CC BY
17
https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430 | )cc)
|ОЛИГОКЛОНАЛЬНОСТЬ И СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ Т-КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ
Абрамова А. В.*, Гальцева И. В., Михайлова Е. А., Капранов Н. М., Давыдова Ю. О., Фидарова З. Т., Троицкая В. В., Паровичникова Е. Н., Савченко В. Г.
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 125167 Москва, Россия
РЕЗЮМЕ
Ведение. Основным патогенетическим механизмом развития апластической анемии (АА) считается нарушение иммунной регуляции кроветворения.
Цель: изучить субпопуляционный состав Т-клеток и репертуар Т-клеточного рецептора у больных АА. Методы. С 2018 по 2020 г. в исследование были включены больные АА (п = 40) до начала иммуносупрессивной терапии. Исследование субпопуляционного состава Т-клеток и олигоклональности Т-клеточного рецептора по семействам Ув (ТКР-Ув) образцов костного мозга проводили с помощью метода проточной цитометрии. Результаты. Выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА в образцах костного мозга: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, CD4+ клеток памяти, что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. Уменьшение наивных CD4+ и CD8+ клеток, регуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток может указывать на снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками. Установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и PD-1-позитивных Т-клеток. Самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных сверхтяжелой АА. При анализе репертуара ТКР-Ув была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток.
Заключение. Обогащение определенных семейств Ув свидетельствует о наличии аутореактивного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный механизм развития АА. Динамическое исследование ТКР-Ув-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявить значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА.
Ключевые слова: апластическая анемия, субпопуляции лимфоцитов, Т-клетка, Т-клеточный рецептор, олигоклональность, проточная цитометрия Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: финансовая поддержка при подготовке статьи оказана фармацевтической компанией Novаrtis.
Для цитирования: Абрамова А.В., Гальцева И.В., Михайлова Е.А., Капранов Н.М., Давыдова Ю.О., Фидарова З.Т., Троицкая В.В., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Олигоклональность и субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга у больных апластической анемией. Гематология и трансфузиология. 2020; 65(4): 417-430. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430
IOLIGOCLONALITY AND SUBPOPULATION STRUCTURE OF BONE MARROW T-CELLS IN PATIENTS WITH APLASTIC ANAEMIA
Abramova A. V. *, Galtseva I. V. , Mikhailova E. A., Kapranov N. M., Davydova Yu. O., Fidarova Z. T. , Troitskaya V. V., Parovichnikova E. N., Savchenko V. G.
National Research Center for Hematology, 125167, Moscow, Russian Federation
ABSTRACT
Introduction. The main pathogenetic mechanism of the development of aplastic anemia (AA) is a violation of the immune regulation of hematopoiesis.
Aim: to study of the subpopulation composition of T-cells and the repertoire of the T-cell receptor in AA patients. Patients and Methods. The study included AA patients (n = 40) without prior immunosuppressive therapy in 2018-2020. The T-cell subpopulation structure and T-cell receptor VP-family (TCR-VP) oligoclonality were studied in samples of bone marrow using flow cytometry.
Results. We report characteristic properties of T-cell subpopulations of bone marrow in all AA patients: elevated counts of cytotoxic T-cells, effector CD4+ and CD8+ cells, CD4+ memory cells, which may suggest a long-term antigenic stimulation with subsequent activation of these cell subpopulations resulting in hyperexpression of pro-inflammatory cytokines. Diminishing of naive CD4+ and CD8+ cells, regulatory and double negative T-cells may indicate a relaxing control of cytokine-producing T-cells. A relationship has been established between the AA severity and counts of effector, regulatory, double negative and PD-1 positive T-cells. A highest count of potentially cytokine-producing T-cells and lowest count of cells involved in T-cell activity regulation were observed in very severe AA patients. Studies of the TCR-VP repertoire revealed oligoclonal expansion in the cytotoxic T-cell subpopulation.
Conclusion. Enrichment in selected VP families suggests autoreactive T-cell clonality and attests to the immune nature of AA. A dynamic TCR-VP repertoire assay may be recommended in the disease monitoring. Flow cytometry helps identify valuable biomarkers for T-cell clone monitoring in AA and a better assessment of the disease progression.
Keywords: aplastic anaemia, lymphocyte subpopulations, T-cell, T-cell receptor, oligoclonality, flow cytometry Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest. Financial disclosure: the work was supported by the Novartis company.
For citation: Abramova A.V., Galtseva I.V., Mikhailova E.A., Kapranov N.M., Davydova Yu.O., Fidarova Z.T., Troitskaya V.V., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Oligoclonality and subpopulation structure of bone marrow T-cells in patients with aplastic anaemia. Russian Journal of Hematology and Transfusiology (Gematologiya i transfuziologiya). 2020; 65(4): 417-430 (in Russian). https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430
Введение
Апластическая анемия (АА) — это редко встречающееся заболевание системы крови, характеризующееся тяжелой костномозговой недостаточностью с истощением пула гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Исследования, посвященные изучению АА, свидетельствуют об аутоиммунном механизме развития заболевания [1—3]. Главную роль в развитии аутоиммунных реакций при АА играют активированные цитотоксические T-клетки, распознающие аутоанти-гены, представленные на гемопоэтических стволовых клетках с помощью молекул HLA (Human Leukocyte Antigens) класса I [4, 5]. Результаты исследований указывают на наличие антигенного стимула, который приводит к патологической активации и дисрегуляции CD4+ Т-клеток в костном мозге (КМ) и повышенной секреции провоспалительных цитокинов, основными из которых являются интерферон-Y (ИФН-Y) и фактор некроза опухоли-а [3, 6, 7]. Пусковой фактор активации иммунной системы неизвестен. Поэтому более детальное понимание иммунных механизмов развития болезни необходимо при разработке долгосрочного эффективного лечения.
ИФН-Y регулирует взаимодействие клеток, участвующих в иммунном ответе. Являясь продуктом Т-хелперов 1-го типа, он вместе с другими провоспали-тельными цитокинами активирует цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) и усиливает фагоцитарные и ци-тотоксические реакции в очаге воспаления, которым в данном случае является КМ [8]. В КМ больных AA выявляется выраженная качественная и количественная недостаточность регуляторных T-клеток (T-рег), которые в нормальных условиях подавляют аутореак-тивность других популяций T-клеток, в частности в отношении к ГСК [9, 10]. Особую роль в иммунном ответе при АА играют T-хелперы, которые при активации начинают секретировать интерлейкин-2, что обеспечивает пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов, которые, в свою очередь, являются источником продукции провоспалительных цитокинов [11].
Иммунный ответ и регуляцию активности Т-клеточного звена контролируют костимуляторные молекулы, которые в условиях активации Т-клеток способствуют ингибированию пролиферации, эф-фекторной функции (секреция цитокинов) и индукции апоптоза Т-клеток [12]. В нормальных условиях этот механизм ингибирования предотвращает чрезмерную активацию популяций Т-клеток, например нежелательные аутоиммунные реакции, поддерживая периферическую иммунную толерантность. Одной из таких костимуляторных молекул является PD-1 (Programmed cell death-1) — костимуляторный рецептор семейства CD28, который, взаимодействуя со своим лигандом PD-L1/PD-L2, ингибирует сигнальный путь, вовлеченный в активацию Т-клеток
и тем самым способствует подавлению активности Т-клеток и индукции апоптоза [13]. Блокировка либо PD-1, либо его лигандов способствует развитию системных и органоспецифических аутоиммунных заболеваний, что подтверждено в экспериментах на животных [14]. Результаты немногочисленных исследований показали повышенную экспрессию PD-1-рецептора на поверхности Т-клеток больных АА, что, вероятно, связано с аберрантной регуляцией активации Т-клеток при данном заболевании [15, 16]. Однако связь между высокой экспрессией PD-1 и AA не изучена.
Имеются данные о том, что у больных АА в КМ происходит пролиферация аутореактивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов. Этот процесс называют также олигоклональным обогащением (расширением) или экспансией Т-клеток [5, 10].
Аутоантиген потенциально может быть распознан Т-клеткой с определенным вариантом Т-клеточного рецептора (ТКР). Взаимодействие ТКР с антигеном ведет к активации Т-лимфоцита и является ключевым событием в запуске иммунного ответа [17]. ТКР состоит из двух субъединиц — а и в либо Y и б. В каждой субъединице расположены два домена — константный (С), который закрепляет рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита, и вариабельный (V), который непосредственно отвечает за распознавание антигена. Узнавание Т-клеточным рецептором обширного спектра разнообразных антигенов достигается путем перегруппировки и рекомбинации V(D)J (V — variable, D — diversity и J — joining) участков генов вариабельных частей а- и в-цепей ТКР. Наибольшая изменчивость ТКР сосредоточена в участке CDR3 (complementarity determining region, CDR), который и определяет связывание рецептора с антигеном [18]. Именно этот участок представляет основной интерес при исследовании репертуара ТКР. Анализ перестройки ТКР обычно используется в диагностике лимфоид-ных злокачественных новообразований и может быть важным инструментом в изучении Т-клеточных реакций на патогены, и в том числе при аутоиммунных заболеваниях [19, 20].
При АА происходит нарушение иммунной регуляции и срыв толерантности к собственным антигенам, что приводит к пролиферации аутореактивных клонов Т-клеток [21—23]. Учитывая разнообразие спектра распознавания ТКР, идентификация иммунодоми-нантных клонов остается сложной задачей. Изучение Т-клеток и их клонального состава представляется актуальным в исследовании иммуноопосредованных гематологических заболеваний, так как может помочь в отслеживании активности заболевания, прогнозировании ответа на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) и рецидива.
Известно несколько методических подходов к изучению клонального состава Т-клеток: определение кло-нальности по реаранжировкам генов ТКР с помощью фрагментного анализа, секвенирование нового поколения или количественное определение Т-клеток с конкретным типом вариабельного домена в-цепи ТКР (репертуар ТКР-Ув) методом проточной цитофлуори-метрии. Существует 65 Ув-сегментов в в-локусе ТКР, которые можно сгруппировать в 25 семейств (22 функциональных семейства), причем каждый член данного семейства имеет более 75 % гомологии на уровне нуклеотидов по меньшей мере с одним из других членов того же семейства [24]. Созданы моноклональные антитела, специфично связывающиеся с ТКР, принадлежащим к определенному Ув-семейству. Частота встречаемости различных ТКР-У в-семейств отличается между собой, изучена и известна у здоровых людей в периферической крови. Увеличение доли какого-либо из Ув-семейств выше верхней границы нормы может свидетельствовать о наличии Т-клеточного клона в пределах данного семейства [25]. Многоцветная проточная цитометрия позволяет также изучать функциональные подгруппы Т-клеток и маркеры активации [26]. Данные подходы дают детальное представление о характере Т-клеточного ответа и могут быть использованы для изучения иммунного механизма развития АА.
Целью исследования было изучение субпопуляци-онного состава Т-клеток и репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА.
Материалы и методы
В исследование были включены больные АА (п = 40), обследовавшиеся в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России до начала ИСТ с 2018 по 2020 г. и подписавшие информированное согласие на включение в исследование. Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 1,2, медиана возраста — 25 (17—60) лет. Диагноз АА устанавливался на основании следующих критериев: трехростковая цитопения, малоклеточный КМ, отсутствие мегакариоцитов по данным миело-граммы, аплазия при гистологическом исследовании КМ, отсутствие цитогенетических аномалий. Больные были разделены на три группы в зависимости от степени тяжести: нетяжелая АА (НАА) (п = 23), тяжелая АА (ТАА) (п = 11) и сверхтяжелая АА (СТАА) (п = 6). Основным критерием тяжести АА являлось количество гранулоцитов в периферической крови в дебюте заболевания (нейтрофилы более 0,5 х 109/л — для НАА, 0,2-0,5 х 109/л — для ТАА и менее 0,2 х 109/л — для СТАА). Материал для исследования — первая порция аспирата КМ, полученная во время диагностических стернальных пункций. В качестве контрольной группы для определения субпопуляций Т-клеток и экспансии клонов Ув Т-клеток использовали КМ 23 здоровых доноров КМ, подписавших информирован-
ное согласие на включение в исследование. Медиана возраста доноров составила 31 (19—52) год.
Определение субпопуляционного состава T-лимфоцитов проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Для этого была разработана панель моноклональных антител к антигенам диф-ференцировки человека, меченых различными флу-орохромными красителями, представленная в таблице 1. Использование данной панели моноклональных антител позволяет определить относительное количество Т-клеточных субпопуляций, представленных в таблице 2.
Для анализа ТКР-Vß-репертуара Т-лимфоцитов КМ больных (n = 39) (данные одного пациента были удалены из исследования вследствие ошибки подготовки пробы) был использован коммерческий набор IOTest Beta Mark ТКР-Vß Repertoire (Beckman Coulter, Майами, Флорида, США), позволяющий оценить следующие семейства ТКР-Vß: Vß 1, Vß 2, Vß 3, Vß 4, Vß 5.1, Vß 5.2, Vß 5.3 , Vß 7.1, Vß 7.2, Vß 8, Vß 9, Vß 11, Vß 12, Vß 13.1, Vß 13.2, Vß 13.6, Vß 14, Vß 16, Vß 17, Vß 18, Vß 20, Vß 21.3, Vß 22 и Vß 23. Данный набор включает 8 смесей моноклональных антител — каждая содержит антитела против 3 различных областей ТКРУ^-семейств, охватывающих 24 антигена ТКР-V ß, что соответствует приблизительно 70 % нормального репертуара ТКР-V ß человека [27].
Изучали репертуар ТКР-Vß для Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток отдельно. Система IOTest Beta Mark была адаптирована для исследования образцов КМ здоровых доноров и больных АА. Поскольку в литературе указаны референсные значения для ТКР-Vß только в периферической крови, необходимо было уточнить референсные границы для ТКР-V ß в КМ. Обогащенным считали семейство Vß, если оно выходило за верхнюю границу уточненного референсного интервала. Если все значения ТКР-Vß находились в пределах референсных интервалов доноров, то такие значения считали поликлональны-ми. Олигоклональный результат определяли при наличии преобладания одного и более обогащенных Vß-семейств, без поликлонального фона.
Статистическая обработка. Статистическая обработка выполнена с помощью R 3.6.3, GraphPad PRISM 8.0. Границы референсных интервалов для каждого из 24 клонов были рассчитаны на основании анализа КМ доноров и включали значения от 2,5 до 97,5 процен-тиля после исключения выбросов. Если у больного доля клеток с определенным семейством Vß превышала ре-ференсное значение, то делали вывод о том, что у больного выявляется клон c данным ТКРУ^-семейством. Для определения соответствия распределения нормальному использовали критерий Шапиро — Уилка. Для определения отличий в долях различных субпопуляций Т- клеток у больных и доноров использовали
Таблица 1. Моноклональные антитела к антигенам дифференцировки человека, использованные в исследовании Table 1. Monoclonal antibodies to human differentiation antigens used in the study
№ Антигенная специфичность Antigenic specificity Флуорохром Fluorochrome Клон Clone
1 CD3 FITC — флуоресцеин изотиоцианат fluorescein isothiocyanate SK7
2 CD4 APC-Cy7 — аллофикоцианин-цианин 7 allophycocyanin-cyanine 7 SK3
3 CD8 PerCP-Cy5.5 —перидинин-хлорофил протеин-цианин 5.5 peridinin-chlorophyll protein-cyanine 5.5 SK1
4 CD127 PE — фикоэритрин phycoerythrin A019D5
5 CD56 PE — фикоэритрин phycoerythrin MY31
6 CD25 FITC — флуоресцеин изотиоцианат fluorescein isothiocyanate 2A3
7 CD95 PE-Cy7 — фикоэритрин-цианин 7 phycoerythrin-cyanine 7 DX2
8 CD274 (PD-L1) PE-Cy7 — фикоэритрин-цианин 7 phycoerythrin-cyanine 7 MIH1
9 CD28 APC — аллофикоцианин allophycocyanin CD28.2
10 CD279 (PD-1) APC — аллофикоцианин allophycocyanin MIH4
Таблица 2. Основные Т-клеточные субпопуляции и фенотип клеток, определяемые в исследовании Table 2. Main T-cell subpopulations and phenotypes defined in the study
Т-клетки T-cells Фенотип клеток Cell phenotype Популяция Т-клеток, относительно которой определяли долю Reference T-cells
Двойные негативные Т-клетки Double-negative T-cells CD3+CD4-CD8- CD3+ клетки CD3+ cells
Двойные позитивные Т-клетки Double-positive T-cells CD3+CD4+CD8+ CD3+ клетки CD3+ cells
Т-хелперы T-helper cells CD3+CD4+ CD3+ клетки CD3+ cells
Цитотоксические Т-клетки Cytotoxic T-cells CD3+CD8+ CD3+ клетки CD3+ cells
TNK-клетки TNK cells CD3+CD56+ CD3+ клетки CD3+ cells
В популяциях CD4+ и CD8+ клеток CD4+ and CD8+ populations
Эффекторные Т-клетки Effector T-cells CD28-CD95+ CD28-CD95+
Активированные Т-клетки Activated T-cells CD25+ CD25+
Т-клетки «памяти» Memory T-cells CD28+CD95+ CD28+CD95+
Регуляторные Т-клетки Regulatory T-cells CD25+CD127 -
PD-1-позитивные клетки PD-1 positive cells CD279+ CD279+
PD-Ll-позитивные клетки PD-L1 positive cells CD274+ CD274+
Наивные Т-клетки Naive T-cells CD28+CD95- CD28+CD95-
2-критерий Стьюдента, если данные были распределены нормально, и критерий Манна — Уитни — в случае ненормальных распределений. Сравнение субпопуляций Т-клеток у больных АА с различной степенью тяжести и доноров осуществлялось с помощью критерия Краскела — Уоллиса с поправкой на множественные сравнения Данна. Для всех использованных критериев значимым был выбран уровень р < 0,05. Данные в таблицах представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего.
Результаты
Субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга больных АА и доноров. При анализе субпопуля-ционного состава Т-клеток у больных АА выявлена достоверно (р < 0,05) большая доля СО4+ и СО8+ эф-фекторных клеток, СО4+ клеток «памяти», СО4+РО-1+ и СО8+РО-1+, а количество субпопуляций СО4+ и СО8+ наивных клеток, С04+Р0-Ь1+ было достоверно (р < 0,05) меньше по сравнению с аналогичными субпопуляциями доноров (рис. 1). Субпопуляции СО4+, СО8+, СО3+СО4+СО8+ (двойные позитивные Т-клетки), СО3+СО4-СО8- (двойные негативные Т-клетки), СО8+ клеток «памяти», регуляторных Т-клеток, активированных СО4+ и СО8+, СО8+РО-Ь1+ клеток больных достоверно не отличались от аналогичных субпопуляций доноров (табл. 3).
Субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга больных АА в зависимости от степени тяжести заболевания. При сравнении основных субпопуляций Т-клеток у больных в зависимости от степени тяжести АА достоверные отличия (р < 0,05) были получены только в популяции двойных негативных (СО3+СО4-СО8-) Т-клеток (табл. 3). Однако у больных СТАА количество цитотоксических Т-клеток, эффектор-ных СО4+ и СО8+ клеток было больше, а количество Т-хелперов, наивных СО4+ и СО8+ клеток, СО8+ клеток «памяти» и регуляторных Т-клеток меньше, чем у больных НАА и ТАА (рис. 1). Эти отличия не были достоверными, вероятно, вследствие малого числа больных.
Сравнение субпопуляционного состава Т-клеток костного мозга доноров и больных АА в зависимости от степени тяжести заболевания. При сравнении каждой группы тяжести АА (НАА, ТАА, СТАА) с референсными значениями, полученными у доноров, были обнаружены достоверные отличия (р < 0,05) по следующим субпопуляциям Т-клеток: в группе НАА выявлено большее количество СО4+ клеток «памяти», эффекторных СО8+ клеток и меньшая доля наивных СО4+ и СО8+ клеток; в группе СТАА выявлено большее количество эффекторных СО4+ и СО8+ клеток, РО-1+СО4+ клеток и меньшее количество РО-Ь1+С04+ и РО-Ь1+СО8+ клеток. Таким образом, более выраженные отличия субпопуляционного состава Т-клеток были получены у больных НАА и СТАА
(рис. 1). Достоверных различий между остальными исследуемыми субпопуляциями не было выявлено, что может быть связано с небольшой выборкой больных в каждой группе.
Определение олигоклональности ТКР-УР-се-мейств у больных АА. При исследовании Т-клеточного репертуара Ув-семейств Т-хелперов у больных АА величина определяемого клона не превышала 10 % по сравнению с референсными значениями доноров (рис. 2А). При анализе цитотоксических Т-клеток были определены клоны с преобладающими семействами, величина которых достигала 35 % по сравнению с референсными значениями (рис. 2Б).
В популяции Т-хелперов у больных наиболее часто встречались обогащенные семейства — Ув 5.2 (п = 5), Ув 16 (п = 5), Ув 13.2 (п = 6), Ув 8 (п = 8), Ув 1 (п = 9), Ув 20 (п = 12), Ув 17 (п = 14). Четыре клона (Ув 3, 5.3, 9, 23) из 24 Ув-клонов не превышали референсных значений у всех больных АА. Только у 3 больных НАА не было выявлено клонов Ув.
В популяции Т-хелперов был проведен анализ количества клонов Ув в зависимости от степени тяжести АА. У 3 больных НАА не было выявлено расширения по ТКР-У в, а у 20 больных НАА количество обогащенных семейств Ув варьировало от 1 до 6. У всех больных ТАА было обнаружено обогащение как минимум одного семейства Ув. У всех больных СТАА были обнаружены клоны ТКР-Ув, однако их количество не превышало трех (рис. 2В, табл. 4).
В популяции СО8+ Т-клеток у больных наиболее часто встречались клоны — Ув 1 (п = 5), Ув 23 (п = 5), Ув 16 (п = 7), Ув 18 (п = 7), Ув 7.2 (п = 9), Ув 11 (п = 10) Ув 17 (п = 12). Два Ув-семейства (Ув 5.1, 5.3) не превышали референсных значений ни у одного больного. При анализе СО8+ Т-клеток у двоих больных НАА и ТАА не было выявлено обогащенных семейств Ув. У больных СТАА выявлялись ТКР-Ув-клоны, и их количество варьировало от 1 до 4 (рис. 2Г, табл. 4).
Обсуждение
Настоящее исследование посвящено изучению субпо-пуляционного состава Т-клеток и исследованию репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Количества СО4+ и СО8+ Т-клеток достоверно не отличались у больных и доноров. При детальном исследовании субпопу-ляционного состава Т-клеток выявлено, что у больных АА наблюдался сдвиг в сторону терминальных эф-фекторных клеток. Субпопуляции Т-клеток памяти, обладающие эффекторной способностью, наряду с ци-тотоксическими клетками, могут быть источником продукции ИФН-у при АА, который является негативным регулятором гемопоэза. Меньшая доля «наивных» СО4+ и СО8+ Т-клеток может свидетельствовать об истощении этих субпопуляций вследствие длительной антигенной
10Ch »
Ti
¡1 is
ф»
б 1 i gE,
ii
; 1
i
-T-:-r-
1 X
-f—I—
•i
_ _
Ii -ï-
ri ■я
■il 1J Г*
M
10
r e
•Л
И 8
loo-, eo-604020-o-
Ф1
I
â.-î
- й 4
10-
[Ь î
iE I
** п
il
fr
fei
J 2
ь
ï
J
à*
□ Доноры, donors ЩЩ Все АА, all AA cases
i I Нетяжелая АА, non severe AA
□ Тяжелая АА, severe AA
~ Сверхтяжелая АА, very severe AA
** ***
- p < 0,05 -p<0,01 - p < 0,001
Рисунок 1. Субпопуляции Т-лимфоцитов у больных АА в сравнении с донорами и в зависимости от степени тяжести АА (Т-хелперы, цитотоксические клетки, наивные и Т-клетки «памяти», эффекторные Т-клетки, TNK-клетки, регуляторные Т-клетки, двойные позитивные и двойные негативные Т-клетки, доля PD-1- и PD-L1-позитивных клеток среди популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток)
Figure 1. T-lymphocyte subpopulations in AA patients compared to donors and relative to AA severity (T-helper cells, cytotoxic cells, naive and memory T-cells, effector T-cells, TNK cells, regulatory T-cells, double positive and double negative T-cells, portions of PD-1 and PD-L1 positive cells in T-helper cells and cytotoxic T-cell populations)
стимуляции. Кроме того, у больных АА выявлена большая доля РО-1+ Т-клеток, а, как известно, РО-1-путь вовлечен в процесс активации Т-лимфоцитов, которые оказывают регуляторное воздействие на все этапы кроветворения [28].
Наиболее значительные различия были получены при анализе результатов в зависимости от степени тяжести АА. У больных ТАА и НАА все исследуемые субпопуляции Т-лимфоцитов были сопоставимы. У больных СТАА изменения субпопуляционного
состава были наиболее выраженными. У этих больных была выявлена наименьшая доля двойных негативных Т-клеток (С03+С04-С08-). Известно, что двойные негативные Т-клетки могут выступать в роли регуляторных клеток, предотвращая развитие аутоиммунных заболеваний [29]. Кроме того, у больных СТАА определялась наименьшая доля ре-гуляторных Т-клеток, хотя эти отличия были недостоверными, что может быть связано с недостаточным числом больных. Считают, что Т-рег играют ключевую
Таблица 3. Относительное количество субпопуляций Т-клеток у больных АА и доноров КМ Table 3. Relative T-cell subpopulation counts in AA patients and bone marrow donors
Субпопуляция лимфоцитов Lymphocyte subpopulation Доноры Donors Все случаи АА All АА types НАА Non severe АА ТАА Severe АА СТАА Very severe АА
Т-хелперы, % (от лимфоцитов) T-helper cells, % of lymphocytes 51,67 ± 2,1 4703 ± 1,79 48,67 ± 2,41 46,66 ± 2,72 41,42 ± 5,67
Цитотоксические T-клетки, % (от лимфоцитов) Cytotoxic T-cells, % of lymphocytes 42,36 ± 2,13 44,9 ± 1,55 43,97 ± 1,76 42,55 ± 2,64 52,73 ± 5,6
NKT-клетки, % (от лимфоцитов) NKT-cells, % of lymphocytes 4,28 ± 0,58 5,04 ± 0,42 5,03 ± 0,6 5,5 ± 0,6 4,24 ± 1,25
CD3+CD4-CD8- клетки, % (от лимфоцитов) CD3+CD4-CD8- cells, % of lymphocytes 5,18 ± 0,57 7,24 ± 0,92 6,53 ± 1,07 10,27 ± 2,22** 4,42 ± 0,87
CD3+CD4+CD8+ клетки, % (от лимфоцитов) CD3+CD4+CD8+ cells, % of lymphocytes 0,79 ± 0,1 0,83 ± 0,13 0,83 ± 0,13 0,52 ± 0,09 1,43 ± 0,62
Эффекторные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов) Effector CD4+ cells, % of T-helper cells 1,04 ± 0,27 3,39 ± 0,71* 3,3 ± 1,05 2,88 ± 1,04 4,66 ± 1,7
Наивные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов) Naive CD4+ cells, % of T-helper cells 59,73 ± 2,41 47,56 ± 2,97* 45,65 ± 4,41 54,2 ± 2,87 42,72 ± 8,78
CD4+ клетки «памяти», % (от Т-хелперов) Memory CD4+ cells, % of T-helper cells 3799 ± 2,46 47799 ± 2,71* 50,1 ± 3,86 41,83 ± 2,74 51,18 ± 9,15
Эффекторные CD8+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток) Effector CD8+ cells, % of cytotoxic T-cells 23,78 ± 2,22 37,26 ± 2,61* 35,61 ± 3,22 33,98 ± 5,38 49,6 ± 6,09
Наивные CD8+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток) Naive CD8+ cells, % of cytotoxic T-cells 28,8 ± 3,13 18,77 ± 1,91* 16,91 ± 2,32 25,09 ± 4,28 14,31 ± 3,34
CD8+ клетки «памяти», % (от Т-цитотоксических клеток) Memory CD8+ cells, % of cytotoxic T-cells 41,92 ± 2,77 39,15 ± 2,41 42,5 ± 3,17 37736 ± 4,79 29,61 ± 4,48
Регуляторные T-клетки, % (от Т-хелперов) Regulatory T'cells, % of T-helper cells 9,36 ± 0,54 9,31 ± 0,59 9,28 ± 0,76 10,25 ± 1,37 784 ± 0,88
Активированные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов) Activated CD4+ cells, % of T-helper cells 1744 ± 2,63 20,93 ± 2,07 21,97 ± 3,09 20,12 ± 3,39 18,33 ± 3,63
CD4+PD-1+ клетки, % (от Т-хелперов) CD4+PD-1 + cells, % of T-helper cells 11,42 ± 1,45 14,03 ± 1,27* 13,59 ± 1,33 11,3 ± 1,42 20,54 ± 5,69
CD4+PD-L1+ клетки, % (от Т-хелперов) CD4+PD-L1 + cells, % of T-helper cells 2,22 ± 0,48 1,52 ± 0,33* 1,91 ± 0,51 1,38 ± 0,39 0,27 ± 0,06
CD8+PD-1+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток) CD8+PD-1 + cells, of% cytotoxic T-cells 19,05 ± 2,22 25,73 ± 2,03* 27,27 ± 2,9 21,83 ± 3,31 2748 ± 5,29
CD8+PD-L1+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток) CD8+PD-LV cells, of% cytotoxic T-cells 0,76 ± 0,21 0,76 ± 0,21 1,46 ± 0,53 0,81 ± 0,22 0,1 ± 0,04
Примечание. * — достоверные различия между больными АА и здоровыми донорами (p < 0,05); ** — достоверные различия между больными АА в зависимости от степени тяжести заболевания (p < 0,05).
Note. * — significant differences in AA patients vs. healthy donors (p <0.05!; ** — significant differences between AA patients relative to the disease severity (p < 0.05!.
роль в механизмах иммунной толерантности [30]. Основными функциями Т-рег является их выраженная способность подавлять активацию Т-эффекторов или клеток «памяти», а также регулировать аутореак-тивность Т-клеток [31]. Уменьшенное количество Т- рег не в состоянии подавить функцию активированных Т-клеток, которые повреждают кроветворные клетки в КМ. Также можно предположить, что даже при «нормальном» количестве Т-рег их функциональные свойства могут быть нарушены у больных АА. В работе 8. Ко^аэЬ. и соавт. [7] показано, что Т- рег, выделенные
у больных АА, крайне слабо подавляют секрецию ИФН-у и фактора некроза опухоли-в, что является их функциональным дефектом.
Также обнаружено, что наибольшая доля РО-1-позитивных Т-клеток выявлялась у больных СТАА. В норме связывание РО-1 его лигандами РО-Ь1 и РО-Ь2 подавляет пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов [14]. Аберрантная высокая экспрессия костимуляторных молекул, включая РО-1, возможно связана с постоянной активацией аутореактив-ных Т-клеток при АА. Повышенная экспрессия РО-1
Таблица 4. Количественное обогащение семейств V^ в общей группе больных АА, а также в зависимости от степени тяжести АА Table 4. Quantitative enrichment of Vft families in all patients and AA severity groups
Т-хелперы (CD4+ клетки) T-helper cells (CD4+ cells) Цитотоксические клетки (CD8+ клетки) Cytotoxic T-cells (CD8+ cells)
количество обогащенных VP-семейств, превышающих референсные значения number of enriched VP families exceeding reference values ТАА SAA (n = H) НАА Non SAA (n = 22) СТАА Very SAA (n = 6) больные АА с обогащением VP ТАА семейств SAA number of AA patients (n = 11) with VP enrichment НАА Non SAA (n = 22) СТАА Very SAA (n = 6) больные АА с обогащением VP-семейств number of AA patients with VP enrichment
0 - 1 3 1 - 3 1 1 - 2
1 4 5 2 11 1 7 1 9
2 2 5 1 8 4 7 2 13
3 4 6 3 13 5 4 2 11
4 1 2 - 3 - 2 1 3
5 - - - - - 1 - 1
6 - 1 - 1 - - - -
Ад
Бб
И
S s
î»
1
in-iNjî'mHiiti Д в С п г* m
m\
rt Pd I^i 3 Pi — -Slit i ^ SO О -ч rs '
bc
TD
n jlaua
шшк
SÏ5Î
-TAA -HAA
Severe AA Non severe AA
СТАА
Very severe AA
Рисунок 2. Распределения VP-семейств в популяциях CD3+CD8+ и CD3+CD4+ клеток больных АА (n = 39). А — все VP-семейства, экспрессируемые на CD3+CD4+ клетках больных АА. Б — все VP-семейства, экспрессируемые на CD3+CD8+ клетках больных АА. В — доля VP-семейств в популяции CD3+CD4+ клеток, превышающих референсные значения. Г — доля VP-семейств в популяции CD3+CD8+ клеток, превышающих референсные значения
Figure 2. Distribution of VP families in CD3+CD8+ and CD3+CD4+ populations in AA patients (n = 39). A — total CD3+CD4+-expressed VP families in AA patients. B — total CD3+CD8+-expressed Vp families in AA patients. C — portion of CD3+CD4+-Vp families exceeding reference values. D — portion of CD3+CD8+-VP families exceeding reference values
на Т-клетках, обнаруженная в настоящем исследовании, по-видимому, не способствует подавлению функции Т-клеток. Однако механизм, лежащий в основе дисфункции РО-1, остается до сих пор неясным. Доля РО-1-позитивных Т-клеток может ассоциироваться со степенью тяжести АА. Таким образом, у больных СТАА определялся дефицит общего числа Т-хелперов и преобладание цитотоксических Т-клеток, значительное уменьшение количества регуляторных клеток, что согласуется с ранее опубликованными исследованиями [32—34].
Олигоклональная экспансия Т-клеток является ключевым событием в патогенезе АА. В многочисленных исследованиях показано обогащение V в-семейств в популяциях С04+ и С08+ Т-клеток. При этом изменения клонов Vв в популяции Т-хелперов были значительно меньше, чем в популяции цитотоксических клеток [35—37]. Аналогичный результат получен в настоящем исследовании. При анализе репертуара ТКР-Ув методом проточной цитофлуориметрии было обнаружено, что характер распределения семейств Vв в Т-хелперах поликлонален (рис. 2А). Несмотря на поликлональ-ную картину, у 92,3 % больных АА среди С04+ клеток выявлялось, как минимум, одно семейство Vв, размер которого не превышал референсный интервал более чем на 10 % (рис. 2В), что не является значительным отклонением от референсных значений доноров.
В отличие от Т-хелперов в популяции цитотокси-ческих Т-клеток размер выявляемых клонов ТКР-УР был более выраженным с максимальным значением обогащенного семейства у одного больного до 35 % (рис. 2Б). У 2 больных (5 %) не было выявлено увеличения Vв-семейств в популяции цитотоксических клеток. Количество клонов у каждого больного варьировало от 1 до 6, но с большей частотой определялось 1, 2 или 3 клона. Наиболее часто встречалось обогащение семейств Vв 11, Vв 17, Vв 20, причем количество Vв 17 было увеличено как среди Т-хелперов, так и среди ци-тотоксических клеток.
Определение репертуара ТКР-Ув с помощью метода проточной цитофлуориметрии доступнее, быстрее и имеет меньшую стоимость по сравнению с секвени-рованием нового поколения и может быть выполнено с использованием коммерческого набора. Однако, используя данную методику, можно выявить только расширение определенного Vв-семейства, что не эквивалентно понятию «клон», принятому в молекулярной биологии. Выявленные с помощью проточной цитофлу-ориметрии обогащенные V в-семейства у больных с АА могут быть использованы для оценки ответа на ИСТ и активности заболевания.
Таким образом, в настоящем исследовании проведен анализ значительного количества характери-
стик Т-лимфоцитов у большой группы больных АА. Были выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эф-фекторных С04+ и С08+ клеток, С04+ клеток «памяти», что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитоки-нов. Уменьшение «наивных» С04+ и С08+ клеток, ре-гуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток (С03+С04-С08-) доказывает снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками.
Была установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и РО-1-позитивных Т-клеток: самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных СТАА.
Сравнительный анализ проведен с использованием образцов КМ. В большинстве исследований анализ клеточных популяций у больных АА проводится на образцах периферической крови, однако в данной работе исследование КМ позволило получить более детальную информацию об изменениях Т-клеточных субпопуляций [7, 38, 39]. При анализе репертуара ТКР-У в была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток. Можно предположить, что обогащение семейств Vв свидетельствует о наличии аутореактив-ного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный патогенез АА.
Требуется дальнейшее изучение многочисленных клеточных субпопуляций, участвующих в аномальном иммунном ответе при АА, так как ни аутоантиге-ны, ни причины развития аутореактивности при АА не установлены. Подробное исследование субпопуля-ционного состава Т-клеток при этом заболевании необходимо для лучшего понимания патофизиологии АА, а также для поиска оптимальных программ лечения. Динамическое исследование ТКР-Ув-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания, учитывая, что доминантные клоны, выявляемые в дебюте болезни, могут вновь определяться перед рецидивом, являясь предвестником возврата болезни [23, 35]. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявлять значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА, но для этого необходимы большая когорта больных и исследования на разных этапах терапии АА.
Литература
1. Михайлова Е.А., Фидарова З.Т., Устинова Е.Н. и др. Комбинированная иммуносупрессивная терапия больных апластической анемией: эффективность повторных курсов антитимоцитарного глобулина. Гематология и трансфузиология. 2014; 50(7): 11 -8.
2. Kulagin A., Lisukov I., Ivanova M. et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: Results of two-centre prospective study. Br J Haematol. 2014; 164(4): 546-54. DOI: 10.1111/bjh. 12661.
3. Young N.S., Calado R.T., Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia. Blood. 2006; 108(8): 2509-19. DOI: 10.1182/blood-2006-03-010777
4. Chen J., Ellison F.M., Eckhaus M.A. et al. Minor antigen H60-mediated aplastic anemia is ameliorated by immunosuppression and the infusion of regulatory T-cells. J Immunol. 2007; 178(7): 4159-68. DOI: 10.4049/jimmunol.178.7.4159.
5. Risitano A.M., Maciejewski J.P., Green S. et al. In vivo dominant immune responses in aplastic anaemia: Molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by TCR P-CDR3 sequencing. Lancet. 2004; 364(9431): 355-64. DOI: 10.1016/S0140-6736(04)16724-X.
6. Zeng W., Kajigaya S., Chen G. et al. Transcript profile of CD4+ and CD8+ T-cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. Exp Hematol. 2004; 32(9): 806-14. DOI: 10.1016/j.exphem.2004.06.004.
7 Kordasti S., Marsh J., Al-Khan S. et al. Functional characterization of CD4+ T-cells in aplastic anemia. Blood. 2012; 119(9): 2033-43. DOI: 10.1182/ blood-2011-08-368308.
8. Tau G., Rothman P. Biologic functions of the IFN-gamma receptors. Allergy. 1999; 54(12): 1233-51. DOI: 10.1034/j.1398-9995.1999.00099.x.
9. Solomou E.E., Rezvani K., Mielke S. et al. Deficient CD4+CD25+ FOXP3+ T-regul atory cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2007; 110(5): 1603-6. DOI: 10.1182/blood-2007-01-066258.
10. Shi J., Ge M., Lu S. et al. Intrinsic impairment of CD4+CD25+ regulatory T-cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2012; 120(8): 1624-32. DOI: 10.1182/ blood-2011-11-390708.
11. Zoumbos N.C., Ferris W.O., Hsu S.-M. et al. Analysis of lymphocyte subsets in patients with aplastic anaemia. Br J Haematol. 1984; 58(1): 95-105. DOI: 10.1111/1.1365-2141,1984.tb06063.x.
12. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K. et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11(11): 3887-95. DOI: 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481 .x.
13. Keir M.E., Liang S.C., Guleria I. et al. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T-cell tolerance. J Exp Med. 2006; 203(4): 883-95. DOI: 10.1084/ jem.20051776.
14. Fife B.T., Pauken K.E. The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci. 2011; 1217(1): 45-59. DOI: 10.1111 /¡.1749-6632.2010.05919.x.
15. Zhao W., Zhang Y., Zhang P. et al. High programmed death 1 expression on T-cells in aplastic anemia. Immunol Lett. 2017; 183: 44-51. DOI: 10.1016/j. imlet.2017.01.016.
16. Wu H., Miao M., Zhang G. et al. Soluble PD-1 is associated with aberrant regulation of T-cells activation in aplastic anemia. Immunol Invest. 2009; 38(5): 408-21. DOI: 10.1080/08820130902912332.
17. Choo S.Y. The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications. Yonsei Med J. 2007; 48(1): 11 -23. DOI: 10.3349/ymj.2007.48.1.11.
18. Rudolph M.G., Stanfield R.L., Wilson I.A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu Rev Immunol. 2006; 24(1): 419-66. DOI: 10.1146/an-nurev.immunol.23.021704.115658.
References
1. Mikhailova E.A., Fidarova Z.T., Ustinova E.N. et al. Combined immunosuppressive therapy for aplastic anaemia: efficacy of antithymocyte globulin repeated courses. Gematologiya i transfuziologiya. 2014; 50(7): 11-8 (In Russian).
2. Kulagin A., Lisukov I., Ivanova M. et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: Results of two-centre prospective study. Br J Haematol. 2014; 164(4): 546-54. DOI: 10.1111/bjh.12661.
3. Young N.S., Calado R.T., Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia. Blood. 2006; 108(8): 2509-19. DOI: 10.1182/blood-2006-03-010777.
4. Chen J., Ellison F.M., Eckhaus M.A. et al. Minor antigen H60-mediated aplastic anemia is ameliorated by immunosuppression and the infusion of regulatory T-cells. J Immunol. 2007; 178(7): 4159-68. DOI: 10.4049/jimmunol.178.74159.
5. Risitano A.M., Maciejewski J.P., Green S. et al. In-vivo dominant immune responses in aplastic anaemia: Molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by TCR P-CDR3 sequencing. Lancet. 2004; 364(9431): 355-64. DOI: 10.1016/S0140-6736(04)16724-X.
6. Zeng W., Kajigaya S., Chen G. et al. Transcript profile of CD4+ and CD8+ T-cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. Exp Hematol. 2004; 32(9): 806-14. DOI: 10.1016/j.exphem.2004.06.004.
7. Kordasti S., Marsh J., Al-Khan S. et al. Functional characterization of CD4+ T-cells in aplastic anemia. Blood. 2012; 119(9): 2033-43. DOI: 10.1182/ blood-2011-08-368308.
8. Tau G., Rothman P. Biologic functions of the IFN-gamma receptors. Allergy. 1999; 54(12): 1233-51. DOI: 10.1034/j.1398-9995.1999.00099.x.
9. Solomou E.E., Rezvani K., Mielke S. et al. Deficient CD4+CD25+ FOXP3+ T-regul atory cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2007; 110(5): 1603-6. DOI: 10.1182/blood-2007-01-066258.
10. Shi J., Ge M., Lu S. et al. Intrinsic impairment of CD4+CD25+ regulatory T-cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2012; 120(8): 1624-32. DOI: 10.1182/ blood-2011-11-390708.
11. Zoumbos N.C., Ferris W.O., Hsu S.-M. et al. Analysis of lymphocyte subsets in patients with aplastic anaemia. Br J Haematol. 1984; 58(1): 95-105. DOI: 10.1111 /¡.1365-2141,1984.tb06063.x.
12. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K. et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11(11): 3887-95. DOI: 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481 .x.
13. Keir M.E., Liang S.C., Guleria I. et al. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T-cell tolerance. J Exp Med. 2006; 203(4): 883-95. DOI: 10.1084/ jem.20051776.
14. Fife B.T., Pauken K.E. The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci. 2011; 1217(1): 45-59. DOI: 10.1111/j.1749-6632.2010.05919.x.
15. Zhao W., Zhang Y., Zhang P. et al. High programmed death 1 expression on T-cells in aplastic anemia. Immunol Lett. 2017; 183: 44-51. DOI: 10.1016/j. imlet.201701.016.
16. Wu H., Miao M., Zhang G. et al. Soluble PD-1 is associated with aberrant regulation of T-cells activation in aplastic anemia. Immunol Invest. 2009; 38(5): 408-21. DOI: 10.1080/08820130902912332.
17 Choo S.Y. The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications. Yonsei Med J. 2007; 48(1): 11-23. DOI: 10.3349/ymj.200748.1.11. 18. Rudolph M.G., Stanfield R.L., Wilson I.A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu Rev Immunol. 2006; 24(1): 419-66. DOI: 10.1146/an-nurev.immunol.23.021704.115658.
19. Attygalle A., Al-Jehani R., Diss T.C. et al. Neoplastic T-cells in angioimmu-noblastic T-cell lymphoma express CD10. Blood. 2002; 99(2): 627-33. DOI: 10.1182/blood.V99.2.627.
20. Cui J.H., Lin K.R., Yuan S.H. et al. TCR repertoire as a novel indicator for immune monitoring and prognosis assessment of patients with cervical cancer. Front Immunol. 2018; 9: 2729. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02729.
21. Lundell R., Hartung L., Hill S. et al. T-cell large granular lymphocyte leuke-mias have multiple phenotypic abnormalities involving pan-T-cell antigens and receptors for MHC molecules. Am J Clin Pathol. 2005; 124(6): 937-46. DOI: 10.1309/PH7X78HF4FW4PRKW.
22. Kook H., Risitano A.M., Zeng W. et al. Changes in T-cell receptor VB repertoire in aplastic anemia: Effects of different immunosuppressive regimens. Blood. 2002; 99(10): 3668-75. DOI: 10.1182/blood.V99.10.3668.
23. Risitano A.M., Kook H., Zeng W. et al. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by Vß CDR3 spectratyping and flow cytometry. Blood. 2002; 100(1 ): 178-83. DOI: 10.1182/blood-2002-01-0236.
24. Rowen L., Koop B.F., Hood L. The complete 685-kilobase DNA sequence of the human ß T-cell receptor locus. Science. 1996; 272(5269): 1755-62. DOI: 10.1126/science.272.5269.1755.
25. Tembhare P., Yuan C.M., Morris J.C. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vß repertoire analysis in fine-needle aspirates and cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 2012;137(2): 220-6. DOI: 10.1309/ AJCPPT93VZMAREHK.
26. Cossarizza A., Chang H.D., Radbruch A. et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019; 49(10): 1457-973. DOI: 10.1002/eji.201970107.
27. Tembhare P., Yuan C.M., Xi L. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vß repertoire analysis: Detection of T-cell clonality at diagnosis and monitoring of minimal residual disease following therapy. Am J Clin Pathol. 2011; 135(6): 890-900. DOI: 10.1309/ AJCPV2D1DDSGJDBW.
28. Cheng X., Veverka V., Radhakrishnan A. et al. Structure and interactions of the human programmed cell death 1 receptor. J Biol Chem. 2013; 288(17): 1177185. DOI: 10.1074/jbc.M112.448126.
29. Juvet S.C., Zhang L. Double negative regulatory T-cells in transplantation and autoimmunity: Recent progress and future directions. J Mol Cell Biol. 2012; 4(1 ): 48-58. DOI: 10.1093/jmcb/mjr043.
30. Hall B.M. T-cells: Soldiers and spies — the surveillance and control of effector T-cells by regulatory T-cells. Clin J Am Soc Nephrol. 2015; 10(11): 2050-64. DOI: 10.2215/CJN.06620714.
31. Okada R., Kondo T., Matsuki F. et al. Phenotypic classification of human CD4+ T-cell subsets and their differentiation. Int Immunol. 2008; 20(9): 1189-99. DOI: 10.1093/intimm/dxn075.
32. Young N.S., Scheinberg P., Calado R.T. Aplastic anemia. Curr Opin Hematol. 2008; 15(3): 162-8. DOI: 10.1097/MOH.0b013e3282fa7470.
33. Qi W., Ren Y., Fu R. et al. Detection and significance of CD4+CD25+CD127dim regulatory T-cells in individuals with severe aplastic anemia. Turkish J Hematol. 2015; 32(3): 220-7 DOI: 10.4274/tjh.2013.0410.
34. Yan L., Fu R., Liu H. et al. Abnormal quantity and function of regulatory T-cells in peripheral blood of patients with severe aplastic anemia. Cell Immunol. 2015; 296(2): 95-105. DOI: 10.1016/j.cellimm.2015.04.001.
35. Giudice V., Feng X., Lin Z. et al. Deep sequencing and flow cytometric characterization of expanded effector memory CD8+CD57+ T-cells frequently reveals T-cell receptor Vß oligoclonality and CDR3 homology in acquired aplastic anemia. Haematologica. 2018; 103(5): 759-69. DOI: 10.3324/haematol.2017176701.
19. Attygalle A., Al-Jehani R., Diss T.C. et al. Neoplastic T-cells in angioimmu-noblastic T-cell lymphoma express CD10. Blood. 2002; 99(2): 627-33. DOI: 10.1182/blood.V99.2.627
20. Cui J.H., Lin K.R., Yuan S.H. et al. TCR repertoire as a novel indicator for immune monitoring and prognosis assessment of patients with cervical cancer. Front Immunol. 2018; 9: 2729. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02729.
21. Lundell R., Hartung L., Hill S. et al. T-cell large granular lymphocyte leuke-mias have multiple phenotypic abnormalities involving pan-T-cell antigens and receptors for MHC molecules. Am J Clin Pathol. 2005; 124(6): 937-46. DOI: 10.1309/PH7X78HF4FW4PRKW.
22. Kook H., Risitano A.M., Zeng W. et al. Changes in T-cell receptor VB repertoire in aplastic anemia: Effects of different immunosuppressive regimens. Blood. 2002; 99(10): 3668-75. DOI: 10.1182/blood.V99.10.3668.
23. Risitano A.M., Kook H., Zeng W. et al. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by Vß CDR3 spectratyping and flow cytometry. Blood. 2002; 100(1): 178-83. DOI: 10.1182/blood-2002-01-0236.
24. Rowen L., Koop B.F., Hood L. The complete 685-kilobase DNA sequence of the human ß T-cell receptor locus. Science. 1996; 272(5269): 1755-62. DOI: 10.1126/science.272.5269.1755.
25. Tembhare P., Yuan C.M., Morris J.C. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vß repertoire analysis in fine-needle aspirates and cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 2012;137(2): 220-6. DOI: 10.1309/ AJCPPT93VZMAREHK.
26. Cossarizza A., Chang H.D., Radbruch A. et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019; 49(10): 1457-973. DOI: 10.1002/eji.201970107.
27. Tembhare P., Yuan C.M., Xi L. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vß repertoire analysis: Detection of T-cell clonality at diagnosis and monitoring of minimal residual disease following therapy. Am J Clin Pathol. 2011; 135(6): 890-900. DOI: 10.1309/ AJCPV2D1 DDSGJDBW.
28. Cheng X., Veverka V., Radhakrishnan A. et al. Structure and interactions of the human programmed cell death 1 receptor. J Biol Chem. 2013; 288(17): 1177185. DOI: 10.1074/jbc.M112.448126.
29. Juvet S.C., Zhang L. Double negative regulatory T-cells in transplantation and autoimmunity: Recent progress and future directions. J Mol Cell Biol. 2012; 4(1): 48-58. DOI: 10.1093/jmcb/mjr043.
30. Hall B.M. T-cells: Soldiers and spies — the surveillance and control of effector T-cells by regulatory T-cells. Clin J Am Soc Nephrol. 2015; 10(11): 2050-64. DOI: 10.2215/CJN.06620714.
31. Okada R., Kondo T., Matsuki F. et al. Phenotypic classification of human CD4+ T-cell subsets and their differentiation. Int Immunol. 2008; 20(9): 1189-99. DOI: 10.1093/intimm/dxn075.
32. Young N.S., Scheinberg P., Calado R.T. Aplastic anemia. Curr Opin Hematol. 2008; 15(3): 162-8. DOI: 10.1097/MOH.0b013e3282fa7470.
33. Qi W., Ren Y., Fu R. et al. Detection and significance of CD4+CD25+CD127dim regulatory T-cells in individuals with severe aplastic anemia. Turkish J Hematol. 2015; 32(3): 220-7 DOI: 10.4274/tjh.2013.0410.
34. Yan L., Fu R., Liu H. et al. Abnormal quantity and function of regulatory T-cells in peripheral blood of patients with severe aplastic anemia. Cell Immunol. 2015; 296(2): 95-105. DOI: 10.1016/j.cellimm.2015.04.001.
35. Giudice V., Feng X., Lin Z. et al. Deep sequencing and flow cytometric characterization of expanded effector memory CD8+CD57+ T-cells frequently reveals T-cell receptor Vß oligoclonality and CDR3 homology in acquired aplastic anemia. Haematologica. 2018; 103(5): 759-69. DOI: 10.3324/haematol.2017176701.
36. Guan J., Sun Y., Fu R. et al. A cohort study of immune and hematopoietic functionality changes in severe aplastic anemia patients treated with immunosuppressive therapy. Medicine. 2019; 98(3): e14149. DOI: 10.1097/ MD.0000000000014149.
37 Maciejewski J.P., Risitano A., Kook H. et al. Immune pathophysiology of aplastic anemia. Int J Hematol. 2002; 76 Suppl 1: 207-14. DOI: 10.1007/BF03165246.
38. Appay V., Van Lier R.A.W., Sallusto F. et al. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: Consensus and issues. Cytom Part A. 2008; 73(11 ): 975-83. DOI: 10.1002/cyto.a.20643.
39. Zhang H.F., Huang Z.D., Wu X.R. et al. Comparison of T lymphocyte subsets in aplastic anemia and hypoplastic myelodysplastic syndromes. Life Sci. 2017; 189: 71-5. DOI: 10.1016/j.lfs.201709.020.
36. Guan J., Sun Y., Fu R. et al. A cohort study of immune and hematopoietic functionality changes in severe aplastic anemia patients treated with immunosuppressive therapy. Medicine. 2019; 98(3): e14149. DOI: 10.1097/ MD.0000000000014149.
37. Maciejewski J.P., Risitano A., Kook H. et al. Immune pathophysiology of aplastic anemia. Int J Hematol. 2002; 76 Suppl 1: 207-14. DOI: 10.1007/BF03165246.
38. Appay V., Van Lier R.A.W., Sallusto F. et al. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: Consensus and issues. Cytom Part A. 2008; 73(11): 975-83. DOI: 10.1002/cyto.a.20643.
39. Zhang H.F., Huang Z.D., Wu X.R. et al. Comparison of T lymphocyte subsets in aplastic anemia and hypoplastic myelodysplastic syndromes. Life Sci. 2017; 189: 71-5. DOI: 10.1016/j.lfs.2017.09.020.
Информация об авторах
Абрамова Анастасия Владимировна*, врач отделения высокодозной интенсивной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, e-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8113-6115
Гальцева Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8490-6066
Михайлова Елена Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения высокодозной интенсивной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected] ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2449-2682
Капранов Николай Михайлович, медицинский физик лаборатории иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6512-910X
Давыдова Юлия Олеговна, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5932-0285
Information about the authors
Anastasia V. Abramova*, Physician, Department of High-Dose Intensive Chemotherapy of Hemoblastosis and Bone Marrow Depression, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8113-6115
Irina V. Galtseva, Cand. Sci. (Med.), Head of the Laboratory of Blood and Bone Marrow Cell Immunophenotyping, National Research Center for Hemato-
e-mail: [email protected]
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8490-6066
Elena A. Mikhailova, Dr. Sci. (Med.), Professor, Leading Researcher, Department of High-Dose Intensive Chemotherapy of Hemoblastosis and Bone Marrow Depression, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected] ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2449-2682
Nikolay M. Kapranov, Medical Physicist, Laboratory of Blood and Bone Marrow Cell Immunophenotyping, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected] ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6512-910X
Yulia O. Davydova, Physician (clinical diagnostics), Laboratory of Blood and Bone Marrow Cell Immunophenotyping, National Research Center for Hematol-
e-mail: [email protected]
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5932-0285
Фидарова Залина Таймуразовна, кандидат медицинских наук, заведующая отделением химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с дневным стационаром, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-тсл1: [email protected] 01?СЮ: http://orcid.org/0000-0003-0934-6094
Троицкая Вера Витальевна, кандидат медицинских наук, заведующая отделением интенсивной высокодозной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром; заместитель генерального директора по лечебной работе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-тюП: [email protected]
01?СЮ: http://orcid.org/0000-0002-4827-8947
Паровичникова Елена Николаевна, доктор медицинских наук, руководитель отдела химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-тюП: [email protected]
01?СЮ: http://orcid.org/0000-0001-6177-3566
Савченко Валерий Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, генеральный директор ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-тюП: [email protected]
01?СЮ: http://orcid.org/0000-0001-8188-5557
* Автор, ответственный за переписку
Поступила: 15.07.2020 Принята в печать: 27.10.2020
Zalina T. Fidarova, Cand. Sci. (Med.), Head of the Department of High-Dose Intensive Chemotherapy of Hemoblastosis and Bone Marrow Depression, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected] ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0934-6094
Vera V. Troitskaya, Cand. Sci. (Med.), Head of the Department of Intensive High-dose Chemotherapy of Hemoblastosis and Bone Marrow Depression with All-Day Hospital; Deputy Director for Medical Affairs , National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4827-8947
Elena N. Parovichnikova, Dr. Sci. (Med.), Head of the Department of Chemotherapy of Hemoblastosis, Hematopoiesis Depression and Bone Marrow Transplantation, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected] ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6177-3566
Valery G. Savchenko, Dr. Sci. (Med.), Full Member of the Russian Academy of Sciences, Professor, Director, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-8188-5557
* Corresponding author
Received 15 July 2020 Accepted 27 Oct 2020
