CC BY
65
DOI: 10.15690/onco.v5i1.1864
О.П. Колбацкая, Т.В. Горбунова, Н.Н. Тупицын
Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина,
Москва, Российская Федерация
Изучение количества CD57+ цитотоксических Т-лимфоцитов костного мозга при развитии мелкокруглоклеточных сарком у детей: ретроспективное когортное
исследование
В современной литературе недостаточно данных о содержании популяции цитотоксических CD57+ Т-лимфоцитов (ЦТЛ) костного мозга у детей в норме и при развитии мелкокруглоклеточных сарком (раб-домиосаркомы и саркомы Юинга). Цель исследования — изучить количество CD57+ ЦТЛ в костном мозге детей при развитии мелкокруглоклеточных сарком. Методы. Проведен ретроспективный когорт-ный анализ за период с 2006 по 2011 г. результатов обследования 47 больных в возрасте от 1 года до 17 лет, средний возраст 8,6 года, у которых был исследован пунктат костного мозга морфологическим и иммуноцитометрическим методом. Полученные средние значения CD57+ Т-клеток (процентные и абсолютные) обрабатывались статистической программой SPSS17. Результаты. Рабдомиосаркома была диагностирована у 16 больных, саркома Юинга — у 16, диагнозы подтверждены морфологическим и иммуногистохимическим методами. Пациенты, у которых исключены злокачественные нео-плазии, составили контрольную группу (n=15). При саркоме Юинга повышены проценты CD3+CD57+ (р=0,022) и CD8+CD57+ (р=0,028) субпопуляций. Процентное и абсолютное содержание CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеток в костном мозге больных рабдомиосаркомой не отличалось от контрольных значений (p=0,125 и р=0,181 соответственно). Сравнение процентов CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеток костного мозга в обеих группах больных различий не выявило (р=0,091 и р=0,060 соответственно). У больных саркомой Юинга выше абсолютные количества CD3+CD57+ и CD8+CD57+ (р=0,009 и р=0,014 соответственно) Т-клеточных субпопуляций, чем у больных рабдомиосаркомой. Заключение. Каждое злокачественное заболевание на этапе диагностики характеризуется специфическими изменениями субпопуляционного состава CD57+ ЦТЛ поздних стадий дифференцировки в костном мозге, что позволяет выявлять их клиническое и прогностическое значение, лучше понимать механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы и может быть использовано при разработке программ иммунотерапии.
Ключевые слова: детская онкология, костный мозг, цитотоксические Т-лимфоциты, саркома Юинга, рабдомиосаркома.
(Для цитирования: Колбацкая О.П., Горбунова Т.В., Тупицын Н.Н. Изучение количества CD57+ цитотоксических Т-лимфоцитов костного мозга при развитии мелкокруглоклеточных сарком у детей: ретроспективное когортное исследование. Онкопедиатрия. 2018;5(1):32-40. Doi: 10.15690/onco.v5i1.1864)
32
ОБОСНОВАНИЕ
Саркомы мягких тканей и костей составляют 12% всех злокачественных опухолей детского возраста, характеризуются быстрым прогрессирова-нием, гематогенным и лимфогенным метастази-рованием. Несмотря на достижения последнего десятилетия в области химиолучевого лечения сарком у детей, прогноз при распространенных стадиях опухолевого процесса остается неблагоприятным, и пятилетняя общая выживаемость больных не превышает 25-30% [1, 2]. До сих пор остаются неизученными иммунологические факторы прогноза при солидных опухолях у детей.
Особое место среди этих факторов занимает состояние иммунной системы костного мозга.
В последние годы доказана важная роль костного мозга в поддержании иммунного гомеоста-за организма [3]. Костный мозг, с одной стороны, является центральным органом гемопоэза и имму-нопоэза, обеспечивает сохранность и целостность организма, с другой — функционирует как вторичный лимфоидный орган, в котором находятся основные антителопродуценты (плазматические клетки), цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), Т-хелперы, регуляторные Т-клетки, В-лимфоциты, дендритные клетки, натуральные киллеры, нату-
ральные Т-киллеры, миелоидные супрессорные и мезенхимальные стволовые клетки [3]. Одними из основных клеток-эффекторов в противоопухолевом иммунном ответе являются ЦТЛ, распознаваемые по наличию маркеров CD3+ и CD8+ [4]. Противоопухолевый иммунитет человека связан с формированием клона антигенспецифических CD3+CD8+ Т-эффекторов, способных распознавать и осуществлять реакции киллинга опухолевых клеток [4].
В экспериментальной работе M. Feuerer и соавт. показано, что костный мозг является ключевым органом в формировании противоопухолевого иммунного ответа, эффективность которого коррелирует с количеством зрелых Т-клеток костного мозга [5]. В исследовании была доказана возможность костного мозга в отсутствии вторичных лим-фоидных органов образовывать пул ЦТЛ и Т-клеток
памяти и осуществлять эффективный противоопухолевый иммунитет против гематогенно распространяющихся злокачественных клеток [5].
Как известно в настоящее время, появление опухолевого клона и его пролиферация сопровождаются хронической антигенной стимуляцией клеточного звена иммунитета, что приводит к постепенному накоплению антигенспецифичных олигоклональных Т-клеток на поздних стадиях дифференцировки [4, 6]. Фенотипически Т-клетки на поздних стадиях дифференцировки характеризуются отсутствием CD45RO-изоформы, снижением/отсутствием экспрессии костимуляторных молекул CD27/CD28, утратой хемокинового рецептора CCR7 (chemokine receptor type 7) и приобретением экспрессии CD57 вместе с реэкспрессией CD45RA [6]. По своим функциональным свойствам CD8+CD28-CD57+ Т-клетки описываются как
Olga P. Kolbatskaya, Tatiana V. Gorbunova, Nikolai N. Tupitsyn
Blokhin Medical Research Center of Oncology, Moscow, Russian Federation
А Study of the Amount of CD57+ Cytotoxic T-lymphocytes in Bone Marrow associated with the Development of Small Round Cell Sarcomas in Children: A Retrospective Cohort Study
Background. There is little data on the number of CD57+ cytotoxic T-lymphocytes (CTL) in the bone marrow of healthy children and children with developing small round cell sarcomas (rhabdomyosarcoma and Ewing^s sarcoma). Objective. Our aim was to study the amount of CD57 + CTL in bone marrow of children with developing small round cell sarcomas. Methods. A retrospective cohort analysis was conducted for the period of 2006-2011. It enrolled 47 patients aged 1-17 y.o. (mean age — 8.6 years) who underwent the bone marrow aspiration; the examination results were studied with morphological and immunocytometric method. The obtained mean values of CD57+ T-cell were processed by the statistical program SPSS17. Results. Rhabdomyosarcoma (RMS) was diagnosed in 16 patients, Ewing^s sarcoma (ES) — in 16 patients. The control group included 15 patients with no malignant tumours. In patients with ES, higher percent of CD3+CD57+ (p=0.022) and CD8+CD57+ (p=0.028) subpopulations was registered. The percentage and absolute level of CD3+CD57+ and CD8+CD57+ T-cells in the bone marrow of patients with RMS did not differ from the control (p=0.125 and p=0.181 respectively). Comparison of percentage of CD3+CD57+ and CD8+CD57+ T-lymphocyte subpopulations in subjects of both groups revealed no differences (p=0.091 and p=0.060 respectively). We registered higher amount of CD3+CD57+ and CD8+CD57+ T-cell subpopulations in patients with ES than in patients with RMS (p=0.009 and p=0.014 respectively). Conclusion. Each malignant disease when diagnosing is characterized by specific changes in the patterns of CD57 + CTL subpopulations derived from the bone marrow which allows to reveal its clinical and prognostic significance, understand better the mechanisms of interaction between the tumor and the immune system, and serve for the development of immunotherapy programs.
Key words: pediatric oncology, bone marrow, cytotoxic T-lymphocytes, Ewing's sarcoma, rhabdomyosarcoma.
(For citation: Kolbatskaya Olga P., Gorbunova Tatiana V., Tupitsyn Nikolai N. A Study of the Amount of CD57+ Cytotoxic T-lymphocytes in Bone Marrow associated with the Development of Small Round Cell Sarcomas in Children: A Retrospective Cohort Study. Onkopediatria. 2018;5(1):32-40. Doi: 10.15690/onco.v5i1.1864)
33
в высокой степени цитотоксичные [6]. Также было показано, что экспрессия CD57 строго коррелирует с одновременной экспрессией гранзимов и пер-форина в CD8+ Т-клетках, и экспрессия этих цито-литических молекул в CD8+CD28-CD57+ Т-клетках существенно выше, чем в их CD8+CD28+CD57-предшественниках [6].
Дефекты иммунной системы костного мозга могут иметь значение уже на этапе возникновения саркомы Юинга, так как некоторые авторы доказывают в качестве источника происхождения опухоли мультипотентную мезенхимальную стволовую клетку, находящуюся в костном мозге [7]. В других исследованиях показана тесная связь лимфоцитов костного мозга и клеток костных и мягкотканных сарком [8, 9]. Отечественные авторы ранее показали, что клетки естественной резистентности костного мозга приводят к редукции имеющихся метастазов сарком и предотвращают появление новых [10, 11].
Среди литературных источников мало работ, посвященных изучению иммунной системы костного мозга в педиатрической практике при развитии злокачественных заболеваний. Так, P. Yotnda и соавт. на примере пре-В острого лимфобласт-ного лейкоза у больных в возрасте от 2 до 11 лет показали, что существующий in vivo специфический иммунный ответ не подавляет лейкемиче-ский клон, так как Т-клеточный иммунный ответ с участием Т-хелперов и ЦТЛ был ингибирован на многих уровнях, что в целом объясняет его неэффективность [12]. Но в настоящее время нет систематизированных данных о показателях иммунной системы костного мозга детей в норме, о количественных и качественных особенностях иммунной системы костного мозга пациентов данной возрастной группы при развитии злокачественных неоплазий (в частности мелкокруглоклеточных сарком), их клиническом и прогностическом значении и возможности применения иммунотерапии.
Целью нашего исследования было изучить количественные особенности субпопуляционного состава CD57+ ЦТЛ костного мозга поздних стадий дифференцировки у детей в норме, а также выявить изменения их содержания при развитии мелкокруглоклеточных сарком (рабдомиосаркомы и саркомы Юинга).
МЕТОДЫ
Дизайн исследования
Проведено ретроспективное когортное исследование.
Критерии соответствия
Критерии включения:
• пациенты моложе 17 лет, у которых впервые диагностирована мелкокруглоклеточная саркома (саркома Юинга или рабдомиосаркома);
• пациенты, которым в ходе обследования выполнена пункция костного мозга.
Критерии исключения:
• пациенты, у которых при пункции костного мозга диагностировано тотальное замещение гемопоэтической ткани опухолевой;
• выбывание из наблюдения;
• отсутствие миелограммы в истории болезни;
• отсутствие информированного согласия родителей пациента на проведение пункции костного мозга;
• неинформативная миелограмма (значительная примесь периферической крови в пунктате).
Условия проведения
Исследование проведено на базе научно-исследовательских институтов клинической онкологии и детской онкологии и гематологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (Москва).
Период учета данных
Февраль 2006 - февраль 2011 г.
Описание медицинского вмешательства
Пунктат костного мозга брали под общей анестезией путем пункции задней ости подвздошной кости. Выбор анестезиологического пособия осуществлялся врачом-анестезиологом в каждом случае индивидуально в зависимости от состояния пациента, локализации опухолевого процесса и его распространенности. Пунктат, взятый в объеме не более 0,5 мл, помещали в пробирки с сухой этилендиаминтетрауксусной кислотой (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) во избежание коагуляции. Всем больным проведено морфологическое и иммунологическое (количественный анализ лимфоцитарных субпопуляций) исследование костного мозга.
Из пунктата костного мозга приготовляли морфологические препараты с последующей их окраской по Паппенгейму. Оценку количества ядросодержащих клеток пунктата проводили на гематологическом анализаторе. Иммунофенотипирование у всех пациентов осуществляли методом прямой иммунофлюоресцен-ции с использованием тройной флюоресцентной метки. Ядросодержащие клетки пунктата костного мозга выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов. Окраска лимфоцитарных популяций (трехцветная флюоресценция) проводилась с использованием широкой панели моноклональ-ных антител (табл. 1) [13].
Методы регистрации исходов
Регистрация исходов исследования осуществлялась лечащими врачами и обрабатывалась авторами этой статьи.
Этическая экспертиза
Проведение пункции костного мозга осуществлялось только с информированного согла-
34
Таблица 1. Панель моноклональных антител для изучения субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга (авторская таблица Т.В. Горбуновой [13])
Проба FITC PE PE/Cy5(PerCP) Экспрессия на клетках
1 Ig G2a IgG1 IgG1 Контроль
2 Ig G2a IgG1 CD45 Контроль
3 CD3 CD56 CD45 Т-клетки и NK-клетки
4 CD19 CD5 CD45 В-лимфоциты
5 IgG2a IgG1 CD3 Контроль в пределах Т-клеток
6 CD4 CD62L CD3 Т-хелперы, в т.ч. CD62L
7 CD8 CD38 CD3 ЦТЛ, в т.ч. CD38
8 CD8 HLA-DR CD3 ЦТЛ, в т.ч. HLA-DR+
9 CD57 CD8 CD3 ЦТЛ, в т.ч. CD57
10 CD8 CD28 CD3 ЦТЛ, в т.ч. CD28
11 TCRaP CD25 CD3 TCRaP
12 TCRyS CD2 CD3 TCRYб
Примечание. FITC (fluorescein isothiocyanate) — флюоресцеин-изотиоцианат, флюоресцентная метка на моноклональные антитела; РЕ (phycoerythrin) — фикоэритрин, флюоресцентная метка на моноклональные антитела; PE/Cy5 (PerCP) (phycoerythrin/cyanine 5) — фикоэритрин/цианин 5, флюоресцентная метка на моноклональные антитела. ЦТЛ — цитотоксические Т-лимфоциты.
35
сия родителей пациента, о чем свидетельствовал подписанный ими протокол обследования пациента в истории болезни. Пункция костного мозга являлась обязательной процедурой, поскольку ее результаты (наличие или отсутствие поражения костного мозга саркомой) влияют на определение стадии заболевания и выбор лечебной тактики. Специальные проверки протокола обследования пациентов этическим комитетом не проводились.
Статистический анализ
Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистические расчеты проведены с помощью программы SPSS 17 (IBM Corporation, США) и включали корреляционный анализ (коэффициент Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента) и точный критерий Фишера с доверительным интервалом 95%. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Объекты (участники) исследования
В исследование включены данные обследования (истории болезни) 32 больных солидными опухолями (рабдомиосаркома и саркома Юинга) и 15 пациентов, у которых исключены злокачественные неоплазии (контрольная группа). Диагноз во всех случаях верифицирован на основании результатов гистологического и иммуногистохими-ческого исследования биоптата саркомы в отделе патологической анатомии опухолей человека.
Характеристика групп больных
Рабдомиосаркома диагностирована у 16 больных, у которых при морфологическом исследова-
нии костного мозга исключено метастатическое поражение. Мальчиков и девочек было по 8 человек (по 50% соответственно) в возрасте от 1 года до 15 лет, средний возраст 6,8 года.
Группа больных саркомой Юинга включает 16 человек — 11 (68,8%) мальчиков и 5 (31,2%) девочек в возрасте от 2 до 16 лет, средний возраст 10,6 года. Классическая саркома Юинга была диагностирована у 12 (75%) больных, примитивная нейроэктодермальная опухоль — у 3 (18,8%), опухоль Аскина — у 1 (6,3%).
Характеристика группы сравнения
В данную группу включены 15 пациентов, из них 11 (73,3%) мальчиков и 4 (26,7%) девочки в возрасте от 1 года до 17 лет, медиана возраста 8,4 года. Пациенты обследовались в научно-консультативном отделении НИИ детской онкологии и гематологии в связи с наличием доброкачественных опухолей, пороков развития органов и тканей, воспалительных процессов (нозологии: ангиофиброма нижней губы, фиброзная диспла-зия, порок развития левого легкого, нейрофи-броматоз, липома, псевдотумор правой орбиты, макроорхизм, цистит, лимфангиома левого надпочечника, реактивный лимфаденит). Наличие у них злокачественных опухолей исключено по данным гистологического исследования. При изучении субпопуляций лимфоцитов пациентов контрольной группы использована та же панель антител, что и при исследовании лимфоцитов костного мозга больных саркомой (см. табл. 1). Мы использовали результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга пациентов, не имеющих злокачественных опухолей, для сопоставления
с результатами, полученными при изучении лим-фоцитарных субпопуляций больных рабдомиосар-комой и саркомой Юинга.
Основные результаты
исследования
Определены относительные и абсолютные количества CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеток в популяции лимфоцитов костного мозга больных мелкоклеточными саркомами (табл. 2, 3).
Сравнение относительных и абсолютных количеств CD3+CD57+ Т-клеток костного мозга больных саркомой Юинга и контрольной группы выявило значимое повышение процентного содержания CD57-позитивных клеток в CD3+ и CD8+ субпопуляциях костного мозга. Так, у больных саркомой Юинга отмечено более чем двукратное повышение процента CD3+CD57+ Т-клеток (38,4±6,4 против 16,9±5,6%; р=0,022) и более чем двукратное повышение процента CD8+CD57+ Т-клеток (25,8±3,7 против 11,6±5,0%; р=0,028) (табл. 4).
Сравнение абсолютного содержания CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеточных субпопуляций костного мозга контрольной группы и больных
саркомой Юинга значимых различий не выявило (р=0,640 и р=0,686 соответственно).
Сравнение относительных и абсолютных количеств CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеточных субпопуляций костного мозга больных рабдомиосар-комой и контрольной группы также не выявило значимых различий (р=0,125 и р=0,181 соответственно).
Сравнение относительных и абсолютных количеств CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеток костного мозга между двумя группами больных выявило значимые различия только в абсолютных значениях: так, у больных саркомой Юинга было выше абсолютное число CD3+CD57+ субпопуляции (4,5±0,8 против 1,2±0,3; р=0,009) и CD8+CD57+ субпопуляции (3,4±0,6 против 0,8±0,3; р=0,014) (табл. 5). Сравнение процентного содержания CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-субпопуляций костного мозга между двумя группами больных значимых различий не выявило (р=0,091 и р=0,060 соответственно).
Нежелательные явления
В ходе проведения медицинского вмешательства нежелательных явлений не отмечено.
Таблица 2. Относительные и абсолютные количества CD57+ Т-клеток в CD3+ субпопуляции лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга
36
Группы Относительные количества Абсолютные количества
тш тах М±т тш тах М±т
Контрольная 2,2 (п=11) 55,0 (п=11) 16,9±5,6 (п=11) 0,1 (п=10) 10,3 (п=10) 3,8±1,3 (п=10)
Больные рабдомиосаркомой 5,9 (п=8) 77,1 (п=8) 19,6±0,3 (п=8) 0,2 (п=7) 2,7 (п=7) 1,2±0,3 (п=7)
Больные саркомой Юинга 7,6 (п=14) 80,8 (п=14) 38,4±6,4 (п=14) 0,3 (п=13) 3) г4- тн 00 ii 4,5±0,8 (п=13)
Таблица 3. Относительные и абсолютные количества CD57+ Т-клеток в CD8+ субпопуляции лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга
Группы Относительные количества Абсолютные количества
тш тах М±т тш тах М±т
Контрольная 0 (п=10) 44,0 (п=10) 11,6±5,0 (п=10) 0 (п=9) 9,1 (п=9) 2,9±1,2 (п=9)
Больные рабдомиосаркомой 2,5 (п=7) 49 (п=7) 12,2±6,2 (п=7) 0,1 (п=6) 1,9 (п=6) 0,8±0,3 (п=6)
Больные саркомой Юинга 2,3 (п=14) 51,4 (п=14) 25,8±3,7 (п=14) 0,1 (п=13) 6,9 (п=13) 3,4±0,6 (п=13)
Таблица 4. Сравнение относительных количеств CD3+CD57+ Т-клеток костного мозга больных саркомой Юинга и контрольной группы
Субпопуляции Контрольная группа Больные саркомой Юинга P
CD3+CD57+ 16,9±5,6 (п=11) 38,4±6,4 (п=14) 0,022
CD8+CD57+ 11,6±5,0 (п=10) +1 -н 00 II 2 0,028
Таблица 5. Сравнение абсолютных количеств CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеточных субпопуляций костного мозга больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга
Субпопуляции Больные рабдомиосаркомой Больные саркомой Юинга Р
CD3+CD57+ 1,2±0,3 (n=7) 4,5±0,8 (n=13) 0,009
CD8+CD57+ 0,8±0,3 (n=6) 3,4±0,6 (n=13) 0,014
ОБСУЖДЕНИЕ
Резюме основного результата
исследования
При количественной оценке Т-клеточных субпопуляций выявлено повышение процентного и абсолютного содержания CD3+CD57+ и CD8+CD57+ ЦТЛ у больных саркомой Юинга, что отражает выраженную клоновую пролиферацию этой группы клеток-эффекторов в ответ на распознавание опухолевых антигенов саркомы Юинга и может свидетельствовать о высокой иммуногенности данного вида опухоли. У больных рабдомиосаркомой не отмечены изменения относительного и абсолютного числа CD57+ ЦТЛ в сравнении с контрольными значениями. Полученные нами результаты свидетельствуют о различной иммуногенности опухолевых клеток саркомы Юинга и рабдомиосаркомы, о возможном угнетении Т-клеточного звена иммунитета при рабдомиосаркоме.
Обсуждение основного результата
исследования
Детальная характеристика лимфоцитарных субпопуляций костного мозга при злокачественных заболеваниях у детей(например, при агрессивных саркомах) является в настоящее время актуальной задачей, решение которой может улучшить результаты лечения больных, в частности при использовании методов иммунотерапии. Сравнение количественных характеристик ЦТЛ костного мозга больных саркомами и пациентов, не имеющих злокачественных опухолей, позволит выявить степень угнетения или активации Т-клеточного звена иммунитета.
Среди современных литературных источников имеются отдельные работы, посвященные изучению интратуморальных лимфоцитов при солидных опухолях. Так, в исследованиях D. Cho и соавт. показана тесная связь лимфоцитов костного мозга и клеток костных и мягкотканных сарком [8]. В последние годы открыта важная роль TCR (T-cell receptor) Y^-лимфоцитов, натуральных киллеров и CD3+CD57+ Т-лимфоцитов в противоопухолевом иммунитете [14]. Однако среди исследовательских работ мало источников, посвященных сравнительному анализу иммунокомпетентных клеток костного мозга здоровых детей и детей, больных солидными опухолями [7].
В настоящее время влияние экспрессии CD57-маркера на противоопухолевые реакции CD4+ Т-хелперов и CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов
представляется неясным. Например, у больных раком головы и шеи была установлена прямая связь между развитием опухоли и экспансией Т-клеток поздних стадий дифференцировки, которые снизились до нормальных уровней после удаления опухоли независимо от CMV (cytomegalovirus) — статуса больного [15]. L. van den Hove и соавт. сообщили, что по сравнению со здоровыми донорами 42% больных гемобластозами до лечения имеют повышенную экспрессию CD57 на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах [16]. Избирательная экспансия CD57+ Т-клеток среди циркулирующих CD4+ Т-лимфоцитов неоднократно обнаруживалась у больных лимфомой Ходжкина [17] и хроническим лимфолейкозом [18]. Функциональный анализ показал, что эти CD4+ CD57+ Т-клетки проявляют типичный Th1 (T-helper) цитокиновый профиль при стимуляции TCR, но также сохраняют способность секретировать интерлейкин 2, что не является типичным для терминально дифференцированных CD57+ Т-клеток здоровых доноров [16]. Эти данные могут объяснить экспансию CD57+ Т-клеток в опухолевом микроокружении. Более того, цитотокси-ческая активность циркулирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток осуществлялась почти исключительно CD57+ субпопуляцией. Но, несмотря на очевидное сохранение потенциальных эффекторных функций, эти CD57+ Т-клетки не способны ингибировать рост злокачественных клеток [6].
Однако некоторые исследования ясно показали, что CD8+CD28-CD57+ Т-клетки проявляют иммуносупрессивную активность, которая опосредуется выделением растворимого, кислото-, термо- и трипсинрезистентного гликопротеина с молекулярной массой 20-30 kDa, отличного от известных цитокинов [18]. Растворимый фактор, секретируемый в культуре CD8+CD57+ Т-клетками, полученными от пациентов после транплантации костного мозга и ВИЧ-инфицированных, как было показано, ингибирует и поликлональную активацию, и цитотоксическую активность Т-клеток здоровых доноров [19]. Супернатанты от CD8+CD28-CD57+ Т-клеток больных множественной миеломой угнетали стимулированную митогеном или фито-гемагглютинином пролиферацию Т-клеток здоровых доноров [19]. Подобный эффект наблюдался у больных СПИДом и у больных после транплантации костного мозга, что наводит на мысль об увеличении иммуносупрессивной CD8+CD28-CD57+ Т-клеточной популяции и ее высокой активности при ряде патологических состояний [19].
37
В данной работе предпринята попытка оценить относительное и абсолютное содержание субпопуляций CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-клеток костного мозга больных мелкокруглоклеточными саркомами для выявления количественных изменений эффекторного звена иммунной системы, в частности числа ЦТЛ на конечной стадии диффе-ренцировки. Полученные нами результаты могут свидетельствовать о ряде изменений Т-клеточной субпопуляции лимфоцитов, вызванных воздействием пролиферирующей опухоли на центральный иммунорегуляторный орган — костный мозг. Так, у больных саркомой Юинга значимо выше процент CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т-лимфоцитов костного мозга по сравнению с результатами контрольной группы. Эти данные можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, значительной иммуноген-ностью саркомы Юинга и присутствием на анти-генпрезентирующих клетках больного повышенного количества туморассоциированных пептидов в составе главного комплекса гистосовместимо-сти. Как следствие эффективного распознавания опухолевых антигенов происходит клоновая пролиферация ЦТЛ. Во-вторых, повышением CD57-позитивных Т-лимфоцитов памяти/эффекторов, что является результатом хронической антигенной стимуляции, и накоплением антигенспецифич-ных олигоклональных Т-клеток на поздних стадиях дифференцировки. И, наконец, развитием резистентности CD57+ Т-клеток к апоптозу как одного из признаков клеточного старения [6]. Но абсолютные количества исследованных субпопуляций Т-лимфоцитов не отличались от контрольных значений, что можно объяснить подавлением лимфоцитарного ростка опухолевыми клетками, в частности развитием опухолевой «контратаки» против ЦТЛ [20]. Можно также предположить наличие цитотоксического воздействия сарком-ных клеток на Т-клетки-эффекторы аналогично тем данным, которые опубликовали R. Wu и соавт. [21]. Исследователи выявили, что трансформирующий фактор роста ß1 (transforming growth factor ß-1, TGFßl), продуцируемый многими меланома-ми, останавливал дифференцировку и снижал цитотоксическую активность и CD27+CD57-, и CD27+CD57+ субпопуляций на стадии CD27+. Следовательно, TGFßl может быть ключевым супрессором дифференцировки ЦТЛ в опухолевом микроокружении при меланоме. Возможно, что другие факторы, синтезируемые клетками данной опухоли (простагландин Е2, индолеамин-2,3-ди-оксигеназа, интерлейкин 10), или ингибирующий сигналинг через мембранный протеин программированной клеточной смерти-1 (programmed cell death-1, PD-1) также могут оказывать подобное воздействие.
Напротив, в костном мозге больных раб-домиосаркомой не отмечено повышения процентного, а также и абсолютного содержания ЦТЛ (CD3+CD57+ и CD8+CD57+ субпопуляций)
по сравнению с относительным и абсолютным содержанием этих клеток в костном мозге пациентов, не имеющих злокачественных опухолей, что может свидетельствовать о слабой иммуно-генности данного нозологического вида саркомы и меньшей пролиферации ЦТЛ, отсутствии токсического воздействия клеток рабдомиосаркомы на Т-лимфоциты. Сравнение медиан абсолютных количеств CD3+CD57+ и CD8+CD57+ субпопуляций больных рабдомиосаркомой и контрольной группы не выявило ожидаемых различий (см. табл. 2, 3). Сравнение медиан процентного содержания CD3+CD57+ и CD8+CD57+ субпопуляций костного мозга между обеими группами больных также не выявило ожидаемых различий (см. табл. 2, 3). Но все же сравнение абсолютных количеств CD3+CD57+ и CD8+CD57+ субпопуляций костного мозга больных обеих групп показало, что в случае саркомы Юинга достоверно выше содержание обеих субпопуляций, что можно объяснить большей иммуногенностью клеток саркомы Юинга, более эффективной презентацией антигена и более выраженным пролиферативным ответом при данном виде мелкокруглоклеточной саркомы.
Ограничения исследования
Данную выборку пациентов можно считать репрезентативной, так как в ней представлены значимые признаки генеральной совокупности (пациенты разного пола и национальности, все возрастные группы детей). Данные, полученные при исследовании нашей выборки, можно экстраполировать на генеральную совокупность (больных мелкокруглоклеточными саркомами детского возраста), но с некоторыми ограничениями. Так, для выявления изменения абсолютного числа CD3+CD57+ и CD8+CD57+ ЦТЛ в костном мозге больных рабдомиосаркомой по сравнению с контролем необходимо исследовать большее количество пациентов. Аналогично сравнение процентов субпопуляций ЦТЛ (CD3+CD57+ и CD8+CD57+) между двумя нозологическими группами мелко-круглоклеточных сарком (рабдомиосаркома и саркома Юинга) также необходимо перепроверить на большем числе клинических примеров. Для решения вопроса о применимости полученных нами данных для всех больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга в Российской Федерации необходим углубленный анализ большей группы пациентов с учетом всех факторов прогноза заболевания (гистологический вариант и размер опухоли, ее первичная локализация, наличие регионарных и отдаленных метастазов, возраст пациента, местное распространение опухоли и инфильтрация соседних органов и тканей, ответ на химиолучевое лечение).
В ходе нашей работы была обеспечена точность фиксации данных на основании вторичных источников (историй болезни): данные полностью соответствовали задачам исследования
38
и являлись достоверными. Пропущенных данных, т.е. выбывших (утерянных из наблюдения) больных, отсутствия в миелограммах и иммуно-граммах части изучаемых параметров и т.п. не отмечено. Все пациенты прослежены от момента начала обследования и до начала лечения, что вполне достаточно для сбора данных, положенных в основу нашей работы. В последующем все пациенты наблюдались до возраста 18 лет (до момента перевода во взрослую клинику). С учетом медианы возраста среди пациентов 8,6 года, срок наблюдения составлял не менее 5 лет, что считается достаточным для оценки общей и бессобытийной выживаемости.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании проведенного нами комплексного морфологического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) исследования у больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга установлено, что на этапе диагностики данные злокачественные заболевания характеризуются специфическими для каждой нозологической
формы изменениями количества костномозговых ЦТЛ на поздних стадиях дифференцировки. Наши результаты, возможно, позволят в будущих работах выявить их клиническое и прогностическое значение, лучше понять механизмы взаимодействия злокачественной неоплазии и иммунной системы пациента, будут способствовать разработке новых методов лечения мелкокруглоклеточ-ных сарком, в частности программ иммунотерапии, и в целом — улучшению результатов лечения и общей выживаемости больных.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование выполнено за счет средств федерального бюджета в рамках государственного задания (тема НИР «Субпопуляции лимфоцитов костного мозга при гемобластозах и солидных опухолях», 2012-2016 гг.).
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
39
ЛИТЕРАТУРА
1. Weiss AR, Lyden ER, Anderson JR, et al. Histologic and clinical characteristics can guide staging evaluations for children and adolescents with rhabdomyosarcoma: a report from the Children's Oncology Group Soft Tissue Sarcoma Committee. J Clin Oncol. 2013;31(26):3226-3232. doi: 10.1200/ Jco.2012.44.6476.
2. Pappo AS, Dirksen U. Rhabdomyosarcoma, Ewing sarcoma, and other round cell sarcomas. J Clin Oncol. 2018;36(2):168-179. doi: 10.1200/ Jco.2017.74.7402.
3. Zhao ED, Xu HB, Wang L, et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell MolImmunol. 2012;9(1):11-19. doi: 10.1038/cmi.2011.47.
4. Ярилин А.А. Иммунология. — М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010. — 752 с. [Yarilin AA. Immunologiya. Moscow: GEOTAR-Media; 2010. 752 p. (In Russ).]
5. Feuerer M, Beckhove P, Garbi N, et al. Bone marrow as a priming site for T-cell responses to blood-borne antigen. Nat Med. 2003;9(9):1151-1157. doi: 10.1038/nm914.
6. Strioga M, Pasukoniene V, Characiejus D. CD8(+) CD28(-) and CD8(+) CD57(+) T cells and their role in health and disease. Immunology. 2011;134(1):17-32. doi: 10.1111/j.1365-2567.2011.03470.x.
7. Madhumathi DS, Premalata CS, Devi VL, et al. Bone marrow involvement at presentation in pediatric non-haematological small round cell tumours. Indian J Pathol Microbiol. 2007;50(4):886-889.
8. Cho D, Shook DR, Shimasaki N, et al. Cytotoxicity of activated natural killer cells against pediatric solid tumors. Clin Cancer Res. 2010;16(15):3901-3909. doi: 10.1158/1078-0432.Ccr-10-0735.
9. Fan Z, Yu P, Wang Y, et al. NK-cell activation by LIGT triggers tumour-specific CD8+ T-cell immunity to reject established tumours. Blood. 2006;107(4):1342-1351. doi: 10.1182/blood-2005-08-3485.
10. Дейчман Г.И., Кашкина Л.М., Ключарева Т.Е., и др. Влияние клеток костного мозга, селезенки и перитонеального экссудата на метастазирова-ние опухолевых клеток в легкие сибирских хомячков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 1982. — Т.94. — №10 — С. 102105. [Deichman GI, Kashkina LM, Klyuchareva TE, et al. Vliyanie kletok kostnogo mozga, selezenki i peritoneal'nogo ekssudata na metastazirovanie opukholevykh kletok v legkie sibirskikh khomyachkov. Biull Eksp Biol Med. 1982;94(10):102-105. (In Russ).]
11. Трапезников Н.Н, Тупицын Н.Н., Барышников А.Ю., и др. Иммунопатогенетические аспекты саркомы Юинга // Вестник онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук. — 1998. — Т.9. — №1 — С. 41-50. [Trapeznikov NN, Tupitsyn NN, Baryshnikov AYu, et al. Immunopathogenic aspects of Ewing sarcoma. Journal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS. 1998;9(1):41-50. (In Russ).]
12. Yotnda P, Mintz P, Grigoriadou K, et al. Analysis of T-cell defects in the specific immune response against acute lymphoblastic leukemia cells. Exp Hematol. 1999;27(9):1375-1383. doi: 10.1016/ S0301-472X(99)00083-1.
13. Горбунова Т.В. Клиническое значение исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга при
саркомах у детей: Дис. ... канд. мед. наук. — М.; 2013. [Gorbunova TV. Klinicheskoe znachenie issle-dovaniya subpopulyatsii limfotsitov kostnogo mozga pri sarkomakh u detei. [dissertation] Moscow; 2013. (In Russ).]
14. Caccamo N, Dieli F, Meraviglia S, et al. Gammadelta T cell modulation in anticancer treatment. Curr Cancer Drug Targets. 2010;10(1):27-36. doi: 10.2174/156800910790980188.
15. Tsukishiro T, Donnenberg AD, Whiteside TL. Rapid turnover of the CD8(+)CD28(-) T-cell subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer. Cancer Immunol Immunother. 2003;52(10):599-607. doi: 10.1007/s00262-003-0395-6.
16. Van den Hove LE, Van Gool SW, Vandenberghe R et al. CD57+/CD28- T cells in untreated hemato-oncological patients are expanded and display a Th1-type cytokine secretion profile, ex vivo cytolytic activity and enhanced tendency to apoptosis. Leukemia. 1998;12(10):1573-1582. doi: 10.1038/ sj.leu.2401146.
17. Atayar C, van den Berg A, Blokzijl T, et al. Hodgkin's lymphoma associated T-cells exhibit a transcription factor profile consistent with distinct lymphoid compartments. J Clin Pathol. 2007;60(10):1092-1097. doi: 10.1136/jcp.2006.044222.
18. Serrano D, Monteiro J, Allen SL, et al. Clonal expansion within the CD4(+)CD57(+) and CD8(+)CD57(+) T cell subsets in chronic lymphocytic leukemia. J Immunol. 1997;158(3):1482-1489.
19. Frassanito MA, Silvestris F, Cafforio P, Dammacco F. CD8(+)/CD57(+) cells and apoptosis suppress T-cell functions in multiple myeloma. Br J Haematol. 1998;100(3):469-477. doi: 10.1046/j.1365-2141.1998.00589.x.
20. Igney FH, Krammer PH. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack. J Leukoc Biol. 2002;71(6):907-920. doi: 10.1189/ jlb.71.6.907.
21. Wu RC, Hwu P, Radvanyi LG. New insights on the role of CD8(+)CD57(+) T-cells in cancer. Oncoimmunology. 2012;1(6):954-956. doi: 10.4161/onci.20307.
40
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Колбацкая Ольга Павловна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: +7 (499) 324-45-60,
e-mail: [email protected], SPIN-код: 2709-2488, ORCID: http://orcid.org/0000-0001-8493-9012
Горбунова Татьяна Викторовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник отделения опухолей головы и шеи НИИ ДОиГ ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, e-mail: [email protected], SPIN-код: 9740-368, ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5805-726X
Тупицын Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, e-mail: [email protected], ORCID: http://orcid.org/0000-0003-3966-128X
