CC BY
115
УДК 632.9:632.935.11:632.934.3:635.21:573.6.086.83
ОЗДОРОВЛЕНИЕ ОТ ВИРУСА СКРУЧИВАНИЯ ЛИСТЬЕВ КАРТОФЕЛЯ ЧИЛИЙСКИХ ОБРАЗЦОВ SOLANUM TUBEROSUM С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ КРИОТЕРАПИИ И КОМПЛЕКСНОЙ ХИМИО-, ТЕРМОТЕРАПИИ
Ю.В. УХАТОВА, младший научный сотрудник (e-mail: [email protected])
О.Ю. АНТОНОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Т.А. ГАВРИЛЕНКО, доктор биологических наук, зав. отделом
Федеральный исследовательский центр «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР)», ул. Большая Морская, 42-44, Санкт-Петербург, 190000, Российская Федерация
Резюме. Сохранение ex situ коллекций культурных видов картофеля требует разработки эффективных методов оздоровления от вирусов коллекционного материала. В работе проведено сравнение методов терапии, использованных для оздоровления растений картофеля от одного из наиболее распространенных и вредоносных вирусов - ВСЛК (вируса скручивания листьев картофеля). Работа выполнена в отделе биотехнологии ВИР в 2014-2016 гг. Материалом для исследования послужили растения 15 образцов аборигенных чилийских сортов картофеля (Solanum tuberosum L.), длительное время репродуцированные в полевой коллекции ВИР, а также полученные на их основе in vitro растения, у которых наличие ВСЛК было подтверждено иммунофер-ментным и ОТ-ПЦР анализами. Комплексная антивирусная терапия состояла из трех последовательных циклов, каждый из которых включал проведение химиотерапии и термотерапии (выращивание в течение 4 недель при температуре 35°С микрорастений на среде с рибавирином в концентрации 30 мг/л). Криотерапия была проведена с использованием протокола дроплет-витрификации; длительность экспозиции растительного материала в жидком азоте составила 1 ч. Наличие / отсутствие ВСЛК в микрорастениях до и после проведения антивирусной терапии тестировали методом ОТ-ПЦР. Полученные результаты указывают на более высокую (р < 0,05) эффективность метода криотерапии, по сравнению с комплексной терапией. Доля оздоровленных от ВСЛК микрорастений картофеля при использовании комплексной терапии составила 63,2%, а при применении криотерапии - 92,9%.
Ключевые слова: картофель, коллекции, ВСЛК, криотерапия, комплексная химиотерапия и термотерапия, безвирусные растения.
Для цитирования: Ухатова Ю.В., Антонова О.Ю., Гавриленко Т.А. Оздоровление от вируса скручивания листьев картофеля чилийских образцов Solanum tuberosum с использованием методов криотерапии и комплекснойхимио-, термотерапии// Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. №10. С. 56-60.
Коллекция ВИР насчитывает более 8500 образцов [1] культурных и дикорастущих видов картофеля, селекционных сортов и гибридных форм. Ценный материал коллекции - чилийские аборигенные сорта (Solanum tuberosum L.), которые представляют интерес как для фундаментальных исследований вопросов происхождения возделываемого картофеля, так и для селекционной работы. Например, более 60% селекционных сортов картофеля содержат Т-тип (или чилийский тип) цитоплазмы [2]. Образцы чилийских аборигенных сортов поступали в коллекцию ВИР в результате экспедиционных сбо-
ров сотрудников института, а также в ходе обменов между мировыми генбанками. Эти образцы многие десятки лет поддерживали в полевой коллекции ВИР на основе клубневых репродукций, что, судя по визуальным симптомам, привело к накоплению вирусных инфекций.
На сегодняшний день известно около 40 вирусов, поражающих картофель [3]. Самые вредоносные из них: вирус картофеля Y (YBK), вирус картофеля M (МВК), вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), вирус картофеля S (SBK), вирус картофеля X (ХВК), вирус картофеля A (АВК) [3]. Все они широко распространены в зонах выращивания культуры в разных странах и встречаются на территории России [3, 4, 5].
Вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК) -Potato Leafroal Virus (PLRV) - относится к группе Polerovirus. Его геном представлен линейной одно-цепочечной молекулой РНК [1]. ВСЛК распространяется по растению по сосудам флоэмы [5]. В полевых условиях этот вирус передается несколькими видами тлей, но главным образом - Myzuspersicae Sulz. (персиковой тлей) [3,5].
Существует несколько способов оздоровления растений от вирусных инфекций: культура верхушечных меристем, химиотерапия, термотерапия, криотерапия, электротерапия и комплексная терапия, сочетающая в разных комбинациях перечисленные методы [1, 6-15].
Согласно литературным данным (табл. 1), эффективность оздоровления инфицированных ВСЛК растений зависит от способа терапии. Так, наилучшие результаты обеспечивает криотерапия [8] либо комплексная терапия, сочетающая термотерапию с культурой меристем [8, 13], при необходимости дополняемая химиотерапией [15]. Наименее эффективным оказалось использование методов химиотерапии с применением рибавирина [9] и культуры меристем [8]. Судя по литературным данным, достаточно эффективным может быть метод термотерапии [8], хотя прямых указаний на термолабильность вируса ВСЛК мы не нашли.
Для оздоровления от наиболее вредоносных вирусов больших коллекций картофеля, содержащих тысячи образцов, в генбанках Перу (CIP) и Германии (IPK) апробирован метод комплексной химио- и термотерапии [7]. В то же время в литературных источниках существуют противоречия (см. табл. 1) относительно эффективности использования такого подхода. Так, комплексная терапия, сочетающая химиотерапию с рибавирином и термотерапию, по данным одних авторов оказалась безрезультатной [9, 10], а другие исследователи с использованием такого же метода получили от 47 до 100% оздоровленных растений [11, 12, 14], что указывает на необходимость проведения дальнейших исследований
Таблица 1. Эффективность различных методов оздоровления микрорастений картофеля от ВСЛК
Метод оздоровления Число изученных образцов Эффективность оздоровления, %* Ссылка
Культура меристем 1 генотип ++ [8]
Химиотерапия 18 сортов и 6 диких видов - [9]**
(рибавирин) 6 сортов + [10]
1 сорт + [11]
Термотерапия 1 генотип ++ [8]
Криотерапия 1 генотип ++++ [8]
Комплексная терапия:
Химио- (рибавирин) и термо- 18 сортов и 6 диких видов - [9]**
терапия 6 сортов - [10]
2 сорта ++ [11]
2 сорта +++ [12]
Большие коллекции [7]
Термотерапия и культура 3 клона ++++ [13]**
меристем 1 генотип [8]
Химиотерапия(рибавирин) и 4 сорта ++ [14]**
культура меристем
Термо-, химиотерапия и 4 сорта ++++ [15]**
культура меристем
*эффективность терапии:«-» - нет эффекта оздоровления;«+» - до 40%, «++» - 50-60%, «+++» - 61-89%, «++++» - 90-98% оздоровленных растений;
**наличие ВСЛК тестировали методом ИФА (в остальных случаях - ОТ-ПЦР).
Для генбанков особый интерес представляет метод криотерапии,поскольку использование такой технологии позволяет решать одновременно две задачи: долгосрочное сохранение криоколлекции и получение оздоровленных криорегенерантов. При погружении в жидкий азот (-196°С) жизнеспособность сохраняют только клетки в зоне апикальных меристем (Apical Dome =AD) и первых двух листовых примордиев, которые потенциально свободны от вирусов. Таким образом, криотерапия «работает» как микроскальпель, отсекая пораженные вирусом более крупные и гидратированные клетки вне мери-стемной зоны, погибающие из-за травм, вызванных криозамораживанием [16, 17]. Есть сообщения об успешном использовании метода криотерапии с помощью которого были получены свободные от ВСЛК криорегенеранты картофеля (83-86%) в опытах по криоконсервации почек микрорастений пораженных вирусом [8].
Таким образом, судя по литературным данным, эффективность оздоровления растений картофеля от ВСЛК варьирует в широких пределах в зависимости от используемых методов антивирусной терапии. При этом подавляющее число исследований было выполнено на единичных генотипах (сортах), что может частично объяснять противоречия в литературных данных, поскольку эффективность оздоровления зависит и от этого фактора [8].
Цель наших исследований - изучение эффективности оздоровления микрорастений картофеля от ВСЛК при использовании различных методов антивирусной терапии.
Условия, материалы и методы. Работа выполнена с использованием таксономически однородного материала и привлечением сравнительно большого числа генотипов. Материалом для исследований послужили растения 15 образцов чилийских аборигенных сортов картофеля S. tuberosum, пораженных
1. Тестирование микрорастений методом ОТ-ПЦР на наличие ВСЛК_
2. Микроразмножение in vitro растений, инфицированных ВСЛК_
3. Оздоровление микрорастений_
3.1. Комплексная химио- и термотерапия:_
Этап 3.1.1. Черенкование микрорастений по 10-20 безлиственных черенков каждого генотипа на среде МС без
гормонов; культивирование 4 недели при 35°С_
Этап 3.1.2. Формирование безлиственных черенков; культивирование микрорастений на среде МС+30 мг/л ри-
бавирина в течение 2-3 дн. при 20°С, затем 4 недели при 35°С_
Этап 3.1.3. Формирование безлиственных черенков; культивирование микрорастений на среде МС+30 мг/л ри-
бавирина в течение 2-3 дн. при 20°С, затем 4 недели при 35°С_
Этап 3.1.4. Формирование безлиственных черенков; культивирование микрорастений на среде МС+30 мг/л ри-
бавирина в течение 4 недель при 20°С._
Этап 3.1.5. Перенос микрорастений на среду МС без гормонов, культивирование 4 недели при 20°С в течение
2 мес. Выделение РНК_
3.2. Криотерапия:_
Этап 3.2.1. Черенкование микрорастений по 30 черенков на среде МС без гормонов; культивирование 3 недели
при 25°С_
Этап 3.2.2. Изоляция эксплантов почек в жидкую среду МС, обработка растворами для осмо- и криопротекции
(LS, PVS2)___
Этап 3.2.3. Замораживание эксплантов в жидком азоте на 1 ч_
Этап 3.2.4. Оттаивание эксплантов в растворе (RS)_
Этап 3.2.5. Учет регенерационной способности в течение 8 недель. Выделение РНК из 8-недельных криорегенерантов_
4. Тестирование микрорастений методом ОТ-ПЦР на наличие ВСЛК_
5. Микроразмножение оздоровленного от ВСЛК материала_
Рис.1. Схемы оздоровления микрорастений картофеля от ВСЛК методами комплексной терапии и криотерапии, использованные в работе.
Таблица 2. Праймеры для выявления ВСЛК
Детектируемый патоген Праймер Последовательность (5' -3') Tm Ссылка
ВСЛК Контроль эффективности обратной транскрипции PLRV-f PLRV-r tubul-f tubul-r cgcgctaacagagttcagcc gcaatgggggtccaactcat atgttcaggcgcaaggctt tctgcaaccgggtcattcat 58 53 [24] [25]
ВСЛК, из полевой коллекции ВИР. Наличие ВСЛК в растениях было детектировано методом иммуно-ферментного анализа [18]. Для проведения работ по оздоровлению этих образцов коллекции была инициирована культура in vitro протестированных клонов с использованием в качестве эксплантов апексов крупного (2-4 мм) размера. У полученных микрорастений наличие ВСЛК было подтверждено методом ОТ-ПЦР. В дальнейшую программу по оздоровлению от ВСЛК с применением методов комплексной терапии и криотерапии были включены 20 клонов 15 образцов. В том числе в программу комплексной терапии было включено 19 из 20 клонов, поскольку в литературе отмечено существенное снижение жизнеспособности микрорастений при длительном действии повышенной температуры и антивирусных препаратов [8, 14]. Для инициации работ по криотерапии использовали 1 из 20 образцов - к-7540_ВСЛК.
В основу схемы опыта по комплексной термо- и химиотерапии (рис. 1) были взяты протоколы, принятые в генбанках CIP и IPK [7].-
Для криотерапии использовали протокол дроплет-витрификации [19], который ранее показал свою эффективность при криоконсервации образцов культурных видов картофеля [20]. Исходные in vitro растения образца к-7540_ВСЛК культивировали 34 недели на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) при температуре 22°C с 16-часовым фотопериодом. Для криотерапии картофеля изолировали почки размером 1,8-2,5 мм, которые помещали в жидкий раствор LS, через 20 мин их погружали в раствор PVS2 (при 0°C) на 30 мин. После этого почки переносили в индивидуальные капли раствора PVS2 на полоски алюминиевой фольги и быстро погружали в жидкий азот на 1 ч. Экспланты оттаивали в растворе RS в течение 15 мин при комнатной температуре, затем помещали на питательную среду МС с фитогормонами зеатин-рибозидом, ИУК и ГК [21].
Тестирование растительного материала на наличие вирусов методом ОТ-ПЦР. Тотальную РНК картофеля, потенциально включающую РНК вирусных геномов, выделяли из нижних листьев и частей стебля развитых пробирочных растений с использованием коммерческого набора «Выделение тотальной РНК на магнитных частицах, покрытых SiO2» фирмы Силекс М [22]. Полученные препараты хранили при минус 70°С.
Обратную транскрипцию проводили при помощи набора «Синтез первой цепи кДНК (рендом)» фирмы Силекс [23], использующего в качестве затравки смесь случайных гексануклеотидных праймеров. Такой подход позволял одновременно получать кДНК для всех вирусных РНК, а также для иРНК гена белка тубулина, которую использовали в качестве контроля успешности синтеза матрицы. Синтез первой нити кДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 2 мкл РНК, 1 х реакционный буфер, 400 мкМ dNTP's, 0,5 мкг смеси случайных гексапрай-меров, 1 ед./мкл РНКазина, 4 ед. обратной транс-криптазы M-MLV-OT. Для отжига гексануклеотидных
праймеров инкубировали смесь в течение 10 мин при 25°С и затем в течение 60 мин. при 37°С. Полученную матрицу использовали для проведения ПЦР.
Для тестирования микрорастений картофеля на наличие ВСЛК использовали праймеры, специфичные к последовательностям генома этого вируса [24]. Контролем эффективности синтеза матрицы служила реакция с праймерами, специфичными к последовательности гена белка тубулина, который постоянно экспрессируется в клетках растений [25] (табл. 2).
В качестве позитивных контролей использовали исходные микрорастения каждого клона (растительный материал фиксировали до начала антивирусной терапии) - 20 клонов 15 образцов. В качестве негативного контроля брали воду. Методом ОТ-ПЦР на наличие ВСЛК тестировали растения, полученные после применения комплексной химио- и термотерапии (см. табл. 2) и после криотерапии (14 криорегенеран-тов одного исходного клона образца к-7450_ВСЛК).
Температура отжига праймеров и условия ПЦР в целом соответствовали указанным разработчиками праймеров (см. табл. 2), однако в целях увеличения специфичности реакции все используемые программы на первом этапе были дополнены 5 циклами с функцией TOUCHDOWN. В первом цикле температуру отжига праймеров принимали на 5°С выше необходимой и затем в каждом цикле понижали на 1°С.
ПЦР-продукты разделяли при помощи электрофореза в 2,5%-ных агарозных гелях. Для определения молекулярного веса полученных фрагментов использовали стандарты «100 bp+1500» фирмы Си-бЭнзим [26]. Гели окрашивали бромистым этидием с последующей визуализацией фрагментов ДНК в УФ-свете.
Результаты и обсуждение. Оздоровление образцов аборигенных чилийских сортов картофеля от ВСЛК методом комплексной терапии. С использова-
Таблица 3. Результаты оздоровления образцов аборигенных чилийских сортов S. tuberosum от ВСЛК методом комплексной терапии (по данным ОТ-ПЦР-анализа)
Число растений (клонов)
Номер к-ВИР с ВСЛК до на- оздоровленных
чала терапии от ВСЛК
7528 2 2
3407а 2 2
7586 3 3
10648 2 0
7568 1 1
24602 1 1
3446 1 0
2117 (В-206) 1 1
7583 1 1
3488 1 0
7529 1 0
2148 (Юз-8973) 1 1
3456 1 0
7573 1 0
ВСЕГО 19 12 (63,2%)
Рис. 2. Криорегенеранты клона № к-7450_ВСЛК на 8-ой неделе культивирования после оттаивания.
нием метода комплексной химио- и термотерапии были оздоровлены 12 из 19 (63, 2%) микрорастений, которые представляли 8 из 14 (53,2%) коллекционных образцов (табл. 3).
Полученные результаты в 2,5 раза превысили данные Dhital Б.Р. с соавторами [11], которые сообщали о 25% оздоровленных от ВСЛК микрорастений одного сорта картофеля с использованием сходного
Оздоровление микрорастений аборигенных чилийских сортов картофеля методом криотерапии. В экспериментах по криоконсервации с использованием метода дроплет-витрификации образец № к-7450_ВСЛК проявил достаточно высокий уровень регенерационной способности: после оттаивания - из 60 эксплантов 28 (46,7%) сформировали криорегенеранты (рис. 2).
Методом ОТ-ПЦР был подтвержден безвирусный статус 13 из 14 криорегенерантов после проведенной криотерапии (рис. 3), то есть произошло оздоровление 92,9% образцов.
Полученные результаты указывают на более высокую (р < 0,05) эффективность криотерапии, по сравнению с комплексной терапией - 92,9 и 63,2% соответственно. Наши результаты согласуются с литературными данными [8]. Так, используя криотерапию для оздоровления от ВСЛК одного образца картофеля, Q.C. Wang с коллегами [8] получили от 83 до 86% безвирусных регенерантов (в зависимости от протокола криоконсервации). По эффективности оздоровления метод криотерапии от ВСЛК оказался сравним с вариантом комплексной терапии (90%), сочетающей комбинацию методов термотерапии и последующего вычленения меристем [8]. В то же время, использование криотерапии имеет ряд преимуществ. Например, этот метод открывает возможности для быстрого одновременного оздоровления большого количества образцов (что особенно важно для генбанков), поскольку для получения
Рис. 3. Тестирование in vitro растений клона № к-7450_ВСЛК на наличие вируса ВСЛК при помощи метода ОТ-ПЦР (вариант опыта - оздоровление методом криотерапии): а - ПЦР с праймерами, специфичными к последовательностям генома ВСЛК, М - маркер молекулярного веса; б - ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности гена белка тубулина; 1 - исходное микрорастение (до криотерапии), 2-15 - криорегенеранты, 16 - вода.
подхода (химиотерапия - рибавирин 20 мг/л, термотерапия - день 35°С/ночь 31°С - в течение 30 дн.). В дальнейшем эти же авторы [11], увеличили выход безвирусных растений, применив модифицированный метод (дополнили рибавирин ацетилсалициловой кислотой, используя 3 цикла комплексной терапии по 30-36 дн.); в результате было получено 59 и 48% оздоровленных от ВСЛК растений двух других сортов картофеля. В более ранних исследованиях [12] с удлиненным циклом терапии, длившимся более 6 недель, те же авторы полностью оздоровили от ВСЛК один сорт и получили 69% оздоровленных микрорастений другого сорта. Стоит отметить, что в нашей работе без применения дополнительных реагентов получены сравнимые результаты эффективности комплексной терапии, но для большего числа генотипов.
терапевтического эффекта достаточно погружения в жидкий азот эксплантов всего на 1-2 ч [16, 17]. Следует также отметить, что применение криотерапии позволяет одновременно помещать образцы на длительное криохранение, что, несомненно, служит большим достоинством такого метода оздоровления [16, 17].
Выводы. Результаты исследований показали, что эффективность оздоровления микрорастений картофеля от ВСЛК методом криотерапии (92,9%) была существенно (р<0,05) выше, чем при использовании комплексной терапии (63,2%), предусматривающей сочетание химиотерапии (30 мг/л рибавирина) с термотерапией (35°С). Полученные результаты позволяют рекомендовать метод криотерапии для оздоровления микрорастений картофеля от ВСЛК.
Литература.
1. Киру С.Д. Историческое и современное значение мировой коллекции картофеля ВИР// Проблемы систематики и селекции картофеля. Тезисы докл. Междунар. Научн. Конф., посв. 125-летию со д.р. С.М. Букасова. СПб: ВИР, 2016. С. 11-12.
2. Гавриленко Т.А., О.Ю. Антонова, Л.И. Костина. Изучение генетического разнообразия сортов картофеля с использованием ПЦР анализа ДНК органелл // Генетика. 2007. Т. 43. № 11. С. 1550-1555.
3. Virus and Virus-like Diseases of Potatoes and Production of Seed Potatoes / G. Loenbenstein, P.H. Berger, A.A. Brunt, R.H. Lawson, eds. 2001. The Netherlands: KluwerAcademic Publishers. 284 p.
4. Рогозина Е. В. Сравнительное изучение способов оздоровления картофеля от вирусов в культуре ткани: автореф. дис. канд. с-х. наук. СПб, 1991. 18 с.
5. Лебенштейн Г. Вирус скручивания листьев картофеля//Вирусные и вирусоподобные болезни и семеноводство картофеля /под ред. Г. Лебенштейна, Ф.Х. Бергера, А.А. Бранта, Р.Х. Лоусона /пер. с англ. Э.В. Трускинова. СПб: Инновационный центр защиты растений, 2005. С. 14-19.
6. Власов Ю.И., Ларина Э.И., Трускинов Э.В. Сельскохозяйственнаяфитовирусология. СПб-Пушкин: ФГБНУ ВИЗР, 2016. 236с.
7. Jeffries C.J. (ed.). FAO/IPGRI Technical Guidelines for the Safe Movement of Potato Germplasm. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome/International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy, 1998. 26 p.
8. Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of Potato leaf roll virus (PLRV) and Potato virus Y (PVY) / Q.C. Wang, Y. Liu, Y.H. Xie, M. You//Potato Res. 2006. V. 49. Pp. 119-129.
9. Griffiths H.M., Slack S.A., Dodds J.H. Effect of chemical and heat therapy on virus concentration in in vitro plantlets // Can. J. Bot. 1990. V.68. Pp. 515-521.
10. Faccioli G., Colalongo M.C. Eradication of Potato virus Y and Potato leafroll virus by chemotherapy of infected potato stem cuttings// Phytopathol. Mediterr. 2002. V. 41. Pр. 76-78.
11. Dhital S. P., Sakha B. M., Lim H. T. Utilization of shoot cuttings for elimination of PLRV and PVY by thermotherapy and chemotherapy from potato (Solanum tuberosum L.) // Nepal Journal of Science and Technology. 2007. V. 7. Pp. 1- 6.
12. Dewi I.S., Slack S.A. Therapy cycling to eliminate high- titered, multiple virus infection in vitro potato plantlets // Bul. Agron. 1994. V22. No. 2. Рр. 35 - 43.
13. Paet C.N., Zamora A.B. Efficacy of thermotherapy and group culture of isolated potato meristems for the elimination of single and mixed infections of Potato Virus Y, Potato Virus S and Potato Leaf Roll Virus // Philipp. J. Crop. Sci. 1990. V. 15. No. 2. Рр. 113-118.
14. Influence of ribavirin on potato plants regeneration and virus eradication / O. Danci, L. Erdei, L. Vidacs, M. Danci, A. Baciu, I. David, F. Berbentea // J. of Horticulture, Forestry and Biotechnology. 2009. V. 13. Pр. 421-425.
15. Awan A. R., Mughal S.M., Iftikhar Y. In Vitro Elimination of Potato Leaf Roll Polerovirus from Potato Varieties // European Journal of Scientific Research. 2007. V.18. No.1. Pp. 155-164.
16. Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen eradication to produce healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation / Q.C. Wang, B. Panis, F. Engelmann, M. Lambardi, JPT. Valkonen //Ann. Appl. Biol. 2009. V. 154. Pр. 351-363.
17. Potential applications of cryogenic technologies to plant genetic improvement and pathogen eradication/B. Wang, R.-R. Wang, Z.-H. Cui, W.-L. Bi, J.-W. Li, B.-Q. Li, E.A. Ozudogru, G.M. Volk, Q.-C. Wang // Biotechnology Advances. 2014. V. 32. Рр. 583-595.
18. Элиминация вирусных инфекций из микрорастений образцов культурных видов картофеля / О.В. Апаликова, О.Ю. Антонова, Ю.В. Ухатова, А.Р. Шувалова, О.Ю. Шувалов, Е.А. Крылова, Т.А. Гавриленко//Проблемы систематики и селекции картофеля. Тезисы докл. Междунар. Научн. Конф., посв. 125-летию со д.р. С.М. Букасова. СПб: ВИР, 2016. С. 31-32.
19. Panis B., Piette B., Swennen R. Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all Musaceae // Plant Sci. 2005. V.168. Pp. 45-55.
20. Shvachko N., Gavrilenko T. Cryopreservation of potato landraces using droplet-vitrification method // In: Proceeding of COST Action 871 Cryopreservation of crop species in Europe Final meeting. Grapin A., Keller J., Lynch P., Panis B., Revilla A., Engelmann F. еds. Angers, 8-11 Feb. 2011. Luxembourg, Pр. 135-137.
21. Сохранение вегетативно размножаемых культур в in vitro и криоколлекциях: методические указания / С.Е. Дунаева, Г.И. Пендинен, О.Ю. Антонова, Н.А. Швачко, Н.Н. Волкова, Т.А. Гавриленко / под. ред. Т.А. Гавриленко. СПб: ГНУ ВИР Рос-сельхозакадемии, 2011. 64 с.
22. Набор «Выделение тотальной РНК на магнитных частицах, покрытых SiO2». URL: http://www.sileks.com/ru/production. php?folder=189 (дата обращения 25.08.2016).
23. Набор «Синтез первой цепи кДНК (рендом)» фирмы Силекс. URL: http://www.sileks.com/ru/production.php?folder=65 (дата обращения 25.08.2016).
24. Singh R.P. Development of the molecular methods for potato virus and viroid detection and prevention // Genome. 1999. V. 42. Pp. 592-604.
25. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress / N. Nicot, J.F. Hausman, L. Hoffmann, D. Evers// Journal of Experimetnal Botany. 2005. V.56. No 421. Pр. 2907-2914.
26. Стандарты молекулярного веса «100 bp+1500». URL: http://russia.sibenzyme.com/info781.php (дата обращения 25/08/2016).
ERADICATION OF POTATO LEAFROLL VIRUS IN CHILEAN SAMPLES OF SOLANUM TUBEROSUM USING CRYOTHERAPY AND COMPLEX CHEMO- AND THERMOTHERAPIES
Y.V. Ukhatova, O.Y. Antonova, T.A. Gavrilenko
Federal Research Center «the N.I. Vavilov All-Russion Institute of Plant Genetic Resources (VIR)», ul. Bol'shaya Morskaya, 42-44, Sankt-Peterburg, 190000, Russian Federation
Summary. Ex situ preservation of collections of cultivated species of potato requires the development of effective methods for eradication of viruses from the collection material. This article presents the comparison of two methods of virus eradication, used to remove one of the most common and harmful virus - PLRV (potato leafroll virus) from potato plants. The work was carried out in the biotechnology department of N.I.Vavilov Institute of Plant Genetic Resources (VIR) in 2014-2016. The material for the study consisted of plants of 15 samples of aborigine Chilean cultivars of potato (Solanum tuberosum L.), which were reproduced for a long time in the field collection of VIR, and also derived from them in vitro plants, in which the presence of PLRV was confirmed by enzyme immunoassay and RT-PCR. The complex therapy included three successive cycles, each of which consisted of chemotherapy and thermotherapy (cultivation of microplants for 4 weeks at 35 degrees on a medium containing ribavirin in the concentration of 30 mg/l). Cryotherapy was performed using the droplet-vitrification protocol; the duration of the exposure of plant material in liquid nitrogen was 1 hour. The presence or absence of PLRV in microplants before and after the therapy was tested by RT-PCR. The results indicate higher (p is less than 0.05) efficiency of cryotherapy compared with the complex therapy. Percentage of virus-free from PLRV potato microplants in the case of complex therapy was 63.2%, and after application of cryotherapy - 92.9%. Keywords: potato, collections, PLRV, cryotherapy, complex chemotherapy and thermotherapy, virus-free plants. Author Details: YV. Ukhatova, junior research fellow (e-mail: [email protected]); O.Y Antonova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; T.A. Gavrilenko, D. Sc. (Biol.), head of division
For citation: UkhatovaYV., Antonova O.Y, Gavrilenko T.A. Eradication of Potato Leafroll Virus in Chilean Samples of Solanum tuberosum Using Cryotherapy and Complex Chemo- and Thermotherapies. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2016. V.30. No. 10. Pp. 56-60 (in Russ.).
