кислот (более 50%) - это ПС-19 (53,85%); ПС-20 (57,64%); ПС-21 (53,13%); ПС-22 (52,74%). Они элюировались 0,3; 0,3; 0,4; 0,4 М растворами NaCl соответственно. Так как фракции ПС-19, ПС-20, ПС-21, ПС-22 имеют практически одинаковое количество УК, мы предполагаем, что они представляют собой одно вещество с содержанием УК 54,35±1,87%.
Выход ПСК из T. pretense, T. farfara, I. helenium
№ Наименование Выход ПСК в пересчете на Содержание Содержание НК, Содержание УК,
п/п ЛРС воздушно-сухое сырье, % белка, % % %
1 T. pratense 1,5±0,1% 0,56±0,01% 0,018±0,001% 74,64±0,23%
2 T. farfara 3,25±0,03% 0,16±0,01% 0,029±0,002% 26,35±0,19%
3 I. helenium 3,5±0,1% 1,02±0,03% 0,016±0,0011% 51,75±0,23%
фракции
фракции
фракции
фракции
Рис. 1. Выход полисахаридных фракций I. Не1етит при хроматографии на БЕАЕ-целлюлозе (по оси абсцисс -номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процент от лиофильно высушенной фракции водорастворимых полисахаридов, нанесенной на колонку)
Рис. 2. Выход полисахаридных фракций T. pretense при хроматографии на DEAE-целлюлозе (по оси абсцисс -номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процент от лиофильно высушенной фракции водорастворимых полисахаридов, нанесенной на колонку)
Рис. 3. Выход полисахаридных фракций Т./аг/ага при хроматографии на БЕАЕ-целлюлозе (по оси абсцисс -номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процент от лиофильно высушенной фракции водорастворимых полисахаридов, нанесенной на колонку)
Рис. 4. Содержание уроновых кислот в полисахаридных фракциях I. кеїепіит (по оси абсцисс - номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процентное содержание уроновых кислот в пересчете на галактуроновую кислоту)
Рис. 5. Содержание уроновых кислот в полисахаридных фракциях T. pretense (по оси абсцисс - номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процентное содержание уроновых кислот в пересчете на галактуроновую кислоту)
Рис. 6. Содержание уроновых кислот в полисахаридных фракциях Т./аг/ага (по оси абсцисс - номер полисахаридной фракции, по оси ординат - С, процентное содержание уроновых кислот в пересчете на галактуроновую кислоту)
Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает 5%.
Таким образом, суммарное содержание кислых полисахаридов в ПСК I. helenium составило 55,6%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием УК (менее 10%) в ПСК I. helenium составило 44,4%.
Суммарное содержание кислых полисахаридов в ПСК T. pretense составило 87,1%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием УК в ПСК T. pretense - 12,9%.
Суммарное содержание кислых полисахаридов в ПСК T. farfara равно 48,39%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием УК в ПСК T. farfara -51,61%.
Выводы
1. Определено содержание уроновых кислот в полисахаридном комплексе из корневищ с корнями
I. helenium. Суммарное содержание кислых полисахаридов составило 55,6%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот (менее 10%) - 44,4%.
2. Определено содержание уроновых кислот в полисахаридном комплексе из травы T. pretense. Суммарное содержание кислых полисахаридов составило 87,1%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот (менее 10%) - 12,9%.
3. Определено содержание уроновых кислот в полисахаридном комплексе из листьев T. farfara. Суммарное содержание кислых полисахаридов составило 48,39%, а суммарное содержание нейтральных полисахаридов и/или полисахаридов с низким содержанием уроновых кислот (менее 10%) - 51,61%.
Список литературы
1. Данилец М.Г., Гурьев А.М., Вельская Н.В., Белоусов М.В. и др. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтетазу и аргиназу макрофагов мыши // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. Т. 25, №2. С. 49-50.
2. Данилец М.Г., Вельская Н.В., Вельский Ю.П. и др. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию иммуноглобулинов классов E и G1 лимфоцитами мышей, сенсибилизированных овальбумином // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т. 146, №11. С. 520-522.
3. Моисеева Г.Ф., Беликов В.Г. Иммуностимулирующие полисахариды высших растений // Фармация. 1992. №3. С. 79-84.
4. Bitter T., Muir H.M A modified uronic acid carbazole reaction // Anal. Biochem. 1962. V. 4. Pp. 330-334.
5. Lowry O., Rosenbrogh N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin reagent // I. Biol. Chem. 1951. V. 1. Pp. 265-275.
6. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. С. 656-662
7. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. Pp. 350-356.
8. Sanz M.L. et al. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1153. Pp. 74-89.
Поступило в редакцию 8 ноября 2011 г.
