CC BY
76
УДК [634.741:641.524.6].004.12
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ALOCASIA MACRORRHIZA
© Е.А. Антипова1, С.М. Юдина1, Л.Е. Тимофеева1, Е.А.Лейтес2
1 Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина, 40 Барнаул (Россия), e-mail:rector@medlink.ru
2Алтайский государственный университет, пр. Ленина, 61, Барнаул, 656099 (Россия), e-mail: leites@chemwood.dcn-asu.ru
Изучен состав биологически активных соединений, содержащихся в лекарственном растении Alocasia makrorrhiza. Установлено наличие алкалоидов, флавоноидов и кумаринов. Содержащийся в Alocasia makrorrhiza алкалоид близок по структуре к хинину и аймалину. Идентифицированы флавоноиды - гиперозид, ликурозид и кверцетин.
Введение
Растения - ценный природный источник лекарственного сырья. Алоказия крупнокорневая (Alocasia makrorrhiza (L.) G. Don [1]) семейства ароидных - это многолетнее растение, достигающее 2-3 м высоты. Распространено во влажных тропических лесах Азии. В мире существует более 70 видов многолетних клубневых растений рода алоказия. В России несколько разновидностей алоказии выращивают как декоративное растение.
Alocasia makrorrhiza (L.) - широко используемое средство в народной медицине при онкологических заболеваниях, туберкулезе, заболеваниях верхних дыхательных путей, как ранозаживляющее и противовоспалительное. С этой точки зрения важно, какие вещества, в том числе и биологически активные соединения, содержатся в данном лекарственном сырье. Известно, что флавоноиды, содержащиеся в растительном сырье, например дигидрокверцетин, могут проявлять себя как антиоксиданты [2], а некоторые алкалоиды, например винбластин и винкристин, обладают противоопухолевой активностью [3].
Состав растения практически не изучен. Имеющиеся публикации в основном относятся к условиям произрастания, фотосинтеза [4-14]. Из немногочисленных источников известно, что сок растения ядовит и что в алоказии содержатся углеводы, жиры, витамины, соединения ртути, цианиды [15-17].
Целью данной работы является обнаружение основных групп биологически активных веществ.
Экспериментальная часть и обсуждение результатов
Для проведения исследований использовали надземную часть (листья и черешки) алоказии, выращенной в Барнауле, Павловске, Белокурихе. Сырье анализировали в свежем и сухом виде. Сухое сырье получали согласно правилам сбора и сушки лекарственных растений [18]. Лекарственное сырье во избежание разрушения лекарственных веществ и для удаления излишней влаги высушивали сразу после сбора наиболее распространенным методом - воздушной сушкой, основанной на свободном доступе воздуха к сырью, разложенному в затемненном месте.
Качественный химический анализ надземной части алоказии проводили на основные группы биологически активных веществ: алкалоиды, дубильные вещества, кумарины, сапонины, антрацены, флороглюцины, сердечные гликозиды.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Приготовление водных и водно-спиртовых экстрактов из измельченной надземной части алоказии для качественного определения биологически активных веществ проводили описанными ниже способами.
Алкалоиды. Навеску массой 2 г помещали в колбу на 100 мл, добавляли 50 мл 1% раствора HCl и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин.
Дубильные вещества. К навеске массой 1 г добавляли 100 мл дистиллированной воды, нагревали на водяной бане 30 мин.
Флавоноиды. К навеске массой 2 г добавляли 25 мл 96% этилового спирта, нагревали на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 30 мин.
Кумарины. К навеске массой 2 г добавляли 10 мл 96% этилового спирта, нагревали на водяной бане 2-3 мин при температуре не выше 50 °С.
Сапонины. К навеске массой 1 г добавляли 10 мл дистиллированной воды, нагревали на водяной бане в течение 10 мин.
Флороглюцины. В колбу с притертой пробкой помещали навеску массой 1г, добавляли 10 мл 96% этилового спирта. Периодически встряхивали колбу в течение суток.
Сердечные гликозиды. К навеске массой 5 г добавляли 50 мл 80% этилового спирта, выдерживали сутки в колбе с притертой пробкой. Спирт отгоняли под вакуумом, водный остаток в делительной воронке подвергали воздействию четыреххлористого углерода 6 раз по 10 мл. Далее из водного остатка проводили экстракцию смесью хлороформ : пропанол-2 (3 : 1) 4 раза по 10 мл. К экстракту добавляли 2 г безводного Na2SO4.
После охлаждения полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр. С фильтратом проводили качественные реакции.
Обнаружение вышеперечисленных биологически активных веществ в извлечениях из надземной части алоказии проводили согласно общепринятым методикам химического анализа лекарственных растений [19, 20]. С помощью качественных химических реакций установлено наличие алкалоидов, флавоноидов и кумаринов, не обнаружены дубильные вещества, сапонины, сердечные гликозиды, антраценпроизводные, флороглюцины.
Для дальнейшего изучения проводили выделение веществ основного характера (алкалоидов) согласно методике Британского фармацевтического кодекса: к 5 г сырья, с размерами частиц не более 1 мм, добавляли 200 мл смеси (23 мл эфира, 8 мл хлороформа и 2,5 мл 90% этанола). Взбалтывали, оставляли стоять 10 мин., затем добавляли 6 мл 10% раствора аммиака и взбалтывали периодически в течение 3 ч. На следующий день прибавляли 10 мл воды и взбалтывали 10-15 мин. 100 мл смеси фильтровали в делительную воронку. Фильтрат промывали 5 мл смеси растворителей (диэтиловый эфир - хлороформ - 90% этанол). Алкалоиды извлекали 0,5 н раствором H2SO4 порциями по 20, 15, 10 и 10 мл. Хлороформные извлечения фильтровали через бумажный фильтр в высушенную до постоянной массы колбу, хлороформ отгоняли. К остатку прибавляли 5 мл этилового спирта и снова отгоняли досуха, остаток сушили до постоянной массы при температуре не более 60 °С. С целью количественного определения суммы алкалоидов остаток взвешивали. В последующих исследованиях остаток растворяли в 5 мл 96% этилового спирта.
Для изучения алкалоидов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовали пластинки Sorbfil (10х 10) и системы растворителей, представленных в таблице.
Системы растворителей, изученные при идентификации алкалоидов.
№ Система Соотношения
1 1-Бутанол - уксусная кислота - вода 5 4 : 1
2 1-Бутанол - уксусная кислота - метанол 5 4 : 1
3 Ацетон - метанол - диэтиламин 35 10 : 5
4 Хлороформ - бензол - диэтиламин 100 100 : 1
5 Хлороформ - метанол - уксусная кислота 8 1 : 1
6 Хлороформ - ацетон - диэтиламин 5 4 : 1
7 Хлороформ - этанол 2 8
8 Хлороформ - диэтиламин 9 : 1
9 Бензол - метанол 9 : 1
10 Бензол - метанол - хлороформ 9 1 : 5
11 Ацетон - аммиак (25%) 10 : 1
12 Ацетон - аммиак (25%) 95 : 5
Хроматографирование проводили восходящим методом. После этого пластинки высушивали на воздухе и просматривали в ультрафиолетовом свете. Вещества на хроматограмме обнаруживали с помощью реактива Драгендорфа. Положительные результаты получены при использовании систем 1-бутанол -вода - уксусная кислота (БУВ) (5 : 4 : 1) и ацетон - 25% аммиак (10 : 1). В данных системах обнаружен один алкалоид с = 0,34 (БУВ) и = 0,43 (ацетон - 25% аммиак). С целью идентификации алкалоида использовали спектрофотометрическое определение. Для этого пятно алкалоида на хроматограмме элюировали 5 мл 96% этанола и снимали спектр на приборе СФ-26 в области 220-400 нм, применяя в качестве раствора сравнения 96% этанол. Вещество основного характера имеет один максимум при X = 250 нм (рис. 1). В аналогичных условиях при X = 250 нм определяется хинин гидрохлорид [21], а при X = 249 нм - алкалоид аймалин [22]. Можно предположить, что выделенный алкалоид является близким по строению к данным алкалоидам и имеет в структуре изохинолиновое кольцо.
Суммарное содержание веществ алкалоидного характера в пересчете на воздушно-сухое сырье, определенное по методике Британского фармацевтического кодекса, составило (%): 0,049±0,003 (Павловск), 0,053±0,003 (Барнаул), 0,043±0,002 (Белокуриха). Из приведенных данных можно заключить, что количественное различие незначимо и находится в пределах погрешности метода определения.
Выделение флавоноидов проводили, добавляя к 1 г измельченного сырья, просеянного через сито с отверстиями диаметром 1 мм, 10 мл 70% этанола. Нагревали на водяной бане в колбе с обратным холодильником 30 мин., охлаждали на воздухе, фильтровали через бумажный фильтр и упаривали до половины объема на водяной бане.
Для идентификации флавоноидов использовали хроматографию на бумаге марки 8Шгас в 15, 30 и 60% уксусной кислоте. Хроматограммы высушивали на воздухе, просматривали в УФ- и видимом свете до и после проявления соответствующими реактивами, при этом отмечали контуры пятен, их флуоресценцию и вычисляли величину Для проявления пятен использовали пары концентрированного раствора аммиака и 5% спиртовый раствор хлорида алюминия. В качестве метчиков применяли имеющиеся в наличии спиртовые растворы рутина и кверцетина. Значения К* полученные с использованием 15% уксусной кислоты в извлечении из надземной части алоказии составляют 0,26 и 0,37. Значение рутина в этих условиях составляет 0,56, а кверцетина - 0,30. Таким образом, хотя полученное значение = 0,26 находится близко к значению для кверцетина, нельзя с уверенностью утверждать, что один из флавоноидов - кверцетин.
Для получения более достоверных результатов по идентификации флавоноидов применяли метод ВЭЖХ на милихроме А-02. Использовали градиентный режим (полярность растворителя постепенно увеличивается) элюирования. Элюент А - ацетонитрил и 0,01 М КН2Р04 (5 : 95) с рН = 2,5. Элюент В - 100% ацетонитрил, концентрация которого в смеси элюентов увеличивается от 0 до 60% на 1000 мкл подвижной фазы. Дальнейшее элюирование шло с использованием 60% ацетонитрила. Длина волны детектирования - 360 нм. В качестве стандартов использовали кверцетин, ликурозид, гиперозид, ликвиритин, рутин, апигенин. Время удерживания веществ флавоноидной природы в исследуемом образце - 8,5; 8,9 и 9,8 мин. На рисунках 2, 3 приведены ВЭЖХ-хроматограммы стандартов и исследуемого образца. Таким образом, можно заключить, что в алоказии содержится гиперозид и в меньших количествах - ликурозид и кверцетин.
D D.6 - ґ~
0,5 -
М
0.3
0,2
0,1 • 1 i i i i i i
230 240 250 260 270 280 290 300 Х,т
Рис. 1. Спектр поглощения алкалоида алоказии крупнокорневой
Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограммы стандартных растворов флавоноидов: 1 - рутин; 2 - ликвиритин; 3 - гиперозид; 4 - ликурозид; 5 - кверцетин; 6 - апигенин
Время, мин
Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограмма исследуемого образца алоказии
Выводы
1. Установлено наличие биологически активных веществ в растении алоказия - алкалоидов, флавоноидов и кумаринов. Показано отсутствие дубильных веществ, сапонинов, сердечных гликозидов, антраценпроизводных, флюроглюцинов.
2. Хроматографическим методом со спектрофотометрическим окончанием показано наличие в алоказии алкалоида, близкого по строению к алкалоидам хинину и аймалину, т.е. имеющего в структуре изохинолиновое кольцо.
3. Впервые установлено наличие в алоказии флавоноидов - гиперозида, ликурозида и кверцетина.
Список литературы
1. Сааков С.Г. Оранжерейные и комнатные растения и уход за ними. Л., 1983. С. 134.
2. Тюкавина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Природные флавоноиды как пищевые антиоксиданты и биологически активные добавки // Вопросы питания. 1996. №2. С. 33-38.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Харьков, 1997. Т. 2. С. 462.
4. Sims D.A., Pearcy R.W. Photosynthetic characteristics of tropical forest understorey herb, Alocasia macrorrhiza, and a
related crop species, Colocasia esculenta grown in contrasting light environments // Oecologia 1989. V. 79. P. 53-59.
5. Chow W.S., Qian L., Goodchild D.J., Anderson J.M. Photosynthetic acclimation of Alocasia macrorrhiza (L.) G.
Don to growth irradiance: structure, function and composition of chloroplasts // Australian Journal of plant Physiology. 1988. V. 15. P. 107-122.
6. Sims D.A., Pearcy R.W. Photosynthetic and respiration in Alocasia macrorrhiza following transfers to higt and low light // Oecologia. 1991. V. 86. P. 447-453.
7. Mulkey S.S., Pearcy R.W. Interactions between acclimation and photoinhibition and photosynthesis of a tropical forest understory herb, Alocasia macrorrhiza, during simulated canopy gap formation // Funct Ecol. 1992. V. 6. P. 719-729.
8. Sims D.A., Pearcy R.W. Response of leaf anatomy and photosynthetic capacity in Alocasia macrorrhiza (Araceae) to a transfer from low to high // Am. J. Bot. 1992. V. 79. P. 449-455.
9. Sims D.A., Pearcy R.W. Scaling sun and shade photo synthetic acclimation of Alocasia macrorrhiza to whole-plant performance - I. Carbon balance and allocation at different daily photon flux densities // Plant, Cell and Environment. 1994. V. 17. P. 881-887.
10. Argall M.E., Bradbary J.H., Shaw D.C. Amino-acid sequence of a trypsin/chymotrypsin inhibitor from giant taro (Alocasia macrorrhiza) // Biochim Biophys Acta. 1994. V. 1204. P. 189-194.
11. Wu Y., Llewellyn D., Mathews A., Dennis E.S. Adaptation of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) to a proteinase inhibitor expressed in transgenic tobacco // Molecular Breeding. 1997. V. 3. P. 371-380.
12. Lebot V. Biomolecular evidence for plant domestication in Sahul // Genetic Resources and Crop Evolution. 1999. V. 46. №6. P. 619-628.
13. Rakba N., Melhaoui A., Rissel M., Morel I., Loyer P., Lescoat G. Irniine, a pyrrolidine alkaloid, isolated from Arisarum vulgare can induce apoptosis and/or necrosis in rat hepatocyte cultures // Toxicon, 2000. V. 38. №10. P. 1389-1402.
14. Allen M.T., Pearcy R.W. Stomatal behavior and photo synthetic performance under dynamic light regimes in a seasonally dry tropical rain forest // Oecologia. 2000. V. 122. V. 4. P. 470-475.
15. Гортинский Г.Б., Яковлев Г.П. Целебные растения в комнате. М., 1993. С. 158-160.
16. Корепанов С. В. Растения в профилактике и лечении рака. Новосибирск, 1998. С. 47-48.
17. Jones D.A. Why are so many food plants cyanogenic? // Phytochemistry. 1998. V. 47. P. 155-162.
18. Правила сбора и сушки лекарственных растений. М., 1985. 321 с.
19. Кузнецова М. А. Лекарственное растительное сырье и препараты. М., 1987. 190 с.
20. Гринкевич Н.И., Софронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.
21. Гетероциклические соединения природного и синтетического происхождения: Метод. указания к практическим занятиям студентов по фармацевтической химии для студентов 4 курса. Барнаул, 1994. Ч. 2. C. 6.
22. Николаева Л.А., Астахова Т.В., Шимолина Л.Л. Спектрофотометрический метод количественного определения аймалина // Исследования по изысканию лекарственных средств природного происхождения. Л., 1981. C. 267.
Поступило в редакцию 5 февраля 2003 г.
После переработки 14 февраля 2004 г.
