CC BY
295
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.362.124-074:543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМЕРОВ В ПРЕПАРАТАХ АЛЬБУМИНА ДЕТЕКТОРОМ МНОГОУГЛОВОГО ЛАЗЕРНОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ
А. В. Карякин, Е. Д. Скоцеляс, С. Г. Бексаев, П. А. Флегонтов
ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва
Резюме Для определения содержания и молекулярной массы фракции полимеров в коммерческих препаратах альбумина различных производителей использовали детектор многоуглового лазерного светорассеяния. Полученные результаты процентного содержания высокомолекулярной фракции сравнивали со значениями, полученными расчетом по методике Европейской Фармакопеи. Показано увеличение концентрации полимеров в результате температурной инактивации альбумина.
Ключевые слова: альбумин, многоугловое лазерное светорассеяние, полимеры
EVALUATION OF POLYMERS IN ALBUMIN PREPARATIONS BY MULTIPLE ANGULAR LASER
PHOTODIFFUSION
A.V.Karyakin, E.D.Skotselyas, S.G.Beksaev, P.A.Flegontov Hematology Research Center, Moscow
S u m m a ry. The content and molecular weight of polymer fraction in commercial albumin preparations from various manufacturers were evaluated by multiple angular laser photodiffusion detector. The results (percentage of high-molecular fraction) were compared with values obtained by the European Pharmacopoeia method. The polymer concentrations increased as a result of thermal inactivation of albumin.
Key words: albumin, multiple-angular laser photodiffusion, polymers
Альбумин, являясь основным транспортным белком крови, способен образовывать димеры [1] и полимеры различного состава [2]. В силу этого в препаратах на основе альбумина необходимо контролировать молекулярно-массовое распределение (ММР). Для характеристики ММР, в соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи, используется метод эксклюзионной хроматографии с детектированием белков по поглощению в ультрафиолетовой области при 280 нм. По результатам хроматографического разделения рассчитывают процентное содержание фракции полимеров, которой соответствуют все пики, находящиеся перед пиком димера альбумина. При этом, согласно требованиям Европейской Фармакопеи, "площади всех пиков, обусловленных полимерами и агрегатами, не должны быть более 10% от общей площади хроматограммы, что соответствует 5% полимеров и агрегатов" [3]. Такое соотношение между площадью пиков всех высокомолекулярных соединений и концентрацией полимеров в препарате никак не обосновано.
В литературе описано использование детектора многоуглового лазерного светорассеяния (МУЛС) для определения молекулярной массы белков [4—6] и полисахаридов [7—9]. Интенсивность сигнала данного детектора прямо пропорциональна размеру молекул и их концентрации. Благодаря этому, во-первых, можно определить молекулярную массу анализируемого вещества; а во-вторых, МУЛС обладает большей чувствительностью к высокомолекулярным соединениям,
Для корреспонденции:
Карякин Александр Вадимович, доктор биол. наук, профессор, заведующий лабораторией экспертизы, контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России. Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.
Телефон: +7(495) 612-65-71.
E-mail: karyakinav@gmail.com
чем концентрационные детекторы, такие как дифференциальный рефрактометр (ДР) или ультрафиолетовый детектор (УФ-детектор), что позволяет проводить определение с большей точностью. На практике для анализа высокомолекулярных соединений используют сочетание МУЛС, ДР и УФ-детекторов с экс-клюзионной хроматографией, что позволяет получать информацию не только о концентрации, но и о молекулярной массе детектируемых фракций независимо от конформации молекул в момент анализа [10—12].
Цель работы — оценка возможности использования метода МУЛС для определения молекулярных параметров и содержания фракции полимеров в коммерческих препаратах альбумина.
Материалы и методы
В работе использовали коммерческие образцы препаратов альбумина следующих производителей: Тамбовская областная станция переливания крови (ОСПК; 10 серий); Липецкая ОСПК (8 серий); станция переливания крови Департамента здравоохранения Москвы № 1 (8 серий); "Бакстер", Австрия (4 серии); "Октафарма", Австрия (5 серий); "Биотест", Германия (5 серий).
Для нормализации МУЛС использовали человеческий альбумин, свободный от жирных кислот (HSA-FAF), "Sigma-Aldrich", cat. № A1887.
Перед испытаниями все образцы разводили подвижной фазой до концентрации около 0,5—1% масса/объем по белку.
Разделение фракций анализируемых препаратов проводили методом эксклюзионной хроматографии. Хроматографическая система состояла из изократического насоса (Smartline 1000, "Knauer"), инжектора с петлей объемом 20 мкл и колонки ProteinPak 300SW ("Waters"). В качестве подвижной фазы использовали 20 мМ фосфатный буфер (0,01 М Na2HPO4, 0,01 М KH2PO4) с 3 мМ азидом натрия, pH 7,0. После растворения всех солей раствор последовательно пропускали через фильтры с размером пор 0,1 мкм и 0,025 мкм. Скорость подачи элюента составляла 1 мл/мин. Фракции детектировали МУЛС (DAWN HELEOS-II, "Wyatt Technology"), дифференциальным рефрактометром (Optilab rEX, "Wyatt Technology") и УФ-детектором при 280 нм (Smartline 2500, "Knauer").
26
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Таблица 1
Теоретические и расчетные значения молекулярных масс стандартных белков
Стандарт Молекулярная масса, кД (теоретическая) Молекулярная масса, кД (расчетная)
Миоглобин 18 19,12
Овальбумин 45 44,76
Бычий сывороточный альбумин 66,5 66,46
Человеческий сывороточный альбумин 66,5 67,78
у-Глобулин 160 181,2
Молекулярную массу рассчитывали с помощью программного обеспечения Astra 5.3.4.14 ("Wyatt Technology") по методу Зимма [11, 12].
Рабочий диапазон хроматографической колонки калибровали по белковым стандартам "MP Biomedicals Inc.", cat. № 990822. Результаты калибровки приведены на рис. 1. По полученным в ходе калибровки хроматограммам проведены расчеты молекулярных масс указанных белковых стандартов методом Зимма. Рассчитанные значения хорошо согласуются с теоретическими, что указывает на высокую точность метода анализа (табл. 1).
Расчет процентного содержания фракций осуществляли по правилам Европейской Фармакопеи, а также через сигнал МУЛС. В соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи, процентное содержание фракций определяли путем деления площади пика рассчитываемой фракции на суммарную площадь пиков мономера, димера и полимеров, регистрируемых УФ-детектором, которую принимали за 100%. При расчете альтернативным методом площади пиков мономера, димера и полимеров, детектируемых МУЛС, приводили к единичной молекулярной массе. Далее приведенную площадь пика исследуемой фракции делили на сумму приведенных площадей пиков.
Для проведения тепловой денатурации использовали образцы препарата производства Липецкой ОСПК, в котором полимеры практически отсутствовали, и коммерческий альбумин "Sigma-Aldrich", cat. № A1887, разведенные подвижной фазой до концентрации 1% массы/объема по белку. Денатурацию коммерческого препарата альбумина проводили в исходном виде и с добавкой стабилизатора каприлата натрия до концентрации, аналогичной использованной в препарате Липецкой ОСПК (конечная концентрация в разбавленном для анализа растворе 0,3 мг/мл). Полученные таким образом
Таблица 2
Молекулярные характеристики полимеров в анализированных препаратах
Молекулярная масса, Радиусы молекул фрак-
Производитель МД ции полимеров, нм
пик 1 пик 2 пик 1 пик 2
СПК № 1 (Москва) 4,4—5 2,3—3,2 19—82 00 о
"Бакстер" 5,8—10 2,1—4,3 44—137 35—63
"Биотест" 3,5—4,6 — 30—55 —
"Октафарма" 2,8—4,2 — 30—90 —
"Сигма" 0,6—1,3 — 30—40 —
растворы инкубировали в термостате при температуре 75°С.
Мутность раствора определяли на турбидиметре 2100N IS фирмы "HASH".
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel и Astra 5.3.4.14.
Результаты и обсуждение
Все коммерческие стандарты бычьего и свободного от жирных кислот человеческого сывороточных альбуминов, использованные для калибровки колонки, представляли собой смесь мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и полимеров белка. Против ожиданий во всех исследованных промышленных образцах препаратов альбумина в области молекулярных масс от 180 до 400 кД не выявлено пиков, соответствующих тримеру и тетрамеру альбумина.
Во всех испытуемых препаратах были обнаружены пики полимеров, элюирующиеся в свободном объеме ("мертвом объеме") колонки (около 4,6 мин). Для этих фракций рассчитывали молекулярную массу и среднеквадратичный радиус (табл. 2, рис. 2).
У нескольких препаратов пик высокомолекулярной фракции расщеплялся (рис. 3). В табл. 2 приведены диапазоны минимальных и максимальных значений, полученных в ходе анализа различных серий одного производителя.
lg (MJ 1д (Mw) =-0,3612(Rt) + 7,79
Рис. 1. Калибровочная зависимость для колонки ProteinPak 300SW: lg(Mw) — десятичный логарифм молекулярной массы стандарта, Rt — время удерживания пика стандарта, r — коэффициент корреляции калибровочной прямой.
Относительная шкала
Время, мин
Рис. 2. Типичная хроматограмма препарата альбумина без деления фракции полимеров (на примере препарата фирмы "Биотест"). "+" — сигнал детектора МУЛС, "х" — сигнал УФ -детектора.
27
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Относительная шкала
Рис. 3. Типичная хроматограмма препарата альбумина с частичным разделением фракции полимеров (на примере препарата фирмы "Бакстер"). "+" — сигнал детектора МУЛС, "х" — сигнал УФ-детектора.
Процентное содержание фракции полимеров определяли по площади пиков, регистрируемых МУЛС и УФ-детекторами, а также по рассчитанным значениям молекулярных масс (табл. 3).
В препаратах производства Липецкой и Тамбовской ОСПК фракция полимеров практически отсутствовала. Во всех случаях содержание полимеров, рассчитанное с использованием УФ-детектора, имело более высокие значения по сравнению с методом МУЛС. Эти данные наглядно представлены на рис. 4 и 5. Как видно из данных рисунков, соотношение между процентными содержаниями полимеров, рассчитанных указанными методами, приблизительно одинаково для разных серий препарата одного производителя и варьирует у различных фирм. Для препаратов альбумина производства фирм "Биотест" и "Октафарма" это соотношение приблизительно равно 3, а для препаратов "Бакстер" и СПК № 1 (Москва) — 2. С другой стороны, в препаратах последних двух производителей выявлено деление фракции полимеров. Для пика 2 препаратов этих производителей соотношение между процентными содержаниями составило соответственно 9 и 4.
Одним из возможных вариантов объяснения данного явления может служить отличие в степени на-
бухания полимерного клубка, образование которого обусловлено частичной денатурацией белка. Степень денатурации, в свою очередь, зависит от технологии производства препарата, его очистки и условий хранения.
Моделирование процесса образования полимеров проводили методом тепловой денатурации белков. 1% масса/объем растворы альбумина производства Липецкой ОСПК, коммерческого человеческого сывороточного альбумина фирмы "Сигма" с добавкой стабилизатора каприлата натрия и без таковой инкубировали при температуре 75оС. Процесс денатурации контролировали нефелометри-чески по изменению мутности растворов.
Мутность раствора препарата альбумина производства Липецкой ОСПК при нагревании в течение 60 мин постепенно увеличивалась с 2,3 до 3,3 NTU, при этом доля фракции димера увеличилась с 2,73 до 3,27%, а полимеров — с 0,08 до 3,36%. Через 2 ч нагревания мутность была свыше 100 NTU и при хроматографии был выявлен только один пик фракции полимеров, который в данных условиях не разрешался (рис. 6, а—в). Молекулярная масса полимеров составила 15 МД, а среднеквадратичный радиус — более 120 нм.
В результате термической обработки раствора коммерческого альбумина без стабилизатора аналогичные изменения зарегистрированы уже через 30 мин нагревания. Добавление перед началом нагревания к раствору коммерческого альбумина стабилизатора в концентрации, аналогичной использованной в препарате Липецкой ОСПК, не влияло на характер изменений ММР, а смещало время наступления денатурации до 2 ч.
Заключение
Сопоставление данных о процентном содержании фракции полимеров, рассчитанных двумя методами, показало, что метод, рекомендованный Европейской Фармакопеей, дает завышенное содержание фракции полимеров по сравнению с методом МУЛС. Величина этого завышения примерно постоянна только для препаратов одного производителя, что указывает на зависимость структуры образующихся полимеров от технологии получения препаратов альбумина. Таким образом, соотношение площади пиков высокомолекулярных соединений и концентрации полимеров в препаратах альбумина различных производителей, предложенное Европейской Фармакопеей не правомочно.
Методом МУЛС были охарактеризованы размеры полимеров альбумина, определены их молекулярные массы и среднеквадратичные радиусы молекул. Показано, что температурная денатурация приводит к увеличению концентрации полимеров.
Интересным продолжением работы может служить исследование степени денатурации молекул белка в полимерах альбумина. Эта работа позволит внести предложения по
Т аблица 3
Процентное содержание полимеров в анализированных препаратах
Производи- тель Содержание, %
пик 1 пик 2
УФ МУЛС УФ МУЛС
СПК № 1 (Москва) 0,3—1 О о V 0,3—1,1 0,1—0,2
"Бакстер" 0,3—1,5 00 о o' 0,9—2,5 О о U)
"Биотест" 3,3—5 1—1,5 — —
"Октафарма" 2,8—4 1—1,5 — —
"Сигма" ~ 9,61 ~ 9,31 — —
Липецкая ОСПК Менее 0,1 Менее 0,1 — —
Тамбовская ОСПК Менее 0,1 Менее 0,1 — —
28
Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3
Рис. 4. Соотношение между процентными содержаниями полимеров, рассчитанными разными способами (пик 1).
Отклик МУЛС (В) 0,1400,1350,1300,125-
4,0 5,0 6,0
Отклик МУЛС (В)
Отклик МУЛС (В) 0,40-1
0,35-
7,0 8,0 9,0 10,0
Время, мин
б
11,0
0,25-
0,20-
0,15-
4,0 5,0 6,0
7,0 8,0
Время, мин
9,0 10,0 11,0
Рис. 5. Соотношение между процентным содержанием полимеров, рассчитанным разными способами (пик 2).
усовершенствованию технологии производства препаратов альбумина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rescic J.,Vlachy V., JamnikA., Glatter O. Osmotic pressure, small-angle X-ray and dynamic light scattering studies of human serum albumin in aqueous solution. J. Colloid Interface Sci. 2001; 239: 49—57.
2. Sollenne N. P., Wu H.-L., Means G. E. Disruption of the tryptophan binding site in the human serum albumin dimer. Arch. Biochem. 1981; 207: 264—269.
3. Европейская Фармакопея, 7-е изд. Совет Европы, Страсбург; 2011. http://www.edqm.eu
4. Rongxin Su, Wei Oi, ZhiminHe et al. Multilevel structural nature and interactions of bovine serum albumin during heat-induced aggregation process. Food Hydrocolloids 2008; 22: 995—1005.
5. Barackman J., Prado I., Karunatilake C., Furuya K. Evaluation of on-line high-performance size-exclusion chromatography, differential refractometry, and multi-angle laser light scattering analysis for the monitoring of the oligomeric state of human immunodeficiency virus vaccine protein antigen. J. Chromatogr. A. 2004; 1043 (1): 57—64.
6. SjeklocaL., KonarevP. V., Eccleston J. et al. A study of the ultrastructure of fragile-X-related proteins. Biochem. J. 2009; 419 (2): 347—357.
Рис. 6. Хроматограммы раствора альбумина Липецкой ОСПК, регистрируемые МУЛС в процессе тепловой денатурации.
а — перед инкубацией; б — через 1 ч; в — через 2 ч тепловой обработки.
7. BaggenstossB. A., WeigelP. H. SEC-MALLS analysis of hyaluronan size distributions made by membrane-bound hyaluronan synthase. Anal. Biochem. 2006; 352 (2): 243—251.
8. Ming-Hsuan Chen, Bergman C. J. Method for determining the amylase content, molecular weights, and weight- and molar-based distributions of degree of polymerization of amylase and fine-structure of amylopectin. Carbohydrate Polymers 2007; 69: 562—578.
9. Gidh A. V., Decker S. R., Vinzant T. B. et al. Determination of lignin by size exclusion chromatography using multi angle laser light scattering. J. Chromatogr. A. 2006; 1114 (1): 102—110.
10. Wen J., Arakawa T., Philo J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal. Biochem. 1996; 240 (2): 155—166.
11. Folta-Stogniew E., Williams K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: implementation of an HPLC size exclusion chromatography and laser light scattering service in a core laboratory. J. Biomol. Tech. 1999; 10 (2): 51—63.
12. Эскин В. Е. Светорассеяние как метод исследования полимеров. Успехи физ. наук. 1964; 82: 649—702.
Поступила 11.03.12
29
