CC BY
155
УДК 616.127.-005.4-06:16.12-08.313.3 Т.В. Ласукова, Л.Н. Маслов
E-mail: maslov@cardio.tsu.ru
ОПИОИДНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И УСТОЙЧИВОСТЬ СЕРДЦА К ПАТОГЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН
ВВЕДЕНИЕ
Электрофизиологические процессы, лежащие в основе развития нарушений сердечного ритма, изучены достаточно хорошо. Однако значение многих биологически активных веществ, циркулирующих в крови или синтезирующихся in situ в миокарде, в регуляции электрической стабильности сердца и формировании его устойчивости к патогенному влиянию ишемии и реперфузии, изучено достаточно слабо. К подобным соединениям относятся лиганды опиоидных рецепторов (ОР). В данной статье представлены результаты многолетних исследований роли различных субтипов опиоидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к действию ряда аритмогенных факторов. Одна из ключевых задач настоящей публикации заключалась в определении вклада отдельных субпопуляций ОР в регуляцию насосной функции миокарда и формирование устойчивости кардиомиоцитов к действию ишемии и реперфузии. Приведены результаты исследования внутриклеточных механизмов реализации миокардиальных эффектов опиоидов.
Влияние активации центральных и периферических опиоидных рецепторов на устойчивость сердца к аритмогенному действию катехоламинов, аконитина и Са^2
Внутривенное введение селективных пептидных агонистов ц-ОР DALDA и PL017 повышало толерантность сердца к аритмогенному действию адреналина. Антиаритмический эффект DALDA носил дозозависимый характер и не проявлялся в условиях селективной блокады ц-ОР. Следовательно, активация ц-ОР обеспечивает повышение устойчивости сердца к аритмогенному действию адреналина. Пептид DALDA относится к тем опиоидным пептидам, которые практически неспособны проникать через гематоэнцефали-ческий барьер. Следовательно, антиаритмическое влияние DALDA связано с оккупацией периферических ц-рецепторов. Вместе с тем центральные ц-ОР также играют важную роль в аритмогенезе, поскольку инт-рацеребровентрикулярное введение селективного ц-агониста DAMGO также увеличивает резистентность сердца к аритмическому влиянию адреналина. Таким образом, активация центральных и периферических ц-ОР сопровождается повышением электрической
стабильности сердца. При внутривенном введении пептидных агонистов §2-ОР DSLET и DTLET оказалось, что эти пептиды не влияют на устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина. В то же время, непептидный агонист 5-ОР BW373U86 снижал частоту возникновения адреналин-индуцированной желудочковой тахикардии. Известно, что BW373U86 проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который является серьезным препятствием для DS-LET и DTLET. Этот факт позволил предположить, что антиаритмический эффект BW373U86 связан с активацией центральных 5-ОР. Действительно, при интрацеребровентрикулярной инфузии селективных пептидных агонистов 5t- и 52-ОР (DPDPE, DSLET, DTLET) снижалась частота появления желудочковых аритмий в ответ на инъекцию адреналина. Антиа-ритмический эффект 5-агонистов не проявлялся в условиях блокады ОР налоксоном или селективным антагонистом 5-ОР ICI 174,864. Следовательно, активация периферических 5-ОР не влияет на устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина, а стимуляция центральных 51- и 52-ОР существенно её повышает.
Противоположные изменения отмечались при интрацеребровентрикулярном введении крысам агонистов к1-рецепторов (U-50,488, [D-Ala^-динорфин А1-13) и к2-рецепторов (бремазоцин), которые усиливали аритмогенный эффект адреналина. Селективная блокада к1-ОР полностью устраняла проаритмоген-ное действие к-агонистов. Внутривенное введение селективных агонистов к1-рецепторов, напротив, способствовало снижению частоты возникновения адреналин-индуцированных аритмий.
Из вышеизложенных фактов следует, что активация периферических ц- и к1-опиоидных рецепторов повышает устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина. В то же время стимуляция 5-ОР, расположенных на периферии, не сказывается на этом показателе. Активация центральных ц- и 5-опио-идных рецепторов усиливает толерантность сердца к действию адреналина, а стимуляция расположенных в головном мозге к-ОР усиливает аритмогенный эффект адреналина.
Активация ОР существенно сказывается на чувствительности миокарда к аритмогенному действию не только катехоламинов, но и к воздействию CaCl2 и аконитина. Было показано, что селективные пептидные агонисты ц-ОР (DALDA, PL017) повышают толерантность сердца к аритмогенному действию CaCl2. При этом антиаритмический эффект всех использованных нами агонистов ОР на модели СаС12-индуцированных нарушений сердечного ритма был намного слабее, чем на модели адреналин-индуцированных аритмий. Это различие может быть связано с антиадренергической активностью опиоидов, которая проявляется в конкуренции катехоламинов и опиоидов за аденилатциклазу в кардиомиоцитах. Первые её активируют, а вторые - ингибируют. Стимуляция периферических опиоид-
ных рецепторов (ц и к) повышала толерантность сердца к аритмогенному действию аконитина. Наибольшей антиаритмической активностью на этой модели обладал агонист ц-ОР DALDA в дозе 0,1 мг/кг.
Таким образом, активация периферических ОР повышает устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина, СаС12 и аконитина.
Стимуляция опиоидных рецепторов повышает устойчивость сердца к аритмогенному действию кратковременной коронароокклюзии и реперфузии
Исследования с использованием смешанного агониста ц- и 5-опиоидных рецепторов А1а2^еи5,А^6-эн-кефалина (даларгин) показали, что этот пептид (0,1 мг/ кг) способен предотвратить появление желудочковой фибрилляции при коронароокклюзии и реперфузии. Известно, что даларгин является агонистом ц- и 5-ОР, поэтому было не вполне ясно, с активацией каких субтипов рецепторов связан антиаритмический эффект этого пептида. Ответить на этот вопрос мы попытались, используя селективные агонисты опиоидных рецепторов. В качестве ц-агониста был использован DALDA, который в дозе 0,1 мг/кг повышал толерантность сердца к аритмогенному действию адреналина и аконитина. Однако DALDA не оказал статистически значимого эффекта на частоту и характер нарушений сердечного ритма, возникающих при 10-минутной коронароокклюзии и реперфузии у крыс. Селективные агонисты 51-ОР TAN-67 и DPDPE в дозе 146 нмоль/кг также не повлияли на устойчивость сердца к аритмо-генному действию коронароокклюзии и реперфузии. В то же время селективные агонисты §2-ОР дельторфин II и дельторфин D снижали частоту возникновения желудочковых аритмий при коронароокклюзии и реперфузии, а селективная блокада §2-рецепторов привела к исчезновению антиаритмического эффекта дельторфина II. Следовательно, активация 52-ОР повышает толерантность сердца к аритмогенному действию кратковременной ишемии и реперфузии.
Введение крысам селективного агониста к1-ОР (-)-и-50,488 в дозе 2200 нмоль/кг эффективно предупреждает появление аритмий, вызванных 10-минутной коронароокклюзией и последующей реперфузией. При этом энантиомер (+)-и-50,488, отличающийся от (-)-и-50,488 низким сродством к к-ОР, не влиял на частоту и характер ишемических и реперфузионных аритмий. Селективная блокада к^ОР устраняла анти-аритмический эффект (-)-и-50,488, в то время как в условиях ингибирования к2-рецепторов антиаритми-ческое действие (-)-и-50,488 сохранялось. Активация к2-ОР с помощью внутривенной инъекции селективного к2-агониста GR-89696 не повлияла на частоту и характер ишемических и реперфузионных аритмий. Следовательно, активация к1-опиоидных рецепторов повышает толерантность сердца к аритмогенному действию кратковременной ишемии и реперфузии. Труднее судить о локализации этих рецепторов в организме, поскольку (-)-и-50,488 легко проникает через ГЭБ и может активировать как центральные, так
и периферические Kj-ОР. Как уже отмечалось, интра-церебровентрикулярная инфузия (-)-U-50,488 вызывает снижение толерантности сердца к аритмогенному действию адреналина, а внутривенное введение (-)-U-50,488, напротив, повышает резистентность сердца к действию катехоламина. Можно предполагать, что активация именно периферических Kj-ОР повышает электрическую стабильность сердца.
Таким образом, активация периферических 52-, и Kj-рецепторов способствует повышению устойчивости сердца к аритмогенному действию кратковременной 10-минутной ишемии и реперфузии, в то время как ц-, 5j-, и к2-рецепторы, по всей видимости, играют существенно меньшую роль в регуляции электрической стабильности сердца в условиях кратковременной ишемии. Однако патологические изменения, происходящие в миокарде при 10-минутной ишемии, носят обратимый характер, тогда как при более длительной ишемии эти изменения во многих кардиомиоцитах становятся необратимыми и, соответственно, патогенез нарушений сердечного ритма, возникающих при кратковременной коронароокклюзии, существенно отличается от механизма возникновения аритмий при длительной ишемии. Следовательно, вопрос о роли опиоидных рецепторов в аритмогенезе при длительной ишемии требовал отдельного тщательного изучения. Кроме того, оставалась неизвестной локализация ОР, обеспечивающих повышение устойчивости сердца к аритмогенному действию ишемии-реперфузии. Ответить на этот вопрос помогли эксперименты in vitro, проведенные на модели тотальной 45-минутной нормотермической ишемии изолированного сердца. Активацию кардиальных ОР проводили путем добавления агонистов ОР в перфузионный раствор.
Роль миокардиальных опиоидных рецепторов в реализации антиаритмического эффекта опиоидов
После тотальной ишемии изолированного сердца с последующим возобновлением коронарной циркуляции мы наблюдали появление желудочковых аритмий, которые регистрировались в первые 10 минут реперфузии в 75% случаев. Применение селективного агониста 5-ОР DPDPE оказывало выраженный ан-тиаритмический эффект, который не проявлялся в условиях блокады 5-ОР налтриндолом. Активация кардиальных 5-ОР изолированного сердца не привела к изменению устойчивости изолированного сердца к аритмогенному действию ишемии-реперфузии. По-видимому, популяция 5-ОР миокарда не участвует в формировании резистентности миокарда к реперфу-зионным аритмиям.
Следовательно, 5-рецепторы миокарда активно участвуют в регуляции процессов, формирующих устойчивость сердца к аритмогенному действию ишемии-реперфузии. На это указывает отсутствие эпизодов желудочковой фибрилляции и статистически значимое снижение частоты развития желудочковой тахикардии в реперфузионном периоде при использовании селективного 5-агониста
DPDPE. Поскольку противоаритмический эффект
5-агониста DPDPE наблюдался в опытах на изолированном сердце, мы полагаем, что повышение устойчивости миокарда к аритмогенному действию длительной ишемии и реперфузии связано с активацией 5-ОР миокарда. В то же время кардиальные к-ОР не играют существенной роли в формировании устойчивости миокарда к аритмогенному влиянию названных патологических факторов.
Роль опиоидных рецепторов в регуляции инотроп-ной и хронотропной функции сердца
В данном разделе исследовалось значение ц-, 5- и -ОР в регуляции сократимости миокарда в условиях нормального обеспечения сердечной мышцы кислородом и в период постишемической реперфузии. Опыты проводили на изолированных, перфузируемых по методу Лангендорфа сердцах крыс. Стимуляцию ОР осуществляли путем внутривенного введения агонистов ц-, 5- и к-рецепторов или добавления их в перфу-зионный раствор. Регистрировали частоту (ЧСС) и силу сердечных сокращений, конечное диастолическое давление. После периода адаптации моделировали 45-минутной тотальную ишемию и 30- минутной реперфузию. Активация ц-опиоидных рецепторов in vivo с помощью DAMGO приводила к статистически значимому увеличению силы сокращений как до моделирования ишемии, так и после возобновления коронарной перфузии. Перфузия агонистами ц-ОР DAMGO и DALDA оказала двухфазный эффект: сначала происходило кратковременное увеличение частоты и силы сокращений, затем - снижение этих показателей. Активация 5- и к-ОР in vivo не повлияла на параметры сократимости. В случае перфузии сердца агонистами 5- и к-ОР наблюдалось снижение исходной частоты и амплитуды сокращений. Предварительная активация 5-ОР не влияла на сократимость миокарда при реперфузии, на фоне стимуляции к-ОР обнаружено снижение ЧСС и силы сокращений сердца на протяжении всей 30-минутной реоксигенации. Следовательно, активация различных субтипов опиоид-ных рецепторов по-разному влияет на сократительную активность миокарда.
Влияние агонистов опиоидных рецепторов на степень развития некротических повреждений кар-диомиоцитов при ишемии и реперфузии
Одной из ключевых задач проведенной работы было исследование роли опиоидных рецепторов в формировании устойчивости мембран кардиомиоцитов к повреждающему действию ишемии и реперфузии. Оценку кардиопротекторного эффекта опиоидов проводили на модели коронароокклюзии и реперфузии (in vivo) и на модели тотальной нормотермической ишемии (in vitro). Было установлено, что в условиях локальной ишемии in vivo стимуляция 52-рецепторов с помощью дельторфина II сопровождается повышением устойчивости миокарда к цитотоксическому действию указанных патологических состояний. В то же время на модели глобальной ишемии изолирован-
ного сердца профилактическое применение агонистов б^рецепторов ЭРЭРБ и ТАЫ-67 сопровождалось развитием кардиопротекторного эффекта. В результате стимуляции кардиальных б^рецепторов происходило снижение уровня креатинфосфокиназы в перфузате, оттекающем от сердца во время постишемической реперфузии. Этот факт свидетельствует об уменьшении количества кардиомиоцитов, в которых в ответ на ишемию-реперфузию происходит некроз. Следовательно, в формировании повышенной устойчивости карди-омиоцитов к действию ишемии и реперфузии значение обеих субпопуляций б-ОР весьма существенно.
В результате активации ц-опиоидных рецепторов путем предварительного внутривенного введения селективного агониста ЭАМОО наблюдалось значительное снижение степени повреждения миокарда в условиях тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Об этом свидетельствовало снижение активности креатинфосфокиназы в перфузионном растворе, оттекающем от сердца во время реперфузии. Активация ц-рецепторов с помощью добавления ОАЬЭА в концентрации 33 нМ сопровождалась выраженным кардиопротекторным эффектом, а увеличение дозировки ОАЬЭА в 5 раз существенно не отразилось на сохранении целостности мембран кардиомиоцитов.
Исследование кардиопротекторных эффектов к-агонистов на модели тотальной ишемии и последующей реоксигенации изолированного сердца показало, что активация кардиальных к-ОР способствует снижению степени ишемического и реперфузионного повреждения кардиомиоцитов. Следовательно, защитное влияние этих соединений реализуется непосредственно на рецепторы данного типа, расположенные в миокарде.
Суммируя приведенные результаты, можно заключить, что активация опиоидных рецепторов повышает устойчивость сердечной мышцы к повреждениям, вызванным действием острой ишемии/реперфузии. Однако острая ишемия миокарда не является единственной причиной возникновения жизнеугрожающих нарушений ритма. Летальные желудочковые аритмии возникают и в отдаленные сроки после инфаркта миокарда. В этой связи особый интерес вызвало изучение влияния лигандов ОР на аритмогенез при наличии в ней рубцовых изменений.
Повышение электрической стабильности сердца после стимуляции периферических опиоидных рецепторов
Внутривенное введение подопытным животным с постинфарктным кардиосклерозом селективного пептидного агониста ц-рецепторов ОАЬЭА (0,1 мг/ кг) способствовало повышению порога желудочковой фибрилляции (ПФЖ). В условиях избирательной блокады ц-рецепторов антифибрилляторный эффект ОАЬЭА не проявлялся. Внутривенное введение селективных агонистов б1-опиоидных рецепторов ТАК-67 (0,5 мг/кг) и/или ЭРЭРБ (0,1 мг/кг) так-
же обеспечивало увеличение порога желудочковой фибрилляции у крыс с постинфарктным кардиосклерозом, а инъекция агониста б2-рецепторов ЭБЬБТ усугубляла падение ПФЖ. Антифибрилляторное действие ЭРЭРБ не проявлялось в условиях блокады периферических опиоидных рецепторов метилна-локсоном, непроникающим через ГЭБ. Селективная блокада б-ОР полностью устраняла антифибрилля-торный эффект ЭРЭРБ, а после избирательной блокады ц-ОР этот эффект сохранялся. Сопоставление этих фактов позволило утверждать, что активация периферических б1-опиоидных рецепторов увеличивает электрическую стабильность сердца у крыс с постинфарктным кардиофиброзом.
Следовательно, активация периферических ц- и б1-ОР обеспечивает повышение электрической стабильности сердца в условиях постинфарктного кардиосклероза.
Механизмы опиоидергического повышения устойчивости сердца к действию патогенных факторов
Исследовано значение КАТф-каналов в реализации антиаритмического действия ц-агониста ОАЬЭА и
б1-агониста ЭРЭРБ в условиях острой ишемии/реперфузии и постинфарктного кардиосклероза. Установлено, что предварительная блокада сарколеммаль-ных и митохондриальных КАТф-каналов с помощью глибенкламида полностью предупреждает развитие защитного действия обоих лигандов как в острых, так и в хронических экспериментах. Это свидетельствует о том, что активация КАТф-каналов опосредует опио-ид-индуцированное увеличение толерантности миокарда к аритмогенным воздействиям. В последующих опытах исследовалось значение каждого из указанных пулов этих ионтранспортирующих структур в реализации защитного эффекта опиоидов. С этой целью были проведены серии опытов с введением ОАЬЭА и ЭРЭРБ на фоне блокады сарколеммальных КАТф-каналов с помощью НМК 1098. Обнаружено, что "выключение" сарколеммальных КАТф-каналов не влияет на степень выраженности антиаритмического эффекта опиоидов как в условиях острой ишемии/ реперфузии, так и при постинфарктном кардиосклерозе. Данный факт исключает возможность участия этого типа КАТф-каналов в опиоид-индуцированном повышении электрической стабильности рубцового миокарда и предполагает детерминирующую роль митохондриальных КАТф-каналов в названном положительном эффекте опиоидов. У крыс с постинфарк-тным кардиосклерозом блокада митохондриальных КАТф-каналов полностью предупреждала антифиб-рилляторный эффект ОАЬЭА и ЭРЭРБ.
Эксперименты по изучению роли КАТф-каналов в антиаритмическом действии ц- и б1-агонистов в условиях острой ишемии/реперфузии и постинфарктного кардиосклероза позволили нам сделать вывод о том, что в опиоидергическом повышении электрической стабильности сердца ключевую роль играют митохондриальные КАТф-каналы.
Изучение роли КАТф-каналов в реализации защитного действия агонистов Ц-ОР, полученных на модели тотальной ишемии изолированного сердца показало, что кардиопротекторный, антиаритмичес-кий и положительный инотропный эффекты DAMGO полностью устранялись после блокады указанных каналов глибенкламидом. Следовательно, названные эффекты связаны с ц-ОР-зависимой активацией КАТр-каналов.
Исследование механизма антиаритмического действия агониста §2-ОР дельторфина II, обнаруженного на модели коронароокклюзии и реперфузии, позволило установить, что отмеченный эффект реализуется с участием вегетативной нервной системы. Это подтверждалось тем, что предварительная блокада вегетативных ганглиев устраняла антиаритмический эффект стимуляции 52-ОР. Другим возможным путем реализации защитных эффектов б2-агониста является посредничество NO-синтазы. Это доказано в экспериментах с предварительным введением блокатора NO-синтазы L-NAME. Было установлено, что после применения L-NAME антиаритмическое и кардиопро-текторное действие 2-агониста полностью устранялось. Следовательно, защитное действие дельторфина II было опосредовано эндогенным NO.
Изучение механизмов защитных эффектов б^аго-нистов показало, что в реализации кардиопротекторного и антиаритмического действия DPDPE основную роль играет участие последних в регуляции уровня внутриклеточного кальция. В случае блокады Са2+-АТФ-азы саркоплазматического ретикулума с помощью цикло-пиазоновой кислоты антиаритмический, цитопротек-торный и инотропный эффекты агониста б^рецепторов DPDPE не проявлялись. В то же время кардиопротек-торный эффект к-агониста был связан со снижением уровня цАМФ в кардиомиоцитах. Доказательством послужили данные о том, что после активации к-ОР содержание цАМФ в сердце оказалось статистически значимо ниже, чем в контроле, и была выявлена положительная корреляция между содержанием цАМФ в миокарде и активностью КФК в перфузате.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог вышеизложенному, можно заключить, что ц-, 5- и к-опиоидные рецепторы играют важную роль в формировании повышенной устойчивости миокарда к действию патогенных факторов, к числу которых относятся ишемические и реперфузионные воздействия. В условиях кратковременной коронаро-окклюзии и реперфузии антиаритмические свойства проявляют агонисты б2- и ^-рецепторов. В то же время в условиях длительной ишемии существенную роль в повышении электрической стабильности сердца играют ц- и 5t-рецепторы. Показано, что в реализации антиаритмических, кардиопротекторных и инотроп-ных эффектов опиоидов задействованы КАТФ-каналы, цАМФ, ионы кальция, NO-синтаза.
Степень внедрения полученных результатов. По
результатам работы подано 4 заявки на изобретения. Получены патенты: № 2171115 от 27 июля 2001 г.; № 2195275 от 27 декабря 2002 г.; №200026 от 10 марта 2003 г.; № 222520 от 10 марта 2004 г.
Данные опубликованы в центральных отечественных и зарубежных журналах, вышло в свет 2 монографии. Общее количество статей в российских журналах составляет 130, в зарубежных 5. Материалы проведенной научно-исследовательской работы обсуждались на 30 Всероссийских и 14 международных конференциях и симпозиумах.
Участие в выполнении грантовых проектов. Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 93-04-20357-а; 98-04-48010-а; 02-04-48020-а; 06-04-96936).
Международное сотрудничество. Исследования проходят в тесном сотрудничестве с зарубежными учеными. Выполняется научный проект с Институтом физиологии Академии наук Чешской республики, посвященный изучению роли опиоидных рецепторов и внутриклеточных сигнальных систем в механизмах адаптационного повышения устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии. Выполняется договор с National Institute on Drug Abuse (Bethesda, Maryland, USA) на тему «Изучение роли опиоидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии». Благодаря такому сотрудничеству лаборатория экспериментальной кардиологии ежегодно бесплатно получает дорогостоящие реактивы и препараты высокоселективных лигандов опиоидных рецепторов, что позволяет проводить исследования на международном уровне.
OPIOID RECEPTORS AND RESISTANCE OF THE HEART TO PATHOGENETIC INFLUENCES
T.V. Lassoukova, L.N. Maslov
SUMMARY
The role of |j,-, 5- h K-opioid receptors in the forming myocardial resistance to pathogenetic factors influences was studied. Antiarrhythmic action of |j,-, 5- and k- ligands of opioid receptors was studied using models of adrenal, aconite and reperfusion arrhythmias. Peripheral |j,- h Kt- opioid peptides was established to increase cardiac resistance to arrthythmogenic action of adrenaline. In conditions of short-term (10 min) coronary occlusion and reperfusion, 52- and k1- receptors agonists exerted antiarrhythmic action.
