CC BY
112
УДК 674.032.14/547.458
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ ТРАВЫ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (TRIFOLIUM PRATENSE L.)
© А.П. Корж1', А.М. Гурьев1, М.В. Белоусов1, М. С. Юсубов1,2
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2, Томск, 634052 (Россия)
2Национальный исследовательский Томский политехнический университет, пр. Ленина, 30, Томск, 634050 (Россия), e-mail: [email protected]
из травы клевера лугового водной экстракцией с последующим осаждением этанолом и диализом через полупроницаемую мембрану выделены водорастворимые полисахариды, которые стандартизованы по содержанию уроновых кислот, белка и нуклеиновых кислот. Проведено фракционирование водорастворимых полисахаридов на DEAE-целлюлозе и установлено, что они состоят из 5 основных компонентов (PS62-1 - PS62-5), представляющих собой сумму кислых и нейтральных полисахаридов.
Ключевые слова: клевер луговой, водорастворимые полисахариды, DEAE-целлюлоза.
Введение
Клевер луговой (Trifolium pratense L.) относится к семейству бобовых (Fabaceae). Это многолетнее травянистое растение высотой 15-50 см, произрастает во всех степных, лесостепных и лесных районах, а также в полярно-арктической области, на суходольных и пойменных лугах, лесных вырубках и полянах, в разреженных березовых лесах и сосновых борах, по лесным опушкам, иногда около жилья, по окраинам полей, вдоль полевых и лесных дорог [1].
Данное растение широко используется в народной медицине как отхаркивающее, мочегонное, мягчительное, болеутоляющее, как средство, повышающее аппетит, и антисептическое средство, при туберкулезе, упадке сил, похудании, при злокачественных опухолях, бронхиальной астме, как противокашлевое при коклюше, при малярии, мигрени, маточных кровотечениях, болезненных менструациях [2-4].
В проведенных нами ранее исследованиях было установлено, что водорастворимые полисахариды из травы клевера лугового проявляют выраженные иммунотропные свойства и перспективны для терапии IgE-зависимых заболеваний (атопического дерматита, бронхиальной астмы, атопического ринита, крапивницы, пищевых аллергий и др.) [5].
Цель данного исследования - изучение химического состава водорастворимых полисахаридов из травы клевера лугового.
Экспериментальная часть
Растительный материал. В работе использована трава клевера лугового (Trifolium pratense L.), собранная в местах естественного произрастания на территории Томской области и Алтайского края. После сбора растительное сырье высушивалось на воздухе, под навесом, при температуре 15-25 °С в течение 310 сут.
Общие аналитические методы. Содержание уроновых кислот (УК) в водорастворимых полисахаридах и во фракциях определяли карбазольным методом (модификация c добавлением сульфаминовой кислоты) [6] с применением градуировочного графика, построенного для галактуроновой кислоты; белка - по
* Автор, с которым следует вести переписку.
методу Брэдфорда [7] с использованием градуировочного графика для бычьего сывороточного альбумина, нуклеиновых кислот - по методу Спирина [8].
ГЖХ-масс-спектр снимали на хроматографе Agilent 7890A с масс-селективным детектором Agilent 5975С, капиллярной колонкой HP5MS (30 м/250мкм*0,25мкм), газ-носитель - гелий (скорость потока 1 мл/мин). Температурный режим: 80 °С (1 мин)^220 °С (2 мин)^310 °С. Температура испарителя - 280 °С. Количество вводимой пробы 1 мкл.
Все растворы упаривали в вакууме на роторном испарителе при 40 °С. Все полисахаридные фракции высушены лиофильно.
Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Unico 2800.
Выделение водорастворимых полисахаридов (ВРПС). ВРПС выделяли из травы клевера лугового по следующей методике: 20,0 г травы клевера экстрагировали раствором 400 мл очищенной воды и 2 мл концентрированной HCl (pH=4,0) при соотношении сырье : экстрагент - 1 : 20, при нагревании на кипящей водяной бане и периодическом перемешивании в течение 3-4 ч. После отделения частиц сырья путем фильтрования через многослойный тканевый фильтр фильтрат упаривали на роторном испарителе при температуре не более 50 °С до 1/5 от исходного объема. К полученному раствору добавляли троекратный объем 96%-ного этанола и отстаивали 24 ч при температуре 2-4 °С, затем осадок отфильтровывали через бумажный фильтр и растворяли в 100 мл очищенной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре. Нерастворившийся остаток, представляющий собой мельчайшие частицы сырья и денатурированный белок, отделяли центрифугированием (4000 об/мин, в течение 30 мин). Центрифугат диализировали через полупроницаемую мембрану с диаметром пор 15 кДа в течение 48 ч в 50-кратном объеме очищенной воды при комнатной температуре и перемешивании на магнитной мешалке, меняя воду через 24 ч. После диализа раствор замораживали и лиофильно высушивали.
Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе. Навеску ВРПС (300 мг) растворяли в воде (20 мл) и наносили на колонку (24*2,5) с DEAE-целлюлозой. В качестве элюента использовали растворы NaCl по 100 мл каждой молярности (0,01; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5) и 1 М NaCl (скорость 46 мл/ч, отбор фракций по 20 мл). Полисахариды в растворе обнаруживали по положительной реакции с фенолом в присутствии конц. серной кислоты [9]. Для удаления низкомолекулярных веществ использовали метод ультрафильтрации (Vivaspin 20, Германия, размер пор 10 кДа) [10]. Моносахаридный состав каждой фракции определяли методом ГЖХ-хроматомасс в виде триметилсилильных производных после предварительного гидролиза.
Полный кислотный гидролиз. К навеске полисахаридов (ПС) (5 мг) приливали 1 мл 2 М трифторук-сусной кислоты, содержащей мио-инозит (1мг/мл). Смесь в запаянной ампуле нагревали в течение 5 ч при 100 °С, кислоту удаляли многократным упариванием в вакууме досуха с метанолом.
Получение триметилсилильных производных. К полученной в результате кислотного гидролиза смеси моносахаридов добавляли 80 мкл безводного пиридина, смесь выдерживали в сушильном шкафу 20 мин при 50 °С. Далее добавляли 30 мкл N-триметилсилилимидазола, смесь выдерживали в сушильном шкафу 40 мин при 70 °С. К полученной смеси триметилсилильных производных добавляли 1000 мкл гексана, интенсивно взбалтывали, верхний слой отбирали и анализировали методом ГЖХ-хроматомасс.
Обсуждение результатов
Выход ВРПС из травы клевера составил 1,5±0,1% в пересчете на абсолютно сухое сырье. Содержание УК в ВРПС - 74,64±0,23%; нуклеиновых кислот - 0,018±0,001%; общий белок - 0,56±0,01%. При разделении ВРПС на DEAE-целлюлозе получена 31 фракция, из которых отобрано 5 основных фракций, содержащихся в наибольшем количестве (PS62-1, PS62-2, PS62-3, PS62-4, PS62-5) (рисунок).
В полученных фракциях определено содержание белка и УК спектрофотометрическим методом. Результаты представлены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что PS62-1 и PS62-2 содержат минорное количество УК (от 1,58 до 2,44%). Фракция PS62-5 не содержит УК и, таким образом, представляет собой нейтральный полисахарид. В состав фракций PS62-3 и PS62-4 входит большое количество УК (от 40,99 до 48,98%), что свидетельствует о кислой природе ПС. Кроме того, только одна фракция PS62-1 содержит небольшое количество белка (около 1%), который может находиться как в связанной с полисахаридными молекулами форме, так и в виде свободной примеси.
Выход фракций полисахаридов из травы клевера при хроматографии на ББАБ-целлюлозе (% от лиофильно высушенной фракции ПСК, нанесенной на колонку)
Таблица 1. Содержание уроновых кислот и белка во фракциях водорастворимых полисахаридов из травы
клевера лугового
Фракция ВРПС Выход, % от массы ВРПС Характеристика
Содержание УК, % Содержание белка, %
Р862-1 12,29 1,58 1,16
Р862-2 18,6 2,44 -
Р862-3 15,61 40,99 -
Р862-4 30,6 48,98 -
Р862-5 9,96 - -
Для исследования мономерного состава Р862-1 - Р862-5 они были подвергнуты кислотному гидролизу с последующей дереватизацией и анализу методом газожидкостной хроматографии. Установлено, что в гидролизате Р862-1 в наибольшем количестве присутствуют остатки Б-глюкозы (75,68%) и Б-галактозы (20,08%) в соотношении примерно 3,7 : 1. Остатки Б-арабинозы (1,84%), Б-рамнозы (0,35%) и Б-ксилозы (0,5%) обнаружены в минорных количествах. Основными мономерными единицами Р862-2 являются остатки Б-галактозы (27,97%) и Б-глюкозы (72,04%) в соотношении 2,6 : 1. основные мономерные звенья Р862-3 - остатки галактуроновой кислоты (38,75%), галактозы (33,16%) и рамнозы (15,52%) в соотношении 2,5 : 2,1 : 1; содержание ксилозы - 4,95%, арабинозы - 3,47% и глюкозы - 4,14%. Основные мономерные звенья полисахарида Р862-4 - остатки галактозы (37,32%), рамнозы (37,1%) и галактуроновой кислоты (25,57%). Основные мономерные единицы Р862-5 - остатки галактозы и рамнозы в соотношении 2 : 1 (табл. 2).
Таким образом, Р862-1, Р862-2, Р862-5 - это нейтральные ПС, а Р862-3 и Р862-4 - кислые ПС, основная цепь которых представлена участками полигалактуроновой кислоты, между которыми могут располагаться единичные остатки Ь-рамнозы. От основной цепи идут ответвления, состоящие из остатков арабинозы и галактозы.
Таблица 2. Мономерный состав полисахаридных фракций из травы клевера лугового
Фракции Относительное содержание, %
ВРПС Оа1 А КЬа Ага Ху1 Оа1 01и
Р862-1 - 0,35 1,84 0,5 20,08 75,68
Р862-2 - - - - 27,97 72,04
Р862-3 38,75 15,52 3,47 4,95 33,16 4,14
Р862-4 25,57 37,1 - - 37,32 -
Р862-5 - 32,02 - - 67,98 -
Выводы
1. Изучен моносахаридный состав водорастворимых полисахаридов, выделенных из травы клевера лугового (Тп/оНиш рг^вте Ь.). Установлено, что он состоит из 5 основных компонентов (Р862-1 - Р862-5).
2. Основными мономерными звеньями PS62-1 являются D-глюкоза (75,68%) и D-галактоза (20,08%); остатки D-арабинозы (1,84%), D-рамнозы (0,35%) и D-ксилозы (0,5%) присутствуют в минорных количествах. Основные мономерные единицы PS62-2 - остатки D-галактозы (27,97%) и D-глюкозы (72,04%). Основные мономерные звенья PS62-3 - остатки галактуроновой кислоты (38,75%), галактозы (33,16%) и рамнозы (15,52%); содержание ксилозы - 4,95%, арабинозы - 3,47% и глюкозы - 4,14%. Основные мономерные звенья полисахарида PS62-4 - остатки галактозы (37,32%), рамнозы (37,1%) и галактуроновой кислоты (25,57%). Основные мономерные единицы PS62-5 - остатки галактозы (67,98%) и рамнозы (32,02%).
Список литературы
1. Казаков А.Л., Джумырко С.Ф. Хемотаксономическое изучение рода Trifolium L. // Растительные ресурсы. 1979. Т. 15, №3. С. 344-355.
2. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Hidrangeaceae-Haloragaceae. Л., 1987. 326 с.
3. Nissan H.P., Lu J. at al. A red clover (Trifolium pratense) phase II clinical extract possesses opiate activity // Journal of Ethnopharmacology. 2007. V. 112. Pp. 207-210.
4. Krenn L., Paper D.H. Inhibition of angiogenesis and inflammation by an extract of red clover (Trifolium pratense L.) // Phytomedicine. 2009. V. 16. Pp. 1083-1088.
5. Данилец М.Г., Гурьев А.М., Бельская Н.В., Белоусов М.В. и др. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтетазу и аргиназу макрофагов мыши // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. №2. С. 49-50.
6. Bitter T., Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction // Anal. Biochem. 1962. V. 4. Pp. 330-334.
7. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. Pp. 248-254.
8. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. С. 656-662.
9. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and
related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
10. Sanz M.L. et al. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1153. Pp. 74-89.
Поступило в редакцию 9 июля 2010 г.
После переработки 29 декабря 2010 г.
