CC BY
30ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ М ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР
А.А.Юсубахмедов1 , В.Б.Файзиев1
1Чирчикского Государственного Педагогического Университет, Узбекистан, Ташкент
обл, 100074, ул.Университетская 4, ЧГПУ.
Соответствующий автор email: abdurauf2408@mail.ru, Адреса электронной почты соавторов: v.fayziyev@cspi.uz
Аннотация. Сегодня ряд фитопатогенных вирусов поражают растения картофеля, нанося большой экономический ущерб. Поэтому раннее обнаружение вируса в семенных клубеньках и природных растениях, несущих вирус, предотвратит его распространение во время проведения мероприятий по борьбе с этими вирусами. В данной статье проведены исследования по обнаружению и идентификации растений-резервуаров М-вируса картофеля (КМВ) и различных симптомов заболевания с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-реальное время), и результаты этих исследований представлены.
Ключевые слова: ПЦР, РНК, вирус, идентификация, картофель, амплификация, сорт, резервуар.
DETERMINATION OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES AND IDENTIFICATION OF POTATO VIRUS M USING THE PCR METHOD
A.A.Yusubakhmedov1, V.B.Fayziev1
1Chirchik State Pedagogical University, Uzbekistan, Tashkent region, 100074, Universitety
st. 4, ChSPU.
Corresponding author email: abdurauf2408@mail.ru Email addresses of coauthors: v.fayziyev@cspi.uz
Annotation. Today, a number of phytopathogenic viruses infect potato plants, causing great economic damage. Therefore, early detection of the virus in seed nodules and natural plants that carry the virus will prevent its spread during the activities to control these viruses. In this article, studies on the detection and identification of plant reservoirs of potato M-virus (CMV) and various symptoms of the disease using the method of real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) were carried out, and the results of these studies are presented.
Keywords: PCR, RNA, virus, identification, potato, amplification, variety, reservoir.
ВВЕДЕНИЕ
Картофельные продукты имеют большое значение в жизни человека и занимают важное место в рационе. В развитых странах картофель используется как сырье для производства продуктов питания, кормов, крахмала и спирта. Как и во всех растениях, в картофеле встречаются патогенные инфекции, которые отрицательно сказываются на его росте, урожайности и качестве продукции. Во многих случаях в период роста урожая
под влиянием различных
инфекционных болезней большая часть урожая погибает и его качество резко снижается. Из-за отсутствия
регулярного применения защитных и других мероприятий болезни широко распространены в полевых культурах и личных подсобных хозяйствах и наносят большой ущерб [1, 9, 10, 14].
На земного шара насчитывается более 400 фитовирусов, и более 50 видов повреждают урожай картофеля. Из них 16 видов широко
а 6 видов территории
распространены встречаются на
Узбекистана. Эти: КХВ, КУВ, КМВ, КБВ, КЬВ, КАВ [18, 19].
Несмотря на совершенствование селекционной работы по выведению высокоурожайных и устойчивых к болезням сортов, урожайность картофеля в полевых культурах низкая из-за различных биотических и абиотических стрессов, в том числе вирусов. Вирусные заболевания играют важную роль в снижении урожайности сельскохозяйственных культур. Эти заболевания являются лимитирующим фактором в получении хорошего урожая. Источниками, переносчиками и резервуарами вирусной инфекции служат насекомые (тля, жуки, листовертки, белокрылки), грибы и клубеньки. Слабопатогенные изоляты М-вируса картофеля сами по себе могут вызывать снижение урожая на 10-30%, а сильнопатогенные изоляты могут вызывать снижение урожая на 60-75%. Исследования показали, что
инфицированные клубни картофеля, пересаженные через много лет, снижают урожайность почти на 50% [2, 6, 19, 20, 23, 25].
Когда М-вирус картофеля был впервые идентифицирован, он не считался патогеном до тех пор, пока его не сравнили с представителями других родов карловирусов. Это связано с тем, что растения, зараженные КМВ, не имели видимых, ярких, отчетливых симптомов. Более поздние
исследования показали, что KMВ часто сосуществует с другими вирусами картофеля, заражая больше растений и покрывая большие площади. Длина вириона КМВ 650 нм, диаметр 12-13 нм, 6% вириона составляет РНК, а остальные 94% - белок. Его геном состоит из 8533-8534 нуклеотидов. Изоэлектрическая точка вируса составляет около рН 4-5. Температура термоинактивации 50-80°С. Конечная скорость разведения составляет 10-2 -10-7 [17, 19, 21, 22, 24].
Природные резервуары М-вируса картофеля были идентифицированы И.Т. Эргашевым выделен ряд растений: в том числе вьюнок полевой (Convolvulus arvensis), щавель конский (Rumex confertus), подорожник ланцетолистный (Plantago lanceolata), дурман обыкновенный (D. stramonium), паслён чёрный (Solanum nigrum). А в исследованиях В.Б.Файзиева было обнаружено, что следующие растения считается резервантыми М вирус картофеля бакладжан (S. melongena L.), дурнишник обыкновенный (Xanthium strumarium L), полынь (Artemisia annua L.), паслён чёрный (Solanum nigrum L.), дурман индийский (Datura metel L.), лисохвост (Alopecurus geniculatus L), полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.), люцерна серповидная (Medicago sativa L.), томат (Lycopersicum esculentum Mill.), марь (Ch.amaranticolor ), огурец (Cucumis sativus L.), повилика (Cuscuta auximata Babining.) алтей (Althaea officinalis L.), мальва приземистая (Malva ignorea Wall.), щавель (Rumex crispus L.) [18, 19, 22].
В зараженном растении вирусные вирионы находятся в цитоплазме клетки, а в некоторых случаях в хлоропластах или митохондриях. Общие симптомы, вызываемые вирусом, зависят от штамма вируса и сорта картофеля. Картофель,
инфицированный KMВ, образует линейные или мозаичные пятна от умеренного до яркого цвета. У некоторых штаммов на листьях видны мозаичные завитки, а в некоторых случаях вирус находится в растении в латентной форме. В отличие от ^В, он не вызывает у растения симптомов общего хлороза и листья не теряют эластичности [5, 7, 14, 26].
Вышеуказанные симптомы
болезни дифференцируют от других вирусных болезней картофеля. Метод ПЦР был выбран с целью точной диагностики заболевания и
идентификации вируса [4, 5, 22].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) считается наиболее чувствительным, точным и быстрым методом молекулярной диагностики фитопатогенов. Он позволяет идентифицировать генетическую
молекулу (ДНК/РНК) возбудителя при анализе методом ПЦР в реальном времени в биологическом образце, взятом из стебля, листа или клубенька картофеля. ПЦР-диагностика позволяет выявить даже самый низкий уровень вирусной инфекции в образцах растений. Также отличие молекулярной диагностики от других методов состоит в том, что возбудитель диагностируется не опосредованно, как
иммунологический метод, то есть через связь между антигеном и антителом, а непосредственно через распознавание генетической молекулы инфекции [3, 15, 16].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились в лаборатории молекулярной биологии и биоинформатики биологического
факультета Чирчикского
государственного педагогического университета, а также в лаборатории ИФА и ПЦР Республиканский государственный центр диагностики заболеваний животных и безопасности продовольствия, а также в качестве подсобных хозяйств и жителей Бостонликского и Кибрайского районов Ташкентской области использовались картофельные поля, засеянные в их домах.
Сбор проб для ПЦР-исследования. Для этого из 20 точек участка, где был посажен картофель, по 4 из каждой точки, в общей сложности 80 листьев растения, также среди картофельного растения были взяты образцы стебля и листьев растения которое росло как сорняк и помещают в отдельные полиэтиленовые пакеты, после этого помещен в термосумку (+4С) специальными пакетами со льдом и доставлен в лабораторию, для проведения ПЦР- исследования (Рисунок 1).
О о О о
О О о о
точка-1 О О точка-4
О О
точкя-2 О О точка-5 О О
О о О О
Рисунок 1. Схема отбора проб конвертов с площади полевых культур.
Figure 1. Scheme of sampling envelopes from the area of field crops
Собранные образцы исследовали методом ПЦР и определяли степень поражения растений. В ходе научных исследований проводился мониторинг методом РВ-ПЦР на предмет симптоматической дифференциации КМВ от других вирусов [1, 11].
Для определения КМВ методом полимеразной цепной реакции проводили последовательность по алгоритму следующих:
1. Выделение РНК КМВ из образца;
Для выделения вирусной РНК из растительного образца использовали набор реагентов «ФитоСорб» РН-520 производства НПО «СИНТОЛ» (Россия).
2. Смешивание выделенной РНК со специфическими праймерами и ферментами (ТАQ - полимераза, ревертаза и др.);
Для исследования использовали «Набор реагентов для выявления РНК
КМВ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратный транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ)» (СИНТОЛ ПВ-002), разработанный НПК «СИНТОЛ» (Россия). Данный тест-набор позволяет выявлять РНК возбудителя КМВ, повреждающего картофель, в любой период вегетации растений.
3. Интерпретация и
размножения на ПЦР амлификаторов РНК содержащих смеси в микропробирках.
Процесс амплификация
осуществлялся на прибор
амплификатор «qTOWER3/G». Первые 15 минут амплификации подвергают обратной транскрипции при 45°С. После этого последовательно проводили 50 циклов процессов денатурации, отжига и элонгация.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
С полей картофелеводческих хозяйств Кибрайского района отобрано 4 образца листьев растений картофеля
4 сортов из 5 точек. При отборе проб отбирали растения со специфическими для КМВ признаками, указанными в литературе. Собранные образцы были отсортированы для дифференциации КМВ от других вирусных заболеваний картофеля (КУБ, ЮВ, ^В и др.) [12, 13]. Также с целью изучения сохранения вируса от сезона к сезону на полях, засаженных картофелем, отбирали и контролировали образцы дикорастущих растений.
Образцы были гомогенизированы с использованием автоклавированного стерильного фарфорового чашка для экстракции раствора. РНК КМВ выделяли из гомогенизированного образца с использованием ряда реагентов для выделения нуклеиновых кислот. Выделенную РНК КМВ смешивали с праймерами с помощью специальной смеси для ПЦР. По окончании амплификаци был получен следующие результаты, которая изображена на таблице (таблица 1).
Таблица 1
Заключение обследования, проведенного усилителем ПЦР на определение
КМВ.
Лунка Имя образца Краситель а Средний Ct
A1 Сорт гала 1 точка FAM 35,26 35,26
B1 Сорт гала 2 точка FAM 32,44 32,44
C1 Сорт гала 3 точка FAM 30,56 30,56
D1 Сорт гала 4 точка FAM 31,55 31,55
E1 Сорт разара 1 точка FAM 15,24 15,24
F1 Сорт разара 2 точка FAM 17.58 17.58
G1 Сорт разара 3 точка FAM 21.25 21.25
H1 Сорт разара 4 точка FAM 19.56 19.56
A2 Сорт зарзара1 точка FAM 42,87 42,87
B2 Сорт зарзара 2 точка FAM 42,5 42,5
C2 Сорт зарзара 3 точка FAM 42,6 42,6
D2 Сортзарзара 4 точка FAM 46,34 46,34
E2 Сорт санта 1 точка FAM ^ нетто
F2 Сорт санта 2 точка FAM ^ нетто
G2 Сорт санта 3 точка FAM ^ нетто
H2 Сорт санта 4 точка FAM ^ нетто
A3 ОКО (К-) FAM 30,91 30,91
В3 ПКО (К+) FAM ^ нетто
По
результатам проведенных исследований
установлено, что картофель сортов гала, зарзара и разара заражен КМВ. Из всех 3 образцов по результатам ПЦР определено, что картофель сорта разара высоко заражен вирусом. Также
возбудитель КМВ не был обнаружен при исследовании образца листьев сорта санта.
Образцы, представленные для идентификации резервуаров М-вируса картофеля, были исследованы методом ПЦР, результаты полученные изображена на таблице (таблица 2).
Таблица 2
Заключение исследования ПЦР-усилителем на резервуарах обнаружения КМВ Conclusion of the PCR-amplifier study on PMV detection tanks
Лунка Имя образца Краситель а Средний Ct
A1 Физалис (Physalis) FAM Й нетто
B1 Пастушья сумка обыкновенная (Capsella bursa-pastoris L.) FAM 37,69 37,б9
C1 Марь обыкновенная (Chenopodium album) FAM Й нетто
D1 Белена (Hyoscyamus L.) FAM Й нетто
E1 Капуста полевая (Brossica campestris L.) FAM Й нетто
F1 Портулак огородный (Portulaca oleracea L.) FAM Йнетто
G1 Клевер (Trifolium) FAM Й нетто
H1 Повой заборный (Convolvulus sepium) FAM Й нетто
A2 Паслён чёрный (Solanum nigrum) FAM 27,82 27,82
B2 Пальчатая трава (Cynodon dactylon L.) FAM Й нетто
C2 Помидор (Solanum lycopersicum) FAM Й нетто
D2 Мальва приземистая (Malva L.) FAM Й нетто
E2 Болгарский перец (Capsicum annuum L) FAM Й нетто
F2 Бодяк полевой (Cirsium arvense) FAM Й нетто
G2 Латук дикий (Lactúca serríola) FAM Й нетто
H2 ОКО (К-) FAM Й нетто
A3 ПКО (К+) FAM 26,62 2б,б2
По результатам анализа резервуаров КМВ в дикорастущих травах, выращиваемых на
картофельных полях: в приведенном в литературе теле растения Solanum nigrum обнаружен высокий титр вируса.
Также методом ПЦР была изучена высокая концентрация вируса в организме растения СарБвИа ЬигБа-раэ^пэ (Ь.) еще не вошедшего в литературу (рисунок2- а, б)
Рисунок 2. Резервуары КМВ: а - Solanum nigrum, б - Capsella bursa-pastoris (L.) Figure 2. PMV reservoirs: a - Solanum nigrum, b - Capsella bursa-pastoris (L.)
Pathology. Ithaca. 2005
Принимая во внимание, что растение Capsella bursa-pastoris (L.) растет осенью, его листья зимуют под снегом и продолжают рост весной, хранение КМВ в резервуарных растениях вызывает периодическую циркуляцию вируса и его распространение на более широкую территорию.
ВЫВОДЫ
Одним из основных условий обеспечения высокого и качественного урожая картофеля является
своевременное выявление болезней, правильная и своевременная диагностика, надлежащая защита посевов от болезней. Для этого необходимо иметь информацию об идентификации возбудителя болезни, его развитии, распространении и сохранении от сезона к сезону.
В этом исследовании симптомы заболевания, такие как желтые пятна и частичное скручивание листьев на листьях картофеля, изучались с помощью ПЦР-мониторинга.
Из изученной литературы и проведенных экспериментов было выяснено, что: КМВ встречается преимущественно в растения сорных и местных как Solanum nigrum и другие. Оказалось, что эти растения, встречающиеся на картофельных полях как сорняки, сохраняют в своем организме КМВ и участвуют в периодическом круговороте.
Для предупреждения эпифитотий этого вируса важно выявлять растения-резервуары и предотвращать их рост на пахотных полях.
Список литературы:
1. Awasthi LP. Current status of viral diseases of potato and their ecofriendly management -A critical review. Virology: Research & Reviews 2017; 1(4): 4-16
2. Burrows M., Thomas A.Z. Virus Problems of Potatoes. Cornell University, USDA-ARS and Department of Plant
http://vegetablemdonline.ppath.cornell.ed u
3. Kassanis B. Potato Virus M and Paracrinkle. Nature. 1960. 688.
4. Kumar R. Potato viruses and their diagnostic techniques: An overview. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry December 2019; 8(6):1932-1944.
5. Salazar L.F. Potato viruses after the xxth century: effects, dissemination and their control. Crop Protection Department. CIP. 2003; P.O. Box 1558 Lima 12, Peru 6.
6. Shonazarova N.I., Fayziyev V.B. Kartoshka viruslari va ularga qarshi samarali kurash choralari. Academic research in educational sciences. 2021; 2(9): 955-965.
7. Shonazarova N.I., Fayziyev V.B. KYV shtammlari va ularning ahamiyati. Academic research in educational sciences. 2021; 2(10). 306-311.
8. Zavriev S. K., Kanyuka K. V., Levay K. E. The genome organization of potato virus M RNA. Journal of General Virology. 1991; 72: 9-14.
9. Вахобов А.Х. Учебник по основам вирусологии.Ташкент. 2017; 286-295.
10. Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология. -М.: Колос. 1982.- 239.
11. Головин П.Н., Арсеньева М.В. и др. Практикум по общей фитопотология. Ленинград "Колос" . 1967; 27-35.
12. Жевора С.В., Зейрук В.Н. и др. Передовые методы диагностики патогенов картофеля. Научный аналитический обзор. Москва; 2019. 4046.
13. Карташёва И.А. Сельскохозяйственная фитовирусология. Москва "Колос" -2007. 104-111.
14. Крылкадов Р.В. Экология вируса картофеля М в семействе solaneseae. Диссертация доктора философии.-Алматы. Казахский национальный аграрный университет; 2014; 11-58.
15. Кутлунина Н. А., Ермошин А. А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений. Учебно-методическое
пособие. Екатеринбург. 2017; 35-82.
16. Новикова Н.А. Молекулярные аспекты взаимодействия вирусов с клеток. Нижний Новогород. 2015. 43-56.
17. Рогозина Е.В., Мироненко Н.В., Афанасенко О.С., Мацухито Ю. Широко распространенные и потенциально опасные для российского агропроизводства возбудители вирусных болезней картофеля. Вестник защиты растений. 2016; 4(90): 24-33.
18. Файзиев В.Б. Выделение изолята Х-вируса картофеля, распространенного в Узбекистане, изучение его особенностей и диагностика. Дис....доктор. биол. наук. - Ташкент: Институт Микробиологии АН РУз. 2020; 150-183.
19. Файзиев В. Б. Современная диагностика и научно обоснованные меры борьбы с вирусами картофеля, монография. Ташкент "Lesson press". 2021; 6-17.
20. Хасанов Б.А., Очилов Р.О., Гулмуродов Р.А. Болезни овощных,
картофеля и картофельных культур и борьба с ними. Ташкент: «Виза Принт». 2009; 101-120.
21. Юсубахмедов А.А., Файзиев В.Б. Систематика и биологическая характеристика М-вируса картофеля. «Национальные исследования в Узбекистане: периодические конференции: сборник материалов Республиканской 38-й междисциплинарной научной дистанционной онлайн-конференции по теме, Ташкент: «Исследования». 2022; 15-16.
22. Юсубахмедов А.А., Файзиев В.Б. Вирус картофеля М и его биологическая классификация. Academic Research in Educational Sciences, Multidisciplinary Scientific Journal. Ташкент. 2022. 424-429.
23. https://www.sciencedirect.com/top ics/agriculture-and-biological-sciences/potato-virus-m
24. https://link.springer.com/article/1 0.1007/BF02356053
25. https://naukarus.com/effektivnyy-method-diagnostiki-i-identifikatsii-virusnyh-patogenov-kartofelya
26. https://viralzone.expasy.org/7397o utline=all by species
