CC BY
148
экологическая генетика трансгенных организмов
© з. Сташевски ’,
о. Н. Ильинская2
1 Татарский научноисследовательский институт сельского хозяйства, Казань
2 Казанский государственный университет, Казань
' PvYNTN-CP ген белка оболочки некротического штамма Y-вируса картофеля (YBKN™) был перенесен в растения двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. минденеш и Самодий кифли с помощью агробактериальной трансформации. Экспрессия PVYNTN-CP гена была выявлена в 33 (89 %) из 37 и 3 (75 %) из 4 канамицин-устойчивых регенерантах картофеля сортов минденеш и Самодий кифли, соответственно. Степень устойчивости независимых линий трансгенных растений картофеля к двум штаммам вируса (YBK°, YBKn™) варьировала от крайней устойчивости до полной восприимчивости. У трех линий трансгенных растений картофеля была показана крайняя устойчивость к обоим штаммам YBK.
' Ключевые слова: Y вирус картофеля; белок оболочки вируса; генетическая трансформация; трансгенные растения.
Поступила в редакцию 27.03.2009 Принята к публикации 12.10.2009
УДК 578.864.1, 577.21, 635.21
ВИРУСОУСТОЙЧИВОСТЬ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ SOLANUM TUBEROSUM L, НЕСУщИХ PVYntn-CP ГЕН БЕЛКА ОБОЛОЧКИ Y ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ
' Список сокращений: 6-БАП — 6-бензиламинопурин, БО — белок оболочки, ИФА — иммуноферментный анализ, Km — канамицин, Kmr — канамицин-устойчивые, М — трансформанты сорта Минденеш, МС — питательная среда Мурасиге и Скуг; МСКл — питательная среда для индукции образования микроклубней; МСКо — питательная среда для укоренения; МСП — питательная среда для регенерации побегов; НУК — 1-нафтилуксуная кислота, ПЦР — полимеразная цепная реакция, SK — трансформанты сорта Самодий кифли, Сх — цефотаксим, YВК — Y-вирус картофеля.
ВВЕДЕНИЕ
Уже в начале XX-го века специфические симптомы вырождения картофеля связывали с распространяемым тлями Y-вирусом картофеля (YBK). YВК является одним из наиболее распространенных и вредоносных вирусов картофеля. У него обнаружен ряд штаммов (YBK0, YBKn, YBK0, YBK2, YBKntn, YBKN-Wilga), отличающихся симптомами и степенью поражения растений картофеля (Шуберт с соавт., 2004). В Западной Европе долгое время наибольший ущерб картофелеводству приносил штамм YBK0, однако в 50-е годы прошлого века в некоторых местностях он был полностью вытеснен штаммом YBKn. Общеевропейской проблемой штамм УВКМ стал в середине 70-х годов ХХ века (Weidemann, 1988). В 1980-х годах в Европе обнаружены два новых штамма: YBKntn и YBKN-Wilga. YBKntn впервые описан в Венгрии (Beczner et al., 1984), он вызывает на клубнях картофеля кольцевые некрозы. По своим свойствам он относится к группе некротических штаммов, по этому получил название УВКМ™. В настоящее время данный штамм обнаружен в большинстве стран Европы, северной Америки и Азии (Шуберт с соавт., 2004). В результате экспансии некротических штаммов YBK многие хорошо известные сорта картофеля потеряли свою привлекательность для картофелеводства (Horvath et al., 1999; Шуберт с соавт., 2004).
У культивируемых сортов и диких видов картофеля Solanum spp. обнаружено большое разнообразие типов, форм и степеней устойчивости к вирусам. Наиболее ценным типом устойчивости является крайняя устойчивость к вирусам, контролируемая главными генами (Росс, 1989; Solomon-Blackburn et al., 2001-a).
В 1986 году были получены устойчивые к вирусу табачной мозаики растения Nicotiana tabacum L, трансформированные конструкциями с геном, кодирующим белок оболочки (БО), (Powell-Abel et al., 1986). Впоследствии для создания трансгенной вирусоустойчивости были использованы разные фрагменты генома самого вируса — гены, кодирующие белок оболочки вируса, транспортный белок вируса, белок вирусной репликазы, белок вирусной протеазы, рибозимы. Кроме этого для создания вирусоу-
LB Р CaMV 35S PVYN1N -CP Tnos Pnos NTP II Tnos RB
Рис. 1. Схема Т-ДНК вектора для экспрессии PVYNTN-СР гена в растениях.
Структура Т-ДНК вектора, использованного для получения трансгенных растений картофеля. ЬВ и НВ — левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; РСаМУ 355 — ЭББ промотор вируса мозаики цветной капусты; PVYNTN-СР — ген белка оболочки PVYNTN, Тшб — терминатор гена нопалинсинтазы Л. tumefaciens, Ршб — промотор гена нопалинсинтазы Л. tumefaciens, ЫТРII — ген неомицин-фосфотрансферазы II, селективный маркерный ген для растений.
стойчивых трансгенных растений были использованы и другие нуклеотидные последовательности: ген антивирусного белка Phytolacca americana, ген крысиной 2’ — 5’-олигоаденилат синтазы, ген дрожжевой РНК-специфичной рибонуклеазы рис. 1, гены, кодирующие антитела млекопитающих. Защита от вирусной инфекции может быть обусловлена экспрессией вышеперечисленных последовательностей, самим трансгеном или его РНК-транскриптом (Solomon-Blackburn et al., 2001 -b; Harrison et al., 2005).
Среди всех функциональных последовательностей вируса для трансформации растений наиболее широко используется ген БО вируса. БО опосредованная устойчивость была получена для вирусов различных таксономических групп в разных растениях (Lawson et al., 1990; Feher et al., 1992; Gonsales et al., 1993; Okamoto et al., 1996; Beachy, 1997; Hassairi et al., 1998; Romano et al., 2001).
Обобщая литературные данные, можно сделать вывод, что экспрессия гена БО вируса в трансгенных растениях дает высокую степень устойчивости к вирусу, ген БО которого был использован для трансформации, а также к другим близкородственным вирусам. Целью данной работы явилось повышение вирусоустойчиво-сти перспективных сортов картофеля с помощью генноинженерных методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирус и генная конструкция
Для создания генной конструкции был использован PVY-H Венгерский изолят некротического штамма YBKntn, вызывающий образование кольцевых некрозов на клубнях картофеля (Beczner et al., 1984). Коллар с соавторами (Kollar et al., 1993) PVYNTN-CP ген белка оболочки YBKntn (Thole et al., 1993) был клонирован в вектор pGA482 (An et al., 1986) для трансформации растений. Созданная генная конструкция pGAYHCP в пределах Т-ДНК области содержит ген PVYNTN-CP под контролем промотора PCaMV 35S вируса мозаики цветной капусты и селективный маркерный ген NTPII для растений, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину (рис. 1). Трансформацию растений картофеля проводили с использованием Gram-С58С1 (Rifr) штамма Agrobacterium tumefaciens (Zambryski et al., 1983).
Растения и трансформация
Асептические, безвирусные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Минденеш и Самодий кифли, были получены из Института селекции картофеля (г. Кестхей, Венгрия). Нетрансформированные растения картофеля выращивали на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige et al., 1962), содержащей 2 % сахарозы и 0,8 % агара, pH 5,7. В качестве эксплантов для ко-культивации с A. tumefaciens использовали микроклубни картофеля. Микроклубни получали в асептической культуре на микрочеренках растений картофеля, высаженных на питательной среде для индукции образования микроклубней (МСКл), приготовленной на основе питательной среды МС, с добавлением 6 % сахарозы, 2,5 мг/л кинетина согласно методу, описанному Боркю с соавт. (Borque et al., 1987). Перед высадкой удаляли % листа микрочеренков. Колбы (100 мл) с пятью микрочеренками инкубировали при + 19 °С в темноте. Трансформацию дисков микроклубней и регенерацию растений картофеля проводили согласно указаниям Ишида с соавт. (Ishida et al., 1989). Микроклубни разрезали на диски толщиной в 2—5 мм в стерильных условиях и помещали в чашки Петри на питательную среду для регенерации побегов (МСП), приготовленную на основе питательной среды МС, содержащей 3 % сахарозы, 1 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК (Ishida et al., 1989). В течение 2 суток диски микроклубней преинкубировали при 16-часовом световом периоде и температуре +23 °С. Культуру микроорганизмов A. tumefaciens для инокуляции готовили в жидкой питательной среде Лурия-Бертани Броф (Miller, 1972) без добавления антибиотиков на ротационной термостатируе-мой качалке (50 оборотов/мин.) в течение 15 часов при +28 °С. На диски микроклубней наносили 5—10 мкл ночной культуры бактерии A. tumefaciens. После двухдневной инкубации в темноте при температуре +23 °С диски микроклубней в течение 30 минут отмывали в растворе цефотаксима (Сх) (500 мг/л). Раствор с дисков микроклубней удаляли стерилизованной фильтровальной бумагой. Экспланты переносили в колбы (100 мл) на питательную среду МСП, содержащую 500 мг/л Сх, 100 мг/л канамицина (Km). В одну колбу помещали 5—8 микродисков клубней, в зависимости от их размера. По восемь неинокулированных A. tumefaciens эксплантов каждого сорта использовали в виде контроля. Четыре из них высаживали на питательную среду МСП, для контроля ре-
генерации побегов на данной среде. Оставшиеся четыре помещали на питательную среду МСП + Cх (500мг/л) + Km (100 мг/л), для контроля действия селективного агента на регенерацию побегов и селекцию трансформантов. Пересадку дисков микроклубней, на свежую питательную среду МСП, проводили каждые две недели. Регенерировавшие побеги размером 1-2 см срезали и помещали на питательную среду для укоренения (МСКо), приготовленную на основе питательной среды МС, содержащую 2 % сахарозы, 0,1 мг/л НУК, 300 мг/л Сх, 50 мг/л Km (Ishida et al., 1989). Укоренившиеся Km''-растения высаживали в стерильную почву и помещали в теплицу.
Определение интеграции PvYntn-CP гена в геном Ктг-регенерантов картофеля
Экстракцию растительной ДНК проводили согласно методике, описанной Рубино с соавт. (Rubino et al., 1992). ПЦР проводили в условиях, отработанных при изучении трансгенных растений табака (Jozsa et al., 2002). Праймеры 5’-CACTTGCTCGAGTATGCTC CACAGC-3’, гомологичные нуклеотидам 8776-8800 и 5’-CGTCCGGAGAGACACTACA-3’, комплементарные нуклеотидам 9376-9394, подобранные из последовательностей гена БО и 3NTR YBKNTN, амплифицируют последовательность ДНК длиной в 618 п. н. Схема ПЦР: 1) 94 “С — 4 мин.; 2) 94 “С — 1 мин.; 3) 56 “С — 1 мин.; 4) 72 “С — 2 мин. Шаги 2-4 повторяли 40 раз. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Определение экспрессии PVYntn-CP гена в трансгенных растениях картофеля
Трансляцию PVYNTN-CP гена в Kmr-регенерантах картофеля изучали с помощью Вестерн-блот анализа. Для приготовления белкового экстракта у тепличных растений картофеля брали по два листовых диска (»20мг), вырезанных с помощью крышки пробирки «Эппендорф». Белковые экстракты растений фракционировали в 12 % полиакриламидном геле, переносили на мембрану (Hybon-C). БО YBKNTN, в исследуемых образцах трансгенных растений, выявляли с помощью антител, специфичных к YBK, сопряженных с щелочной фосфатазой (Anti-potato vims Y-antibody-AP-conjugate Boehringer Mannheim GmbH Cat No. 647 420) (Sambrook et al., 1989). В качестве положительного контроля использовали нетрансформированные инфицированные YBKNTN растения картофеля, в качестве отрицательного — не-трансформированные, свободные от вирусов растения картофеля.
Иммуноферментный анализ
ИФА проводили, с использованием поликлональных антител к УВК (Loewe Biochemica Gmbh) согласно методике, описанной Кларк и Адамс (Clark et al., 1977).
Первичный анализ вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля в тепличных условиях.
Для оценки вирусоустойчивости вегетативное потомство (клубни) Kmг-регенерантов высаживали в теплице.
Каждая независимая линия была представлена 5-ю растениями. В виде положительного контроля инокуляции были высажены нетрансформированные, свободные от вирусов сорта картофеля Минденеш и Самодий кифли, по 5 растений каждого сорта. Для искусственного заражения растений картофеля были использованы очищенные вирусные препараты двух штаммов YBK: YBKNTN (изолят D-10) и YBK0/C (изолят Ka-49). Инокулят готовили с помощью разведения очищенного вирусного препарата в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) до конечной концентрации вирусных частиц в растворе 5 и 20 мкг/мл. Инокуляцию проводили на стадии 4-х листочков методом механической инокуляции — нанесения инокулята стеклянным шпателем на посыпанные карборундом листья третьего яруса. На 36 день после инокуляции проводили визуальную оценку развития симптомов вирусной болезни. На 37 день после инокуляции проводили изучение растений на скрытую зараженность УВК методом ИФА и с помощью биотеста на индикаторных растениях межвидового гибрида A6 S. demissum х S. tuberosum. Отделенные листья гибрида А6 обрабатывали соком исследуемых трансгенных и контрольных растений с помощью механической инокуляции. Соком одного изучаемого растения обрабатывали по два листа тестерного растения. Инокулированные листья инкубировали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Учет симптомов проводили на 7-й день после обработки.
Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля в полевых условиях
Исследуемые трансгенные растения картофеля были высажены на небольших делянках, окруженных рядами кукурузы. Схема посадки следующая: 1) борозда с нетрансформированными растениями сорта Самодий кифли, зараженными YBKNTN; 2) борозда с изучаемыми трансгенными растениями картофеля; 3) борозда с нетрансформированными безвирусными растениями сортов Минденеш или Самодий кифли. Повторность двукратная. Длина борозды 5 м. На каждой борозде высаживали по 20 клубней. В течение вегетационного периода проводили наблюдения за развитием симптомов вирусной болезни, а также определяли скрытую зараженность растений YBK методом ИФА. Растительный материал для ИФА отбирали во время цветения и во время клубнеобразования (через 30 дней после первого срока отбора проб). Полученное вегетационное потомство изучаемых трансгенных растений использовали для повторения эксперимента в следующем вегетационном сезоне.
Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля методом прививки
Для инокуляции были взяты два побега от каждой исследуемой линии трансгенных растений картофеля и привиты на зараженные YBKNTN растения табака N. tabacum L. Одновременно три побега зараженного YBKNTN томата
Таблица 1
Результаты агробактериальной трансформации дисков микроклубней картофеля геном РУУ^™-СР
Сорт картофеля Количество, шт. (%)
и к н е р е ч О р К Ми Микроклубни >3мм + <3мм Диски микроклубней Регенерировавшие растения
Контроль е и .її К о Й ^ ^ 55 7 а о ^ с Контроль ы т н а р е н е г си р і & 1 P (+) О РЭ
П и £ МCП + Cx (500мг/л) + Km (100 мг/л)
Минденеш 25 19 (76)4 3 (12)1 4+44 41 7 (175)2 0 (0)2 37 (90)2 35 (95)3 33 (89)3
Самодий кифли 25 14 (56) +9 (31) 4(2)5+4 (2)5 17 (4)4 6(150) 0 (0) 4 (23) 4(100) 3 (75)
Всего 50 33+12 16 58 25 0 41 39 36
1 — соотношение количества полученных микроклубней с количеством микрочеренков, высаженных на питательную среду для индукции клубнеобразования (%); 2 — соотношение количества регенерировавших растений с количеством дисков микроклубней (%); 3 — соотношение количества РУУыт-СР ( + ) и БО ( + ) растений с количеством регенерировавших Ктг растений (%);4 — 4 экспланта высаживали на МСП + 4 экспланта на МСП + Сх (500мг/л) + Кт (100 мг/л); 5 — экспланты в виде целых микроклубней размером < 3мм.
были привиты на растения изучаемых линий трансгенного картофеля. Все подвои и привои были одного возраста и имели по 8—10 листьев. Накопление вирусных частиц в тканях инокулированных растений оценивали с помощью ИФА анализа. В виде контроля заражения УВКмт были использованы нетрансформированные безвирусные растения картофеля сорта Минденеш.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры
Возможность регенерации растений была показана для эксплантов, приготовленных из разных органов и тканей картофеля. Согласно литературным данным (Ishida et а1., 1989; Esna-Ashari et а1., 1998) и по результатам собственных исследований (не опубликованы) высокой эффективности регенерации растений можно добиться при использовании для агробактериальной трансформации дисков микроклубней картофеля, полученных в асептической культуре. Данные экспланты обладают целым рядом преимуществ: 1) отсутствует необходимость стерилизации растительного материала; 2) прямо на поверхности микроклубней, в почках (глазках) находиться недиференцированная ткань 3) ткани микроклубней являются достаточно молодыми, что значительно повышает возможность спонтанного эмбриогенеза; 4) возможность прямого побегообразования (Ishida et а1., 1989). В течение первых 20—30 дней инкубации на питательной среде МСКл из пазушных почек микрочеренков кар-
тофеля вырастали 1—2 см столоны. В дальнейшем на свободном конце столона происходило формирование микроклубней. У кругло-клубневого сорта Минденеш формировались круглые микроклубни, которые в течение 30—40 дней достигли размера от 3 до 8 мм. Глазки (3—7 штук) были отчетливо видны и практически равномерно рассредоточены по всей поверхности. Из данных микроклубней готовили от 1 до 3 эксплантов, с помощью их разрезания на диски толщиной 2—5 мм (табл. 1).
Клубни сорта Самодий кифли имеют продолговатую форму, соотношение ширины и длины от 1 : 1,5 до 1 : 2. При использовании выше описанной методики индукции клубнеобразования в течение 30—40 дней у данного сорта сформировались длинные и тонкие микроклубни. Их длина составляла 10—20 мм, в то время, как толщина была всего лишь 1—3 мм. При увеличении продолжительности инкубации микрочеренков до 50—60 дней, микроклубни в длину росли на много быстрее чем в ширину. В конце инкубации на микроклубнях было 2—5 шт. отчетливо видимых глазков, причем большинство из них было сосредоточено на апикальном конце. В связи с этим, часть полученных микроклубней не разрезали на диски, а использовали целиком для ко-культивирования с А. tumefaciens (табл. 1).
Трансформация и регенерация растений
Эффективная и воспроизводимая на разных сортах картофеля система регенерации побегов является необходимым условием получения генетически модифицированных растений. Перспективным является метод прямой регенерации побегов из дисков клубней карто-
Рис. 2. Регенерация Ктг-микрорастений картофеля сорта Минденеш на селективной канамицин (100 мг/л) содержащей среде
феля, исключающий вероятность появления сомаклонов (Ishida et а1., 1989; Esna-Ashari et а1., 1998).
Регенерация Ктг-побегов на трансформированных эксплантах началась на 22 день их инкубации на Кт-содержащей селективной среде (табл. 1). Побегообразование на нетрансформированных (рис. 2) дисках микроклубней, инкубируемых на питательной среде МСП, началось на 20 день. В первую очередь побеги появились на более крупных и тонких (2—3 мм) дисках микроклубней, со срезами с обеих сторон. У трансформированных эксплантов регенерация Ктг-побегов проходила исключительно по периметру диска, независимо от того одна или обе его стороны были срезаны (рис. 2). В случае не-трансформированных эксплантов образование побегов также в первую очередь проходило по периметру диска и только позже побеги появлялись из глазков, расположенных в апикальной части дисков микроклубней с односторонним срезом. На некоторых трансформированных дисках микроклубней с односторонним срезом происходил рост побегов из почек, расположенных в апикальной части экспланта. Данные побеги в течение одной недели с начала их появления обесцвечивались и погибали. Аналогично этому, побеги появлялись и погибали на контрольных нетрансформированных целых микроклубнях сорта Самодий кифли и дисках микроклубней обоих сортов с односторонним срезом, высаженных на питательную среду МСП + Сх (500мг/л) + Кт (100 мг/л). По периметру нетрансформированных дисков с двухсторонним срезом на селективной питательной среде побеги не образовывались. Данный факт свидетельствует о том, что
для агробактериальной трансформации более целесообразно использовать диски микроклубней картофеля с двухсторонним срезом и толщиной 2—3 мм. Целые микроклубни оказались менее всего пригодными для этой цели. Из 4 целых микроклубней с локальными надрезами, ко-культивированными с А. tumefaciens не удалось получить ни одного Ктг-регенеранта. Ктг-побеги, также не были получены из дисков микроклубней, вычлененных из дистальной (столонной) части удлиненных микроклубней сорта Самодий кифли. По-видимому, в данном эксперименте микроорганизмы А. tumefaciens наиболее эффективно трансформировали недиференцированные клетки меристематической ткани, находящиеся в почках (глазках) дисков микроклубней. В тоже время у сорта Самодий кифли эффективность регенерации побегов с трансформированных и нетрансформированных дисков с двухсторонним и односторонним срезом, полученных из апикальной части микроклубней (с глазками), на МСП селективной среде и МСП без добавления антибиотиков, соответственно, была сопоставима с аналогичным процессом у сорта Минденеш (в табл. 1 не показано). Несмотря на это, нельзя исключить, что причина низкого выхода Ктг-регенерантов у сорта Самодий кифли (23 %) кроется в реакции генотипа на условия агробактериаль-ной трансформации и регенерации, так как у картофеля способность к регенерации побегов является генотип-зависимым процессом (Ishida et а1., 1989; Heeгes et а1., 2002; Ап|ит et а1., 2004).
Регенерацию Ктг-побегов с трансформированных эксплантов проводили в течение 80 дней. Большинство
1 2 3 456 78 9 10 11
618 п.н. ----------3»»
Рис. 3. ПЦР анализ Ктг-регенерантов картофеля сорта Минденеш на наличие РУУ^т-СРгена в трансформированных растениях.
1 — отрицательный контроль — нетрансформированное растение сорта М; 2—8 — ДНК Ктг-регенерантов картофеля М2 М3, М4, М5, М6, М7, М8; 9 — положительный контроль — ДНК плазмиды pGAYHCP; 10 — отрицательный контроль — ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 11 — маркер молекулярной массы — ДНК фага X, обработанная рестриктазой PstI.
БО
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 4. Вестерн-блот анализ экспресии РУУмт-СРгена в Ктг-регенерантах картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли.
2 — отрицательный контроль — экстракт белков нетрансгенного, свободного от вирусной инфекции растения; 3 — положительный контроль — экстракт белков нетрансгенного, РУГ1™ инфицированного растения;
1, 4—7 — экстракт белков Ктг-регенерантов картофеля М5, М11, М10, М12, М21.
регенерантов было получено в промежутке между 25—50 днями инкубации на Кт-содержащей селективной среде. Всего было получено 37 Ктг-регенерантов сорта Минденеш и 4 — сорта Самодий кифли (табл. 1).
Молекулярный анализ Ктг-регенерантов картофеля Интеграция РУУмт-СР гена в полученных Ктг-регенерантах была показана методом ПЦР (рис. 3). В результате была установлена интродукция данного
гена в геном 35 Ктг-регенерантов сорта Минденеш и 4 устойчивых к канамицину регенерантов сорта Самодий кифли (табл. 1).
Экспрессия гетерологичного гена была показана методом Вестерн-блот гибридизации у 33 РУУмт-СР растений картофеля сорта Минденеш и у 3 РУУ1т-СР растений картофеля сорта Самодий кифли (рис. 4, табл. 1). При вегетативном размножении полученных трансген-
Таблица 2
Результаты агробактериальной трансформации дисков микроклубней картофеля геном PVYNTN-СР
Линии трансгенных растений картофеля, полученные из исходных сортов Устойчивые / восприимчивые к YBK линии трансгенных растений картофеля,
Механическая инокуляция в теплице1 Искусственный инфекционный фон YВКN1N в поле Прививка на инфицированные YВКN1N растения
YВКN1N YВКO/C
Минденеш 3/32 3/32 3/32 3/32
Самодий кифли 0/4 0/4 0/4 -
Примечания: 1 — 20 мкг/мл очищенного вируса.
Таблица 3
Результаты изучения уровня экспрессии БО и вирусоустойчивости некоторых трансгенных линий картофеля, несущих ген PVYNTN-СР
Линии трансгенных растений картофеля Уровень экспрессии БО Количество инфицированных / высаженных растений, шт.
Механическая инокуляция в теплице1 Искусственный инфекционный фон YBKntn в поле Прививка на инфицированные YBKntn растения
YВКN1N YВКO/C
Самодий кифли2 — 5/5 5/5 40/40 —
SK2 Высокий 5/5 5/5 37/37 —
Минденеш2 — 5/5 5/5 38/38 —
M3 Высокий 5/5 5/5 40/40 —
М8 Низкий 5/5 5/5 40/40 —
M9 — 5/5 5/5 13/13 —
M10 Низкий 5/5 5/5 39/39 —
M11 Высокий 0/5 0/5 0/37 0/5
M12 Высокий 0/5 0/5 0/40 0/5
М15 Высокий 5/5 5/5 40/40 —
M21 Высокий 0/5 0/5 0/40 0/5
Примечания: 1 — 20 мкг/мл очищенного вируса; 2 — растения исходных нетрансгенных сортов.
ных растений методом микрочеренкования в асептической культуре и размножении клубнями, показали стабильное наследование целевого гена.
Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля
Согласно литературным данным степень устойчивости независимых линий трансгенных растений, полученных в результате трансформации одним и тем же геном растений одного генотипа, может варьировать от крайней устойчивости до восприимчивости (Smith et al., 1995; Romano et al., 2001).
При оценке на вирусоустойчивость нами были использованы 3 способа инокуляции растений картофеля: механическая инокуляция исследуемых образцов очищенным вирусным препаратом YBK, выращивание исследуемых образцов в поле на искусственном инфекционном фоне и прививка на инфицированные YBK растения (томат, табак) (Росс, 1989). Оценку пораженности исследуемых трансгенных растений осуществляли, ис-
пользуя комплекс методов вирусологического анализа: визуальную оценку, индикаторный метод, ИФА.
Механическая инокуляция исследуемых растений картофеля препаратом, содержащим 5 мкг/мл очищенного УВК, оказалась мало эффективной. Симптомы вирусной болезни были отмечены лишь на единичных растениях из числа нетрансформированных сортов и среди нескольких трансгенных линий. Обработка изучаемых образцов ино-кулятом, содержащим 20 мкг/мл очищенного УВК, позволила среди независимых линий трансгенных растений выявить полиморфизм по устойчивости к двум штаммам УВК (табл. 2, 3). В растениях, проявивших симптомы вирусной инфекции, параллельно было подтверждено наличие вирусов. В растениях 3 трансгенных линий (М11, М12, М21), не проявивших симптомов вирусной болезни, вирусы не были выявлены (табл. 2, 3).
Дальнейшее изучение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля проводили в полевых условиях на изолированных от внешней вирусной инфекции участ-
ках. Инокуляция исследуемых растений происходила за счет переноса крылатыми тлями вирусов от высаженных на параллельной борозде, YBKNTN инфицированных растений сорта Самодий кифли. В результате двухлетних испытаний были выявлены 3 линии трансгенных растений картофеля (М11, М12, М21), которые не проявили симптомов вирусной инфекции и по результатам ИФА анализа были свободны от возбудителя болезни — YBK (табл. 2, 3). Положительный контроль заражения, растения нетрансгенных сортов картофеля Минденеш и Самодий кифли сильные симптомы вирусной болезни. Восприимчивые к YBK линии трансгенного картофеля, отличались друг от друга по интенсивности и степени развития симптомов вирусной инфекции.
Трансгенные растения линий М11, М12, М21, выделившихся по вирусоустойчивости в результате лабораторного и полевого опытов, были изучены с помощью инокуляции методом прививки на инфицированные YBKntn растения табака и томата. В ходе изучения на привоях и подвоях картофеля, принадлежащих трансгенным линиям М11, М12 и М21, ни симптомов вирусной болезни, ни вирусов не было обнаружено. В подвое табака и привое томата, а также подвое и привое нетранс-формированного картофеля сорта Минденеш содержание вируса превышало значение в 10—14 и в 6—10 раз соответственно. Таким образом, у растений трансгенных линий картофеля М11, М12 и М21 не удалось вызвать вирусную инфекцию ни одним из выше перечисленных способов. Данный факт свидетельствует о том, что экспрессия PVYNTN-CP гена в трансгенных растениях картофеля линий М11, М12 и М21 полностью подавляет развитие вирусной инфекции и они обладают крайней устойчивостью к YBK. Крайняя устойчивость предполагает отсутствие признаков заражения и накопления вирусов в растении (Росс, 1989).
Согласно литературным данным зависимость степени вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля от уровня экспрессии БО носит неопределенный характер (Angenet et al., 1990; Smith et al., 1995). В настоящей работе экспрессия БО была подтверждена в 33 (89 %) и 3 (75 %) линиях Ктг-регенерантов картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли, соответственно. Высокий уровень экспресии данного белка показан в 30 (81 %) и
2 (50 %) линиях трансгенных растений, полученных из сортов Минденеш и Самодий кифли, соответственно. В тоже время, вирусоустойчивыми оказались только 3 (8 %) линии трансгенных растений, полученные из сорта Минденеш. Как правило, в БО ( + ) трансгенных растениях высокая степень устойчивости достигается в результате многоуровневой защиты. Согласно литературным данным в растениях с высоким уровнем экспрессии интродуцированного БО вируса устойчивость против вирусной инфекции может действовать, по крайней мере, на двух уровнях. Во-первых, это блокирование процесса диссимиляции вирионов YВК, который необходим для
начала синтеза минус-цепи вирусной РНК. Блокирование диссимиляции может происходить в результате непосредственного взаимодействия БО с вирионом и/или посредством конкурентного связывания БО с факторами растения-хозяина, осуществляющими освобождение вирусной РНК из капсида. Во-вторых, экспрессия гена БО может включать в себя взаимодействия БО с вирусной РНК, необходимые для репликации вируса или сборки вирионов, взаимодействия с вирусными белками Nib и репликазой, а также активацию специфических рецепторов растения-хозяина, приводящую к индукции устойчивости к системной инфекции (Beachy, 1997, Дьяков с соавт., 2001).
В восприимчивых к YBK БО ( + ) трансгенных растениях процесс блокирования инфекционного цикла YВК, возможно, недостаточно эффективен для полной защиты от размножения вирусов в клетках растения и дальнейшего их распространения по всему растению. Это может быть связано с тем, что на уровень защиты влияет не только уровень экспрессии гена БО, но и способность белка образовывать внутрикеточные вирусоподобные агрегеты, взаимодействовать с вирусной РНК, белками и рецепторами растения-хозяйна (Дьяков с соавт., 2001). В свою очередь, данная способность зависит от третичной структуры гетерологичного БО, экспресируемого в трансгенных растениях (Beachy, 1997).
Все три линии БО ( — ) трансгенных растений (SK4, M9, M16) оказались восприимчивыми к YBK. Отсутствие детектируемого количества БО, может быть связано с феноменом пост-транскрипционного сплайсинга генов (Дьяков с соавт., 2001). В свою очередь, восприимчивость к вирусу у данных образцов может быть связана с недостаточным количеством (< 3) копий гетерологичного гена, интродуцированных в геном растения-хозяина (Goodwin et al., 1996). Причиной отсутствия экспрессии PVYNTN-CP гена в трансгенных растениях картофеля, также может быть эффект положения интродуцированного гена в геноме растения хозяина (Wittner at al., 1998).
Сравнительное изучение трансгенных растений и растений исходного сорта Минденеш показало, что вирусоустойчивые трансгенные растения картофеля линий М11, М12 и М21 обладают всеми хозяйственноценными свойствами сорта Минденеш. Основными преимуществами данных образцов являются более высокая урожайность в условиях сильного вирусного инфекционного фона, достигающая 43 т/га по сравнению с 19 т/га у нетрансгенного сорта Минденеш, и отсутствие некротических колец вокруг глазков на клубнях вирусоустойчивых трансгенных растений. Таким образом, в данной работе было показано, что с помощью генетической трансформации можно вернуть привлекательность перспективным сортам картофеля, которые не использовались из-за восприимчивости к вирусным болезням.
Полевые эксперименты были проведены в соответствии с авторской лицензией № 54.570/3/2000. Работа выполнена в рамках программ UNESCO/BETCEN и Биотехнология 2000.
Литература
1. Дьяков Ю. Т., Озерецковская О. Л., Джавахия B. Г., Багирова С. Ф., 2001. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Общество фитопатологов, 302 с.
2. Росс Х., 1989. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы. М.: Агропромиздат, 182 с.
3. Шуберт Й., Рубенштайн Ф., Хрцановска М., Шпаар Д., 2004. К проблеме диагностики штаммов Y-вируса картофеля (PVY) // Вестник защиты растений. Т. 3. С. 3—10.
4. An G., Watson B. D, Chiang C. C, 1986. Transformation of Tabacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thali-ana Using a Binary Ti Vector System // Plant Physiology. Vol. 81. P. 301-305.
5. Anjum M. A., Ali H., 2004. Effect of Culture Medium on Direct Organogenesis from Different Explants of Various Potato Genotypes // Biotechnology. Vol. 3. P. 187— 193.
6. Angenent G. C., Van Den Ouweland J. M. W., Bol J. F., 1990. Susceptibility to virus infection of transgenic plants expressing structural and non-structural genes of tobacco rattle virus // Virology. Vol. 175. P. 191 — 198.
7. Beachy R. N., 1997. Mechanisms and applications of pathogen-derived resistance in transgenic plants // Current Opinion in Biotechnology. Vol. 8. P. 215—220.
8. Beczner L., Horvath J., Romhanyi I., Forster H, 1984. Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato // Potato Res. Vol. 27. P. 339—352.
9. Borque J. E., Miller J. C., Park W. D., 1987. Use of an in vitro tuberization system to study tuber protein gene expression // In Vitro Cellular and Development Biology Vol. 23. P. 381—386.
10. Clark M. F., Adams A. N., 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses // J. Gen. Virol. Vol. 34. P. 475—483.
11. Esna-Ashari M., Villiers T. A., 1998. Plant regeneration from tuber discs of potato (Solanum tuberosum L.) using 6-benzylaminopurine (BAP) // Potato Research. Vol. 41. P. 371—382.
12. Feher A., Skryabin G. K., Balazs E. et al., 1992. Expression of PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants // Plant Cell Report. Vol. 11. P. 48—52.
13. Gonsalves D., Slightom J. L., 1993. Coat-protein-mediated protection: analysis of transgenic plants for resistance in a variety of crops // Semin. Virol. Vol. 4. P. 397—405.
14. Hansen J., Nielsen B., Nielsen S. V. S., 1999. In vitro shoot regeneration of Solanum tuberosum cultivars: interactions of medium composition and leaf, leaflet, and explant position // Potato Research. Vol. 42. P. 141151.
15. Harrison B. D, Robinson D. J., 2005. Another quarter century of great progress in understanding the biological properties of plant viruses // Annals of Applied Biology. Vol. 146. P. 15-37.
16. Hassairi A., Masmoudi K., Albouy J. et al., 1998. Transformation of two potato cultivars 'Spunta' and Claustar' (Solanum tuberosum) with lettuce mosaic virus coat protein gene and heterologous immunity to potato virus Y // Limerick.: Plant Sci. Vol. 136. P 31-42.
17. Heeres P., Schippers-Rozenboom M., Jacobsen E, Visser R. G. F., 2002. Transformation of a large number of potato varieties: genotype-dependent variation in efficiency and somaclonal variability // Euphytica. Vol. 124. P. 13-22.
18. Horvath S., Wolf I., 1999. Virological problems of potato production in Hungary // Abstracts of the 14th Conference of the European Association of Potato Research P. 383-384.
19. IshidaB. K, Snyder G. W., Belknap W. R., 1989. The use of in vitro grown microtuber disks in Agrobacterium-mediated transformation of Russet Burbank and Lehni Russet potatoes // Plant Cell Report. Vol. 8. P. 325-328.
20. Jozsa R., Stasevski Z., Balazs E., 2002. High level of field resistance of transgenic tobaccos induced by integrated potato virus Y coat protein gene // Acta Phy-topathologica et Entomologica Hungarica. Vol. 37 (4). P. 311-316.
21. KollarA., Thole V., Dalmay T., Salamon, P., BalazsE., 1993. Efficient pathogen-derived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco // Biochimie. Vol. 75. P. 623-629.
22. Lawson C., Kaniewski W., Haley L. et al., 1990. Engineering resistance to mixed virus infection in a commercial potato cultivar: Resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic Russet Burbank // Bio/ Technology. Vol. 8. P. 127-134.
23. Miller J. H., 1972. Experiments in molecular genetics. New York.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. P. 184-193.
24. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plant. Vol. 15. P. 473-497.
25. Okamoto D., Nielsen S. V. S., Albrechtsen M., Bork-Hardt B., 1996. General resistance against potato virus Y introduced into a commercial potato cultivar by genetic transformation with PVYN coat protein gene // Potato Res. Vol. 39. P. 271-282.
26. Powell-AbelP., Nelson R. S., De B., et al., 1986. Delay of disease development in transgenic plants that express
the tobacco mosaic virus coat protein gene // Science. Vol. 232. P. 738-743.
27. Romano E., Ferreira A. T., Dusi A. N. et al., 2001. Extreme resistance to two Brazilian strains of Potato virus Y (PVY) in transgenic potato, cv. Achat, expressing the PVY0 coat protein // Horticulture Brasileira. Vol. 19. P. 118-122.
28. Rubino L., Carrington J. C., Russo M., 1992. Biologically active cymbidium ringspot virus satellite RNA in transgenic plants suppresses accumulation of DI RNA // Virology. Vol. 188. P. 429-437.
29. Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T., 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
30. Wittner A., Palkovics L., Balazs E., 1998. Nicotiana benthamiana plants transformed with the plum pox virus helicase gene are resistant to virus infection // Virus Research, Vol. 53. P. 97-103.
31. Solomon-Blackburn R. M., Barker H., 2001-a. A review of host major-gene resistance to potato viruses X, Y, A and V in potato, genes, genetics and mapped locations // Heredity, Vol. 86. P. 8-16.
32. Solomon-BlackburnR. M., BarkerH., 2001-b. Breeding virus-resistant potatoes (Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches // Heredity. Vol. 86. P. 17-35.
33. Thole V., Dalmay T., Burgyan J., Balazs E., 1993. Cloning and sequencing of potato virus Y (Hungarian isolate) genomic RNA // Gene. Vol. 123. P. 149-156.
34. Weidemann, H.-L., 1988. Importance and control of potato virus YN (PVYN) in seed potato production // Potato Research. Vol. 31. P. 85-94.
35. Zambryski P., Joos H., Genetello C. et al., 1983. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. Vol. 2. P. 2143-2150.
PVYNTN-СР coat protein gene mediated virus resistance of transgenic potato plants
Z. Stasevski, O. N. Ilinskaja
' SUMMARY: PVYntn-CP coat protein gene from a necrotic strain of potato virus Y (Pvyntn) has been transferred into two potato Solanum tuberosum L. cultivars Mindenes and Somogyi kifli via Agrobacterium tumefaciens transformation. Expression of integrated PVYNTN-CP gene were confirmed for 33 (89 %) of 37 and 3 (75 %) of 4 kanamycin-resistant regenerants of potato cultivars Mindenes and Somogyi kifli respectively. The level of virus resistance against two virus strains (PVY3, PVYntn) of independent lines of transgenic potatoes varied between extreme resistance to susceptibility. The three independent lines of transgenic potatoes proved to be extreme resistant against both PVY strains.
' KEY WORDS: potato virus Y; virus coat protein; genetic transformation; transgenic plants.
' Информация об авторах
Сташевски Зенон — зав. лабораторией селекции картофеля.
ГНУ «татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» Россельхозакадемии.
420059, г. Казань, оренбургский тракт, 48 E-mail: zenons@bk.rn
Ильинская Ольга Николаевна — зав. кафедрой микробиологии, д. б. н., профессор.
КГУ
420008, Россия, Казань, ул. Кремлевская 18.
E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.m
Stasevski Zenon — head of the department.
Tatar research institute of agricultur.
420059, Kazan, Orenburgsky Trakt str., , 48 E-mail: zenons@bk.ru
Ilinskaja Olga Nikolaevna — head of the department, doctor of biological science, professor.
Kazan State University
Russia, 420008, Kazan, Kremlevskaya str., 18
E-mail: 0lga.Ilinskaya@ksu.ru
