Научная статья на тему 'Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи'

Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY
167
36
Поделиться
Ключевые слова
ПОЛИСАХАРИДЫ РАСТЕНИЙ / УРОНОВЫЕ КИСЛОТЫ / НЕЙТРАЛЬНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Корж Анна Петровна, Гурьев А. М., Белоусов М. В., Юсубов М. С., Белянин М. Л.

Изучен состав водорастворимых полисахаридов листьев мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.), обладающих противоаллергическими свойствами. Показано, что данный полисахаридный комплекс состоит из галактуронана I (33%) и нейтральных полисахаридов (67%).The composition of water-soluble polysaccharides of the leaves Tussilago farfara L., possessing anti-allergic properties. It is shown that the polysaccharide complex consists of galacturonan I (33%) and neutral polysaccharides (67%).

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Корж Анна Петровна, Гурьев А.М., Белоусов М.В., Юсубов М.С., Белянин М.Л.,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи»

Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

Корж А.П.1, Гурьев A.M.1, Белоусов М.В.1, Юсубов М.С.1'2, Белянин М.А.2

Monosaccharide composition of leaves Tussilago farfara the polysaccharide complex

Korzh A.P., Guriyev A.M., Belousov M.V., Yusubov M.S., Belyanin M.L.

1 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

2 Томский политехнический университет, г. Томск

© Корж А.П., Гурьев A.M., Белоусов M.B. и др.

Изучен состав водорастворимых полисахаридов листьев мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.), обладающих противоаллергическими свойствами. Показано, что данный полисахаридный комплекс состоит из галактуронана I (33%) и нейтральных полисахаридов (67%).

Ключевые слова: полисахариды растений, Tussilago farfara, уроновые кислоты, нейтральные полисахариды.

The composition of water-soluble polysaccharides of the leaves Tussilago farfara L., possessing anti-allergic properties. It is shown that the polysaccharide complex consists of galacturonan I (33%) and neutral polysaccharides (67%).

Key words: plant polysaccharides, Tussilago farfara, uronic acids, neutral polysaccharides.

УДК 615.322.074:547.455/.458:582.998.1

Введение

Мать-и-мачеха (Tussilago farfara L.) семейства As-teraceae — многолетнее травянистое растение высотой 10—25 см. Распространена мать-и-мачеха по всей европейской части России, на Кавказе, в Сибири, горных районах Казахстана и Средней Азии. Растет на глинистой почве на полях и в оврагах [3].

Листья мать-и-мачехи содержат горькие гликози-ды (до 2,63%), полисахариды, ситостерин, галловую, яблочную и винную кислоты, сапонины, каротиноиды (5,18%), аскорбиновую кислоту (5 мг%), инулин и др. [4, 5, 8]. Углеводные цепи полисахаридов этого растения содержат остатки гликуроновых кислот, арабино-зы, галактозы, рамнозы, ксилозы, глюкозы и маннозы. В качестве нейтральных моносахаридов в их состав входят рамноза, арабиноза и галактоза [7].

В ранее проведенных исследованиях установлено, что водорастворимые полисахариды листьев мать-и-мачехи проявляют выраженные иммунотропные свойства и перспективны для терапии иммуноглубулин E-зависимых заболеваний (атопического дерматита, бронхиальной

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

астмы, атопического ринита, крапивницы, пищевых аллергий и др.) [2]. Наряду с этим известно, что химическая структура полисахаридов природного происхождения тесно связана с их биологическими свойствами.

Цель настоящей работы — изучение мономерного состава комплекса водорастворимых полисахаридов листьев мать-и-мачехи.

Материал и методы

В работе использованы листья мать-и-мачехи (Tussilago farfara Ь.), собранные в местах естественного произрастания на территории Томской области и Алтайского края в 2009—2010 гг. После сбора растительное сырье высушивали на воздухе, под навесом, при температуре 15—25 °С в течение 3—10 сут.

Полисахаридный комплекс (ПСК) выделяли из растительного сырья по следующей методике: 20 г листьев мать-и-мачехи экстрагировали раствором 2 мл концентрированной кислоты хлористо-водородной в 400 мл воды очищенной (рН 4,0) при соотношении сырья и экстрагента, равном 1 : 20 при нагревании на кипящей

водяной бане и периодическом перемешивании в течение 3—4 ч. После отделения частиц сырья путем фильтрования через многослойный тканевый фильтр фильтрат упаривали на роторном испарителе при температуре не более 50 °С до 1/5 от исходного объема. К полученному раствору добавляли трехкратный объем 96%-го спирта этилового и отстаивали 24 ч при температуре 2—4 °С, затем осадок отфильтровывали через бумажный фильтр и растворяли в 100 мл воды очищенной при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Нерастворившийся остаток, представляющий собой мельчайшие частицы сырья и денатурированный белок, отделяли центрифугированием (4 000 об/мин в течение 30 мин). Центрифу-гат диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа (Orange Scientific, Бельгия) в течение 48 ч в 5 л воды очищенной с добавлением 0,01%-го раствора натрия азида в качестве консерванта при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали.

Содержание уроновых кислот (УК) в ПСК определяли спектрофотометрическим методом по реакции с карбазолом (модификация c добавлением кислоты сульфаминовой) с применением градуировочного графика, построенного для кислоты галактуроновой [10]. Содержание белка определяли по методу Лоури с применением градуировочного графика для бычьего сывороточного альбумина [12]. Содержание нуклеиновых кислот устанавливали методом Спирина [9]. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Unico 2800 (США).

Разделение ПСК на фракции проводили на колонке с DEAE-целлюлозой (Servacelle DEAE-52, США). Навеску ПСК (0,3 г) растворяли в воде очищенной (25 мл) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч, далее центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 30 мин. Полученный раствор наносили на колонку (24 х 2,5 см) с DEAE-целлюлозой. Колонку последовательно промывали растворами натрия хлорида с возрастающей концентрацией — 0,01; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 моль. Скорость элюента 46 мл/ч, отбирали фракции по 20 мл. Наличие полисахаридов во фракциях детектировали по положительной реакции с фенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [11]. Фракции концентрировали на концентраторах Vivaspin 20 (Sarto-rius, Германия) с диаметром пор 5 кДа до 0,5—1,0 мл

при 5 000 об/мин, промывая 2—3 раза водой очищенной, после чего лиофилизировали и взвешивали.

Кислотный гидролиз: 3—5 мг полисахаридной фракции нагревали в запаянной ампуле 5 ч при температуре 100 °С с 1 мл кислоты трифторуксусной (ТФУ) концентрацией 2 моль, содержащей миоинозит (0,3 мг) в качестве внутреннего стандарта. Трифторуксусную кислоту удаляли многократным упариванием досуха с добавлением метанола.

Получение триметилсилильных (ТМС) производных моносахаридов: к полученной в результате кислотного гидролиза смеси моносахаридов добавляли 80 мкл безводного пиридина, смесь выдерживали в сушильном шкафу при температуре 50 °С в течение 20 мин. Затем добавляли 30 мкл N-триметилсилилимидазола (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия), смесь выдерживали в сушильном шкафу при температуре 70 °С в течение 40 мин. К полученной смеси ТМС-производных добавляли 1 мл гексана, интенсивно взбалтывали. После расслоения смеси верхний слой (сумма ТМС-производных) отбирали.

Полученные ТМС-производные моносахаридов анализировали на хроматографе Agilent 7890A с масс-селективным детектором Agilent 5975С, капиллярной колонкой HP5MS (30 м х 0,25 мм), газ-носитель — гелий (скорость потока 1 мл/мин). Температурный режим: 80 °С (1 мин) ^ 220 °С (2 мин) ^ 310 °С. Температура испарителя — 280 °С. Количество вводимой пробы — 1 мкл.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом с определением среднего арифметического X и ошибки среднего т. Достоверность результатов оценивали параметрически по ¿-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Полученный из листьев мать-и-мачехи ПСК представляет собой белую пористую массу, медленно растворимую в воде с образованием вязкого раствора. Выход ПСК составляет (3,25 + 0,05)% в пересчете на абсолютно-сухое сырье. Содержание УК в ПСК — (26,35 + 0,19)%, белка — (0,16 + 0,01)%, нуклеиновых кислот — (0,029 + 0,001)%.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Для выяснения природы водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи ПСК был подвергнут колоночной ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе (Cl-форма). В результате ступенчатого элюирования

Корж А.П., Гурьев A.M., Белоусов М.В. и др. Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

растворами натрия хлорида получено 32 фракции, из которых выбирали шесть основных фракций с наибольшим выходом: РБТ-1, РБТ-2, РБТ-3, РБТ-4, РБТ-5, РБТ-6. Полученные полисахаридные фракции были охарактеризованы по содержанию белка и уроновых кислот, которое устанавливали спектрофотометрическим методом. Характеристика полученных фракций представлена в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика фракций полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи по результатам спектрофотометрического анализа

Фракции ПСК Выход, % от массы ПСК Содержание во фракциях, %

УК белка

PST-1 18,34 ± 1,36 1,13 ± 0,02 0,91 ± 0,02

PST-2 13,29 ± 0,23 2,60 ± 0,03 0,95 ± 0,02

PST-3 17,29 ± 2,17 1,02 ± 0,02 1,21 ± 0,01

PST-4 31,83 ± 1,07 57,69 ± 0,10 0,90 ± 0,03

PST-5 8,05 ± 0,25 3,14 ± 0,03 0,81 ± 0,02

PST-6 8,78 ± 0,85 4,40 ± 0,01 0,47 ± 0,01

Установлено, что все фракции содержат незначительные количества белка (0,47—1,21%) (табл. 1). Минорные количества УК (от 1,13 до 4,40%), установленные во фракциях РБТ-1, РБТ-2, РБТ-3, РБТ-5, РБТ-6 (табл. 1), указывают на то, что преобладающими компонентами ПСК листьев мать-и-мачехи являются нейтральные полисахариды. Суммарный выход этих фракций от массы ПСК, нанесенного на колонку с БЕЛЕ-целлюлозой, составляет 67%. Фракция РБТ-4 характеризуется высоким содержанием УК (около 58%). Выход этого полисахарида от массы

ПСК, нанесенного на колонку с БЕЛЕ-целлюлозой, составляет 33%.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Изучение мономерного состава фракций методом хромато-масс-спектрометрии показало, что фракции РБТ-1, РБТ-2, РБТ-3, РБТ-4, РБТ-5 и РБТ-6 отличаются друг от друга как по природе мономерных звеньев, так и по их соотношению (табл. 2). Гидролизат полисахарида РБТ-1 состоит преимущественно из галактозы, арабинозы и рамнозы в соотношении 3,9 : 3,2 : 1, а манноза и ксилоза содержатся в минорном количестве. Гидролизат полисахарида РБТ-2 состоит из галактозы, арабинозы, рамнозы, маннозы и глюкозы в соотношении 3,6 : 3,1 : 2,5 : 2,2 : 1. Гидролизат РБТ-3 состоит преимущественно из галактозы, глюкозы и арабинозы в соотношении 3,7 : 1,5 : 1,0. Таким образом, в основе структуры фракций РБТ-1, РБТ-2, РБТ-3, вероятно, лежит арабиногалактан. Указанные фракции отличаются друг от друга содержанием рамнозы, ман-нозы и глюкозы. Гидролизат фракции РБТ-4 состоит из рамнозы, галактозы и Б-галактуроновой кислоты в соотношении 1,75 : 1,2 : 1,0. Учитывая результаты анализа и опираясь на теорию о строении пектиновых веществ [6], можно предположить, что по химической структуре фракция РБТ-4 представляет собой рамно-галактуронан I. Гидролизат РБТ-5 состоит только из рамнозы и, вероятно, представляет собой рамнан. Полисахарид РБТ-6 состоит преимущественно из галактозы и рамнозы в соотношении 2 : 1 и по химической структуре, вероятно, является галакторамнаном.

Таким образом, установлено, что полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи состоит из рамно-галактуронана I (33%) и нейтральных полисахаридов (67%), которые представлены суммой арабиногалакта-на, рамнана и галакторамнана.

Таблица 2

Мономерный состав полисахаридных фракций листьев мать-и-мачехи по результатам хромато-масс-спектрометрии

Фракции ПСК Относительное содержание, %

Gal A Rha Ara Xyl Gal Man Glu

PST-1 0 11,90 38,08 1,02 46,41 2,59 0

PST-2 0 19,98 24,86 0 29,58 17,48 8,11

PST-3 0 4,33 14,49 0 53,24 6,14 21,81

PST-4 25,20 44,16 0 0 30,63 0 0

PST-5 0 100,00 0 0 0 0 0

PST-6 0 27,02 7,10 0 57,62 0 8,26

Примечание. Gal A — кислота галактуроновая, Rha — рамноза, Ara — арабиноза, Xyl — ксилоза, Gal — галактоза, Man — манноза, Glu — глюкоза.

Заключение

Выход полисахаридного комплекса, выделенного из листьев мать-и-мачехи, составляет (3,25 + 0,05)%.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

При изучении компонентного состава полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи установлено, что он состоит из двух основных компонентов: рамно-галактуронана I (33%) и нейтральных полисахаридов (67%), представленных суммой арабиногалактана, рам-нана и галакторамнана.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг. (ГК 02.740.11.5211, шифр заявки «2010-15-000-010 ».

Литература

1. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1987. Вып. 1. 337 с.

2. Данилец М.Г., Гурьев A.M., Вельская Н.В. и др. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтетазу и аргиназу макрофагов мыши // Вестн. Ур. мед. акад. науки. 2009. № 2 (25). С. 49-50.

3. Ильина T.A. Большая иллюстрированная энциклопедия лекарственных растений. М.: Эксмо, 2008. 320 с.

4. Лебеда А.Ф., Джуренко Н.И., Исайкина А.П., Собко В.Г. Лекарственные растения. Самая полная энциклопедия. М.: АСТ-пресс Книга, 2004. 912 с.

5. Мазнев Н.И. Большая энциклопедия высокоэффективных лекарственных растений. М.: Эксмо, 2007. 656 с.

6. Оводов Ю.С. Современные представления о пектиновых веществах // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35, № 3. С. 293-310.

7. Полле А.Я., Оводова Р.Г., Попов С.В. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного // Химия раст. сырья. 1999. № 1. С. 27-32.

8. Сафонов Н.Н. Полный атлас лекарственных растений. М.: Эксмо, 2009. 312 с.

9. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. C. 656-662.

10. Bitter T., Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction // Anal. Biochem. 1962. V. 4. P. 330-334.

11. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. and al. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

12. Lowry O, Rosenbrogh N., Farr A. and al. Protein measurement with the Folin reagent // I. Biol.Chem. 1951. V. 1. P. 265-275.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Поступила в редакцию 10.04.2011 г. Утверждена к печати 01.06.2011 г.

Сведения об авторах

А.П. Корж — аспирант кафедры фармации ФПК и ППС СибГМУ (г. Томск).

A.M. Гурьев — канд. фарм. наук, докторант кафедры фармации ФПК и ППС СибГМУ (г. Томск).

М.В. Белоусов — д-р фарм. наук, зав. кафедрой фармации ФПК и ППС СибГМУ (г. Томск).

М.С. Юсубов — д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой химии СибГМУ, профессор кафедры органической химии и органического синтеза ТПУ (г. Томск).

М.Л. Белянин — канд. хим. наук, доцент кафедры органической химии и органического синтеза ТПУ (г. Томск). Для корреспонденции

Корж Анна Петровна, тел. 8-903-950-0015; e-mail: floristic@list.ru