CC BY
7
Научная смена
Вестник ДВО РАН. 2018. № 6
Хомченкова Анастасия Сергеевна
Выпускница биологического факультета Челябинского государственного университета (специальность - «Микробиология»). С 2015 г. работает в Научно-исследовательском геотехнологическом центре ДВО РАН в должности младшего научного сотрудника научно-исследовательского отдела. В 2016 г. поступила в аспирантуру НИГТЦ по направлению «Науки о Земле». Под руководством д.г.-м.н., проф. Ю.П. Трухина проводит исследования влияния тяжелых металлов на сообщества ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. По теме исследования опубликовано 4 работы. Является заместителем председателя Совета молодых ученых НИГТЦ ДВО РАН.
DOI: 10.25808/08697698.2018.202.6.017 А.С. ХОМЧЕНКОВА
Окислительная активность культуры ацидофильных хемолитотрофов, адаптированных к высокой концентрации никеля
Проведена адаптация смешанной культуры ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов к высоким концентрациям ионов никеля в питательной среде (12, 14, 16, 18, 20 г/л). Рост клеток культуры сохранялся во всех вариантах концентраций Ni. Для исследования окислительной активности выбрана культура, адаптированная к 20 г/л ионов никеля. Скорость окисления железа адаптированной культурой была приблизительно в 2 раза выше, чем контрольной.
Ключевые слова: хемолитотрофные микроорганизмы, никель, окисление железа, устойчивость, бактериально-химическое выщелачивание, сульфидные руды.
The oxidation activity of acidophilic chemolithotrophic culture, adapted to a high nickel concentration.
A.S. KHOMCHENKOVA (Scientific Research Geotechnological Center, FEB RAS, Petropavlovsk-Kamchatsky).
The acidophilic chemolithotrophic microorganisms mixed culture s adaptation to high concentrations of nickel ions in nutrient medium (12, 14, 16, 18, 20 g/l) was carried out. A culture cell's growth was saved with all concentration variants. Culture adapted to 20 g/l Ni ions was chosen to research oxidizing activity. The ferrous oxidation rate with adapted culture was about twice as high than the control one.
Key words: chemolithotrophic microorganisms, nickel, ferrous oxidation, resistance, bacterial-chemical leaching, sulphide ores.
ХОМЧЕНКОВА Анастасия Сергеевна - аспирант, младший научный сотрудник (Научно-исследовательский геотехнологический центр ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский). E-mail: bioleaching@yandex.ru
Бактериально-химическое выщелачивание (БХВ) обладает рядом преимуществ по сравнению с другими, не биогеотехнологичными, методами переработки сульфидного минерального сырья [4]. Своими выгодными для промышленности характеристиками -например, такими, как экологическая безопасность (за счет малого количества отходов), финансовая экономичность (за счет простой организации процесса), - БХВ сульфидных руд обязано участию ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, а именно их окислительной активности.
Сочетание биологического (прямого) и химического (косвенного) пути окисления сульфидных минералов - основа БХВ. Для биологического пути характерен контакт клеток микроорганизмов и поверхности минерала (преимущественно в дефектных участках кристаллической решетки); процесс проходит в несколько стадий при участии ферментов.
Схема реакции:
4FeS2 + 1502 + 2Н20 + микроорганизмы ^ 2Fe2(SO4)з + 2Н^ 04. (1)
Химический путь реализуется за счет выработки окислителя клетками микроорганизмов. Пример реакции, протекающей в кислых растворах; здесь окислителем является Fe3+:
MeS + Fe2(SO4)3 ^ MeSO4 + 2FeSO4 + S0, (2)
п т 2Ч 4'3 4 4 ' 4 '
где Ме^т - сульфид металла [2].
Природные сообщества микроорганизмов рудных месторождений, в том числе био-технологически важные роды (AcidithiobacШus, LeptospirШum, Sulfolobus, SulfobacШus, Acidianus), приспособились к повышенным содержаниям тяжелых металлов (например, никель, медь, кобальт). Их клетки обладают одним или сразу несколькими механизмами устойчивости: внеклеточный барьер; активный транспорт ионов металлов из клетки (эффлюкс); внеклеточная секвестрация; внутриклеточная секвестрация; восстановление ионов металлов [8]. Однако подавляющие концентрации способны привести к резкому снижению биопотенциала сообщества микроорганизмов [3]. В условиях чанового БХВ концентрации тяжелых металлов могут значительно превышать природные и ингибиро-вать жизнедеятельность клеток, т.е. угнетать их рост и снижать окислительную активность [7].
Для создания эффективного микробного сообщества - участника технологии БХВ необходимо изучать пределы толерантности ацидофильных хемолитотрофов к тяжелым металлам, их окислительную активность в присутствии тяжелых металлов в среде культивирования.
В данной статье описан эксперимент, задачами которого являлись: адаптация сообщества микроорганизмов окисленной сульфидной кобальт-медно-никелевой руды (в составе культуры идентифицированы AcidithiobacШusferrooxidans, SulfobacШus spp.) к высоким концентрациям ионов никеля (12, 14, 16, 18, 20 г/л №) в питательной среде 9К с железом; исследование окислительной активности уже адаптированной культуры в отношении Fe2+.
Способность окислять железо является главным полезным для человека фактором биологической активности ацидофильных хемолитотрофов. Культура микроорганизмов, не утратившая такой способности в процессе адаптации к высоким содержаниям токсичных металлов в культуральной среде в условиях лаборатории, более перспективна как биокомпонент БХВ в промышленных условиях.
Материалы и методы
В эксперименте использована смешанная культура мезофильных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, предварительно культивированная на среде 9К. По данным ПЦР-диагностики НИГТЦ ДВО РАН (2009 г.) в составе культуры
идентифицированы AcidithiobacШus ferrooxidans, SulfobaciПus spp. - качественный анализ. Источник культуры: окисленная руда месторождения Шануч, Камчатский край* [5].
Количественный учет клеток (всей культуры) проводили прямым подсчетом под микроскопом в 10 полях зрения. Количество клеток в 1 мл среды рассчитывали по формуле
X = N • 7,56 • 106, (3)
где X - число клеток в 1 мл, N - среднее арифметическое число в т полях зрения, 7,56 • 106 - коэффициент, рассчитанный с учетом объема анализируемой пробы (2 мкл), площади покровного стекла (576 мм2) и площади поля зрения (0,0132 мм2).
Данный метод учета количества клеток выбран ввиду его доступности. Метод не позволяет визуально различить клетки АМШюЬасШтferrooxidans и SulfobacШus spp.; поле зрения микроскопа заполняли морфологически идентичные подвижные одиночные полупрозрачные палочки. Подсчет клеток каждого отдельного вида, составляющего культуру, не проводили, так как для данного эксперимента численность видов и их соотношение не имели значения.
Окислительную активность культуры исследовали путем определения концентраций Fe2+ и Fe3+ в растворах питательной среды 9К (где изначальная концентрация Fe2+ была равна 9 г/л) методом трилонометрического титрования трилоном Б (стандарт-титр ТУ 2642-001-23164744-2016). Методика определения Fe3+: в коническую колбу объемом 100 мл приливали 30 мл индикаторного раствора (смесь 20%-й сульфосалициловой кислоты и 20%-й соляной кислоты в дистиллированной воде) и вносили 1 мл анализируемой среды; нагревали до 70 °С на плитке и титровали раствором трилона Б до перехода окраски из красно-фиолетовой в лимонно-желтую. В конце титрования, после добавления одной избыточной капли, раствор становился бесцветным (1 капля = 0,015 мл). Концентрацию Fe3+ (г/л) вычисляли по формуле
С-е3+ = (V™ • (0,°25 • 55,84) • 1000) : ^о6ы ,
где УТБ - количество израсходованного на титрование раствора трилона Б, мл; 0,025 -молярность трилона Б; 55,84 - атомная масса Fe.
Методика определения Fe2+: раствор, в котором оттитровано трехвалентное железо, вновь нагревали до 70 °С, добавляли 50 мг пероксодисульфата аммония (надсернокислого аммония), кипятили в течение 1 мин. Раствор изменял окраску на красно-фиолетовую, после чего его вновь титровали раствором трилона Б до перехода окраски в лимонно-жел-тую. В конце титрования после добавления одной избыточной капли раствор становился бесцветным. Добавляли несколько кристаллов надсернокислого аммония для проверки полноты окисления (стабильность окраски). Концентрацию Fe2+ вычисляли по той же формуле, что и концентрацию Fe3+.
Адаптация к высоким концентрациям ионов никеля
Для создания условий высоких концентраций ионов никеля использовали питательную минеральную основу 9К с FeSO4 • 7Н20 (концентрация Fe2+ = 9 г/л) [1] с добавлением NiSO4 • 7Н20. Был получен ряд концентраций: 12, 14, 16, 18, 20 г/л №. В раннем эксперименте [6] использовались более низкие концентрации металлов, чем в описываемом, при этом культура сохраняла рост, но окислительная активность в отношении Fe2+ не была исследована. В данном же эксперименте решено было исследовать окислительную активность культуры в условиях экстремально высоких концентраций №.
* Отчет о научно-исследовательской работе по теме (проекту) № 0283-2016-0002 Исследование бактериально-химических процессов и создание основ геобиотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд и концентратов с получением конечных продуктов, приложение, паспорт культуры микроорганизмов № 1 (НИГТЦ ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский, 2017 г.).
В колбы Эрленмейера объемом 250 мл, где была питательная среда (с) с указанными выше концентрациями ионов никеля, произвели посев культуры (к) (Ы = 1,2 • 108 кл./мл - общая численность клеток культуры, соотношение AcidithiobacШus ferrooxidans и SulfobacШus spp. установлено не было) в соотношении к : с = 1 : 10 (10 мл культуры и 100 мл среды). В том же соотношении культура была внесена в контрольную колбу (К), где содержалась «чистая» (без ионов никеля) 9К; рН всех сред - 1,6, наиболее благоприятный для роста исследуемой смешанной культуры, достигался путем добавления 10 Н серной кислоты в состав питательной среды 9К.
Для активизации процесса роста клеток культуры в первые 5 сут адаптируемые образцы культивировали в термостате (29 °С), для аэрации среды колбы были помещены на качалку (~ 110 об/мин). Затем в течение 10 сут культивировали статично (без перемешивания) при комнатной температуре. В течение всего периода культивирования рН в образцах сохранялся на уровне 1,6-1,8.
Окислительная активность культуры в отношении Fe2+
Для исследования окислительной активности был выбран образец культуры, адаптированный к 20 г/л ионов никеля. На момент окончания адаптации и пересева культуры в «чистую» питательную среду 9К количество клеток в ней составляло 5,6 • 107 кл./ мл (общая численность клеток культуры). Источник железа в среде - FeSO4 • 7Н20 (концентрация Fe2+ = 9 г/л). В колбы Эрленмейера объемом 250 мл произвели посев в соотношении к : с = 1 : 10 (10 мл культуры и 100 мл среды) в трех повторениях (№ I, № II, № III - шифры адаптированных образцов).
Культивировали в течение 7 сут в термостате (29 °С), аэрацию среды осуществляли перемешиванием на качалке (~ 110 об/мин) в 0-3-и, 6-7-е сутки эксперимента.
Результаты и обсуждение
Адаптация к высоким концентрациям ионов никеля
Ни одна из указанных концентраций ионов № не привела к угнетению окислительной активности исследуемой культуры в отношении Fe2+ - главной ее биологической активности, что подтверждает наличие природных механизмов резистентности у микроорганизмов-представителей.
Рост клеток культуры в период адаптации к высоким концентрациям ионов никеля в питательной среде ингиби-ровался только в первые сутки культивирования, это видно из сравнения с контрольным образцом (табл. 1). Уже к третьим суткам численность клеток в адаптируемых образцах превосходила численность в контрольном образце.
Для дальнейшего хода исследования (наблюдения за окислительной активностью в отношении Fe2+) был выбран образец культуры, адаптированный к 20 г/л ионов №, как устойчивый к самой высокой заявленной концентрации.
Таблица 1
Численность клеток культуры в период адаптации к высоким концентрациям ионов никеля в питательной среде
Концентрация Кол- во клеток, •107 кл./мл
ионов N1, г/л 1-е сутки | 3-и сутки | 10-е сутки
К (0) 2,1 4,2 4,8
12 1,0 5,0 6,1
14 1,4 4,6 6,4
16 0,8 5,0 5,9
18 0,8 7,9 7,3
20 0,4 3,1 5,6
Окислительная активность культуры
Рост адаптированной культуры в «чистой» (без ионов никеля) питательной среде происходил медленнее, чем рост клеток в контроле, однако к третьим суткам эксперимента численность клеток превышала контрольные показатели более чем в 2 раза. В последующие сутки количество клеток адаптированной культуры оставалось почти постоянным, в контроле повышалось (табл. 2).
Результаты измерений концентраций Fe3+ и Fe2+ представлены в табл. 3 и на рис. 1 и 2 соответственно. Можно видеть, что адаптированная культура окисляет железо интенсивнее, чем контрольная, - вероятно, это связано с более быстрым ростом численности клеток первой (вторые-третьи сутки эксперимента). Однако даже при сохранении численности клеток примерно на одном уровне в третьи-седьмые сутки эксперимента окисление железа адаптированной культурой
_
1 1
и.
№11
— Ы1III
-
■
Рис. 1. Изменения концентрации Бе3+ в питательной среде с адаптированной культурой в сравнении с контролем. Здесь и на рис. 2 по оси абсцисс - продолжительность эксперимента, сут
9 —*—№II
—
8 7
6 \ \
5
ь, 3
-1-1- \
1 "4--
Рис. 2. Изменения концентрации Бе2+ в питательной среде с адаптированной культурой в сравнении с контролем
Таблица 2
Численность клеток адаптированной культуры в «чистой» питательной среде
Сутки Кол-во клеток, -107 кл./мл
К № I № II № III
1 0,68 0,27 0,3 0,3
2 0,50 0,45 0,45 0,45
3 0,84 2,49 2,65 2,73
6 1,74 2,74 2,58 2,81
7 4,02 2,65 2,71 2,27
протекает быстрее, нежели контрольной, в которой количество клеток постоянно возрастало. Необходимо отметить, что почти все железо питательного раствора ^е2+) было окислено (до Fe3+) адаптированной культурой и контрольным образцом к седьмым суткам эксперимента.
Таблица 3
Изменения концентраций Fe3+ и Fe2+ в «чистой» питательной среде с адаптированной культурой в сравнении с контролем
Сутки Концентрация Fe3+, г/л Концентрация Fe2+, г/л
К Ni I Ni II Ni III К Ni I Ni II Ni III
1 0,7 0,7 0,7 0,8 8,1 8,5 8,5 8,2
2 1,25 2,51 2,65 2,23 7,4 6,98 6,56 6,84
3 2,37 2,37 5,72 7,54 6,56 2,8 3,49 1,81
6 3,9 3,9 8,09 8,52 5,58 1,26 1,54 0,56
7 8,93 8,93 9,63 8,79 0,28 0 0 0
Заключение
Результаты эксперимента позволяют сделать вывод о том, что исследованная культура мезофильных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов способна адаптироваться к высоким концентрациям ионов никеля в питательной среде и оставаться биологически активной. Клетки культуры имеют природные механизмы резистентности к воздействию тяжелых металлов. Окислительная активность культуры не была утрачена или ослаблена в период адаптации, напротив, такая культура интенсивно окисляла Fe2+.
Представляются интересными дальнейшие исследования, связанные с определением биотехнологического потенциала адаптированной культуры (использование культуры в качестве биологического компонента чанового БХВ).
ЛИТЕРАТУРА
1. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А., Грудев С., Авакян З.А. Биогеотехнология металлов: практическое руководство. М., 1989. 375 с.
2. Кузякина Т.И., Хайнасова Т.С., Левенец О.О. Биотехнология извлечения металлов из сульфидных руд // Вестн. Камчатской региональной ассоциации «Учебно-научный центр». 2008. № 2, вып. 12. С. 76-86.
3. Сизенцов А.Н., Нугаманова Э.М., Пешков С.А. Влияние тяжелых металлов на рост пробиотических штаммов E. coli М-17, E. faecium, L. acidophilus, L. bulgaricus LB-51 и бактерии рода Bacillus в условиях in vitro // Вестн. ОГУ. 2011. № 12 (131). С. 358-360.
4. Хайнасова Т.С., Левенец О.О. Бактериально-химическое выщелачивание как экологически безопасный способ переработки сульфидной кобальт-медно-никелевой руды // Разведка и охрана недр: науч.-техн. журн. (ФГУП ВИМС). 2015. № 1. С. 49-54.
5. Хайнасова Т.С., Рогатых С.В., Кузякина Т.И., Корнилова Т.И. Окисленная руда как источник выделения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов для биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд // Горный информ.-аналит. бюл. 2013. № 10. С. 135-138.
6. Хомченкова А.С. Совокупное воздействие никеля и кобальта на рост культуры ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов // Горный информ.-аналит. бюл. Спец. выпуск № 32 «Камчатка-5». М.: Горная книга, 2017. № 12. С. 222-227.
7. Хомченкова А.С. Тяжелые металлы и выщелачивающие микроорганизмы (обзор) // Горный информ.-аналит. бюл. Спец. выпуск № 32 «Камчатка-5». М.: Горная книга, 2017. № 12. С. 228-236.
8. Янева О.Д. Механизмы устойчивости бактерий к ионам тяжелых металлов // Микробиол. журн. 2009. Т. 71, № 6. С. 54-65.
