CC BY
26
УДК 579.66:66.061.34
DOI: 10.24411/1728-323X-2018-14017
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОВЫЩЕЛАЧИВАНИЯ СУЛЬФИДНОЙ КОБАЛЬТ-МЕДНО-НИКЕЛЕВОЙ РУДЫ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ РАЗЛИЧНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ АБОРИГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Т. С. Хайнасова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук (НИГТЦ ДВО РАН), khainasova@yandex.ru, Петропавловск-Камчатский, Россия
Поиск и определение окислительной активности ацидофильных хемоли-тотрофных микроорганизмов, принимающих участие в окислении ионов двухвалентного железа и восстановленных соединений серы, имеет прикладное значение для развития биогеотехнологических способов переработки сульфидных руд. В настоящей работе приведены результаты биовыщелачивания сульфидной кобальт-медно-никелевой руды месторождения Шануч (Камчатский край) аборигенными сообществами микроорганизмов, выделенными из различных по степени окисленности руд. Проведена их идентификация с помощью метагеномного секвенирования. На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей по фрагменту 16S рРНК с таковыми из базы данных RDP было установлено, что микробное разнообразие используемых культур представлено бактериями родов Acidithiobacillus, Sulfobacillus, Leptospirillum, Acidisphaera, Ferrimicrobium, Effusibacillus и Acidi-ferrobacter. Культуры показали неодинаковую способность к биовыщелачиванию, проявляя выраженную железоокисляющую и сульфидокисляющую активности. Интенсивное окисление было отмечено у трех образцов: № 6, № 35, №49. Максимальные степени извлечения целевых металлов (никеля и кобальта) наблюдали при использовании культуры № 35, которая характеризовалась наличием представителей одного рода — Acidithiobacillus spp., продолжительным периодом адаптации микроорганизмов, более низкой интенсивностью окисления ионов двухвалентного железа.
The search and determination of the oxidative activity of acidophilic chem-olithotrophic microorganisms taking place in the oxidation of ferrous ions and reduced sulfur compounds is of practical importance for the development of biogeo-technological methods for processing sulphide ores. The paper presents the results of bioleaching of sulphide cobalt-copper-nickel ore from the Shanuch deposit (Kamchatka Krai) by indegenous communities of microorganisms isolated from ores characterized by varying degrees of oxidation.
Their identification was carried out by means of metagenomic sequencing. Based on a comparative analysis of the nucleotide sequences for the fragment of 16S rRNA with those from the RDP database it was established that the microbial diversity of the cultures is represented by the bacteria of the genera Acidithiobacillus, Sulfobacillus, Leptospirillum, Acidisphaera, Ferrimicrobium, Effusibacillus and Acidiferrobacter.
The cultures showed an unequal ability to bioleach showing a pronounced iron-oxidizing and sulphide-oxidizing activity. Intensive oxidation was observed in three samples: No. 6, No. 35, No. 49. The maximum extraction rates of the target metals (nickel and cobalt) were observed using culture No. 35 which was characterized by the presence of representatives of one genus — Acidithiobacillus spp., а long period of adaptation of microorganisms, lower oxidation rate of ferrous ions.
Ключевые слова: аборигенные микроорганизмы, мезофильные и умеренно термофильные ацидофильные хемолитотрофы, окислительная активность, биовыщелачивание, сульфидные минералы, кобальт-медно-никелевая руда, месторождение Шануч.
Keywords: indegenous microorganisms, mesophilic and moderately thermo-philic acidophilic chemolithotrops, oxidative activity, bioleaching, sulphide minerals, cobalt-copper-nickel ore, the Shanuch deposit.
Введение. Изучение биоразнообразия и экологии ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов имеет важное значение при создании биогеотехнологических способов переработки руд. Последние принадлежат к технологиям, обеспечивающим рациональное, комплексное и экологически чистое недропользование [1—7]. Выделенные из природных местообитаний культуры бактерий и архей характеризуются штаммовой вариабельностью, что может обусловливать их различную способность окислять минеральный субстрат. В связи с этим скрининг микробных культур на предмет их предварительной окислительной активности позволяет осуществлять отбор наиболее перспективных представителей микрофлоры.
Цель настоящего исследования состояла в идентификации и определении способности аборигенных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов руд сульфидного мед-но-никелевого месторождения Шануч (Камчатский край) к биовыщелачиванию.
Материалы и методы. Микробные культуры. В работе были использованы накопительные культуры (табл. 1), выделенные из различных по степени окисленнности образцов руды сульфидного кобальт-медно-никелево-го месторождения Шануч (табл. 2). Культивирование ацидофильных хемолитотрофов осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при соотношении образца руды к питательной среде 1:8 (15 г руды и 120 мл среды). В качестве питательных сред использовали: а) минеральную основу среды Силь-вермана и Люндгрена (9К) с добавлением солей двухвалентного железа (Бе804 -7^0) из расчета 6 г/л Бе, пентагидрата тиосульфата натрия (Na2S20з -5^0) из расчета
Таблица 1 Перечень культур микроорганизмов и условия их культивирования
№ № культуры Условия культивирования микроорганизмов (питательная среда + образец руды)
1. 5 мин. основа 9К + Fe(6 г/л) + Na2S2Ö3 (3 г/л) + дрожжевой экстракт 2 % + руда № 3047
2. 6 мин. основа 9К + Fe(6 г/л) + Na2S2Ö3 (3 г/л) + дрожжевой экстракт 2 % + руда № 3046
3. 35 DSM 882 + руда № 3041-2
4. 36 DSM 882 + руда № 3046
5. 49 DSM 71 + руда № 3046
Таблица 2 Химический анализ проб руды месторождения Шануч
3 г/л Na2S2Ö3 и дрожжевого экстракта 2 %-го; б) DSM 71; в) DSM 882. Культивирование проводили стационарно при температуре 20—22 °С в течение двух месяцев.
Молекулярно-биологические исследования. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью метагеномного анализа. Все его этапы (выделение ДНК, приготовление ДНК-библиотек из анализируемых образцов, высокопроизводительное секвенирование, биоинформатическая обработка данных) были проведены Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Институтом клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (ЦКП «Персистенция микроорганизмов»). Выделение ДНК производилось при помощи ферментативного анализа совместно с механической гомогенезацией. ДНК-библиотеки были созданы по протоколу Illumina с праймера-ми к вариабельному участку гена 16S рРНК 16SF и 16SR. ПЦР амплификация фрагментов ДНК проводилась в следующем режиме: 95 °С (3 мин), 25 циклов (95 °С — 30 с, 56 °С — 30 с, 72 °С — 30 с), 72 °С (5 мин). Секвенирование осуществлялось с помощью системы для автоматического сек-венирования марки MiSeq (Illumina Inc. (США)). Полученные сиквенсы фрагментов 16S рРНК были сопоставлены с нуклеотидными последовательностями базы данных RDP.
Руда. В ходе биовыщелачивания использовали просеянную сульфидную руду кобальт-медно-ни-келевого месторождения Шануч, состоящую на 60 % из рудных (пирротин, пентландит, халькопирит, пирит) и на 40 % из нерудных минералов. Степень измельчения составляла ~ 100 мкм. Процентное содержание металлов: Ni = 4,60 ± 0,46 %, Cu = 0,60 ± 0,08 %, Co = 0,11 ± 0,02 %, Fe2O3 = = 33,12 ± 1,99 %.
Биовыщелачивание. Биовыщелачивание проводили в периодическом режиме в колбах Эрлен-мейера объемом 250 мл. В состав жидкой фазы входили 120 мл раствора минеральных солей 9К (без FeSO4 -7^0) и 30 мл соответствующей культуры микроорганизмов. Твердая фаза — 7,5 г руды (4,96 % тв.). Отношение Т:Ж — 1:20. Начальное значение рН раствора минеральных солей составляло 1,85. Подкисление пульпы не производили с целью определения сероокисляющей способности микроорганизмов. Температурный режим — 25 °С. Перемешивание пульпы производили со скоростью вращения 147 об/мин на качалке. Продолжительность эксперимента составляла 15 суток. рН и Eh определяли портативным мультимонитором «Kelilong PH-099-KL» (Kelilong Electron Co., Ltd, Китай), количество клеток — прямым подсчетом в микроскопе с фазово-конт-растной насадкой «Микромед 3 вар. 3-20» (Мик-ромед, Китай). Измерение концентрации железа в жидкой фазе пульпы осуществляли методом ком-плексонометрического титрования трилоном Б, остальные металлы (Ni, Cu, Co) — атомно-аб-сорбционным методом на атомно-абсорбционном спектрофотометре Shimadzu АА-6300 (Shimadzu, Япония).
Результаты и обсуждение. Результаты 16S рРНК метагеномного секвенирования обнаружили, что состав анализируемых сообществ был пред ставлен, в основном, бактериями. Большая их часть относилась к некультивируемым видам. Отмечено присутствие как широко известных и традиционно используемых в бактериально-химических технологиях переработки руд хемолито-трофных ацидофильных микроорганизмов (Aci-dithiobacillus spp., Sulfobacillus spp., Leptospirillum spp.), так и выделяемых из экстремально кислых природных местообитаний, кислых шахтных вод месторождений и ряда других природных объектов представителей микрофлоры (Acidisphaera spp., Ferrimicrobium sp., Effusibacillus spp., Acidiferro-bacter sp.), роль которых в технологиях биовыщелачивания менее известна [8—10]. В таблице 3 приведены сведения о доминирующем родовом разнообразии аборигенных сообществ микроорганизмов и их количественном выражении в ре-
№ № пробы Ni, % Cu, % Co, % Fe2O3, %
1. 3041-2 3,22 0,88 0,087 28,1
2. 3046 3,43 0,47 0,09 25,2
3. 3047 0,06 0,02 0,01 3,90
зультате сравнения нуклеотидных последовательностей по фрагменту 168 рРНК с таковыми, представленными в базе данных КОР, с достоверностью совпадения >95 %.
Оценка эффективности биовыщелачивания производилась по приросту численности клеток и способности к окислению субстрата. Последнее регистрировали на основании изменения БИ, рН, концентраций двухвалентного и трехвалентного железа, а также степени извлечения никеля, меди и кобальта, переходящих в растворенное состояние в результате разрушения основных слагающих руду сульфидных минералов. Общие сведения о некоторых из параметров биовыщелачивания приведены в таблице 4.
Таблица 3 Родовой состав микробных культур
№ Культура Родовой состав, %*
1. № 5 Sulfobacillus spp. — 48,69 %, Leptospirillum spp. — 37,13 %, Acidisphaera sp. — 14,18 %
2. № 6 Ferrimicrobium sp. — 89,06 %, Acidiferrobacter sp. — 4,26 %, Acidithiobacillus spp. — 2,27 %, Effusibacillus spp. — 1,26 %
3. № 35 Acidithiobacillus spp. — 100 %
4. № 36 Ferrimicrobium sp. — 42,43 %, Acidithiobacillus spp. — 36,07 %, Acidiferrobacter sp. — 12,29 %, Leptospirillum spp. — 5,53 %, неклассифицированное семейство Alicyclobacillaceae — 3,68 %
5. № 49 Acidithiobacillus spp. — 77,86 %, Effusibacillus spp. — 1,26 %, неклассифицированное семейство Acidimicrobiacea — 20,88 %
№ культуры Количество клеток, кл/мл Концентрация железа в жидкой фазе пульпы, г/л Извлечение металлов, %
Fe3+ Fe2+ ^общ Ni Cu Co
5 7,35-107 0,39 0 0,39 21,94 4,65 17,67
6 4,00-107 0,18 0 0,18 27,94 4,51 24,63
35 4,39-107 0,36 0 0,36 31,23 3,85 27,34
36 2,69-107 0,68 0 0,68 10,63 3,39 9,08
49 3,57-107 0,10 0 0,10 27,46 4,52 22,01
240
мл 210
$ 180
ЧО 0 150
120
Й
О H <D 90
si 60
30
0
I
3 9
Время, сут.
□
:
□ 5
□ 6 ■ 35 □ 36
49
15
m
35
36 49
* — доля нуклеотидных последовательностей с учетом основной массы сиквенсов в представленной пробе и с достоверностью совпадения > 95 %
Таблица 4 Параметры биовыщелачивания (на момент окончания процесса)
Рис. 1. Изменение количества клеток в процессе биовыщелачивания
700 600 500 400 300 200 100 0
0
Время, сут.
Рис. 2. Изменение Eh в процессе биовыщелачивания
В ходе эксперимента все микробные культуры были способны к развитию и в большей или в меньшей степени показали клеточный рост, достигая количества 107 кл/мл (рис. 1). В связи со сменой условий культивирования у микробных культур наблюдали непродолжительный период адаптации. Пролонгированная лаг-фаза наблюдалась только у № 35. Наибольшей биомассы к концу окисления достигла культура № 5, численность клеток которой составила 7,3-107 кл/мл.
Интенсивность биовыщелачивания характеризуется окислительно-восстановительным потенциалом пульпы. Он определяется соотношением двухвалентного и трехвалентного железа в жидкой фазе и может существенно зависеть от минерального состава руды и особенностей растворения сульфидов металлов в кислой среде. Колебание параметра в целом соответствовало снижению/увеличению окисления железа в растворе. Максимальные значения Eh наблюдались в конце процесса и составляли соответственно для каждой культуры: 570 мВ (№ 5), 563 мВ (№ 6), 512 мВ (№ 35), 573 мВ (№ 36) и 518 мВ (№ 49) (рис. 2). При этом интенсивнее окислительно-
к
а
3,5 3
2,5 2 1,5 1
0,5 0
5 26
■ 35
■ 36
■ 49
3 9
Время, сут.
Рис. 3. Изменение рН в процессе биовыщелачивания
восстановительные процессы происходили в случае микробных культур № 6, № 36 и № 49.
Контроль рН в процессе биовыщелачивания не показал существенных различий в сероокис-ляющей активности, которая была слабо выражена для всех культур микроорганизмов (рис. 3).
В течение эксперимента высоких концентраций железа не наблюдалось, обнаруживая тенденцию к его снижению. Тем не менее все культуры окисляли находящееся в растворе двухвалентное железо с различной интенсивностью (рис. 4). В среднем проявление железоокисляю-щей активности фиксировалось на шестые сутки. Наиболее активной являлась культура № 36, окисляющая Ее2+ уже со вторых суток биовыщелачивания. Учитывая, что сероокисляющая активность культур была несущественной, можно предположить, что данные микроорганизмы в последующем будут обладать выраженной способностью к окислению железа в непрямом механизме биовыщелачивания.
Ввиду того что используемые микробные культуры были выделены из природной среды и не подвергались предварительной адаптации к условиям процесса, полученные степени извлечения целевых металлов не были высокими: по никелю не превышали 32 %, по меди — 5 %, по кобальту — 28 %. Данные по целевым металлам, представленные в таблице 4, позволили выделить перспективные варианты биовыщелачивания с использованием следующих культур микроорганизмов: 6, 35, 49.
Заключение. В ходе исследования было показано, что аборигенные сообщества микроорганизмов из различных руд кобальт-медно-никеле-вого месторождения Шануч представлены родами Acidithiobacillus, Sulfobacillus, Leptospirillum, Acidi-sphaera, Ferrimicrobium, Effusibacillus, Acidiferro-bacter, а также неклассифицированными семействами АНсус1оЬасШасеае и Ас1ё1ш1сгоЫасеа.
Микробные культуры показали неодинаковую способность к биовыщелачиванию, обнаруживая, главным образом, железоокисляющую и сульфи-докисляющую активность. Учитывая изменение совокупности анализируемых параметров, перспективными для применения в процессе биовыщелачивания были признаны культуры № 6, № 35 и № 49.
В случае культуры № 35 наблюдались максимальные степени извлечения никеля и кобальта, т. е. в том варианте биовыщелачивания, когда отмечены наиболее продолжительный период адаптации микроорганизмов, низкая интенсивность окисления железа и присутствие представителей одного рода — Acidithiobacillus 8рр.
-Ее3+ -Ее2+ -Ееоб
3 6 9 12 Время, сут.
а)
15
1 -'п N
V.
й. й.. 1-й-й- -
-Ее3+ -Ее2+ -Ееоб
3 6 9 12 Время, сут.
г)
15
-Ее3+ -Ее2+ -Ееоб
3 6 9 12 Время, сут. б)
15
-Ее3+ -Ее2+ -Ееоб
3 6 9 12 Время, сут.
15
-Ее3+ -Ее2+ Ееоб
3 6 9 12 Время, сут. д)
15
Рис. 4. Изменение концентрации железа в процессе биовыщелачивания: а — № 5, б — № 6, в — № 35, г — № 36, д — № 49
2
2
2
0
0
2
2
0
Библиографический список
1. Левенец О. О., Хайнасова Т. С., Позолотина Л. А. Модифицирование питательных сред для микроорганизмов в целях улучшения физико-химических параметров биовыщелачивания // Горный информационно-аналитический бюллетень (научно-технический журнал). Специальный выпуск № 31 «Камчатка-3». — М.: Горная книга, 2016. — № 11. — С. 260—271.
2. Рогатых С. В., Мурадов С. В. Методические рекомендации к проведению молекулярно-биологического анализа аборигенных микробных ассоциаций медно-никелевых месторождений // Горный информационно-аналитический бюллетень (научно-технический журнал). Специальный выпуск № 31 «Камчатка-3». — М.: Горная книга, 2016. — № 11. — С. 195—204.
3. Хомченкова А. С. Микробиологические аспекты бактериально-химического выщелачивания сульфидных руд // Горный информационно-аналитический бюллетень (научно-технический журнал). Специальный выпуск № 63 «Камчатка-2». — М.: Горная книга, 2015. — № 11. — С. 371—376.
4. Хайнасова Т. С., Кунгурова В. Е., Левенец О. О. Выделение аборигенных хемолитотрофных микроорганизмов из руд месторождений и рудопроявлений Камчатской никеленосной провинции // Горный информационно-аналитический бюллетень (научно-технический журнал). Специальный выпуск № 31 «Камчатка-3». — М.: Горная книга, 2016. — № 11. — С. 176—185.
5. Хайнасова Т. С., Хомченкова А. С., Позолотина Л. А. Выделение чистых линий ацидофильных железо- и сероокис-ляющих хемолитотрофных микроорганизмов из руд месторождения Шануч // Горный информационно-аналитический бюллетень (научно-технический журнал). Специальный выпуск № 31 «Камчатка-3». — М.: Горная книга, 2016. — № 11. — С. 186—194.
6. Johnson D. B. Importance of microbial ecology in the development of new mineral technologies. Hydrometallurgy, 2001. No. 59, P. 147—157.
7. Rawlings D. E., Johnson D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology, 2007. Vol. 153. — P. 315—324.
8. Garcia-Moyano A., Gonzalez-Toril E., Aguilera A., Amils R. Comparative microbial ecology study of the sediments and the water column of the Rio Tinto, an extreme acidic environment. FEMSMicrobiology Ecology, 2012. Vol. 81 No. 2, Р. 303—314.
9. Mendez M. O., Maier R. M. Characterization of a bacterial community in an abandoned semiarid lead-zinc mine tailing site // Applied and Environmental Microbiology, 2008. Vol. 74. No. 12, Р. 3899—3907.
10. Winch S., Mills H. J., Kostka J. E., Fortin D., Lean D. R. S. Identification of sulfate-reducing bacteria in methylmercury-contaminated mine tailings by analysis of SSU rRNA genes // FEMS Microbiology Ecology, 2009. Vol. 68. No. 1, Р. 94—107.
THE STUDY BIOLEACHING OF SULPHIDE COBALT-COPPER-NICKEL ORE FROM THE SHANUCH DEPOSIT BY INDIGENOUS COMMUNITIES OF MICROORGANISMS AND THEIR IDENTIFICATION
T. S. Khainasova, Ph. D. (Biology), Senior Research, Research Geotechnological Center,
Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (RGC FEB RAS), khainasova@yandex.ru, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia References
1. Levenets O. O., Khaynasova T. S., Pozolotina L. A. Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten (nauchno-tehnicheskij zhurnal). Specialnyj vypusk № 31 "Kamchatka-3". [Mining Informational and Analytical Bulletin (Scientific and Technical Journal). Special issue No. 31 "Kamchatka-3"]. Moscow: Gornaya kniga, 2016. 11. P. 260—271. [in Russian]
2. Rogatykh S. V., Muradov S. V. Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten (nauchno-tehnicheskij zhurnal). Specialnyj vypusk No.31 "Kamchatka-3". [Mining Informational and Analytical Bulletin (Scientific and Technical Journal). Special issue No.31 "Kamchatka-3"]. Moscow: Gornaya kniga, 2016. No. 11. P. 195—204. [in Russian]
3. Khomchenkova A. S. Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten (nauchno-tehnicheskij zhurnal). Specialnyj vypusk № 31 "Kamchatka-3". [Mining Informational and Analytical Bulletin (Scientific and Technical Journal). Special issue No. 63 "Kamchatka-2"]. Moscow: Gornaya kniga, 2016. No. 11. P. 371—376. [in Russian]
4. Khaynasova T. S., Kungurova V. E., Levenets O. O. Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten (nauchno-tehnicheskij zhurnal). Specialnyj vypusk № 31 "Kamchatka-3". [Mining Informational and Analytical Bulletin (Scientific and Technical Journal). Special issue No. 63 "Kamchatka-2"]. Moscow: Gornaya kniga, 2016. No. 11. P. 176—185. [in Russian]
5. Khaynasova T. S., Khomchenkova A. S., Pozolotina L. A. Gornyj informacionno-analiticheskij byulleten (nauchno-teh-nicheskij zhurnal). Specialnyj vypusk No.31 "Kamchatka-3". [Mining Informational and Analytical Bulletin (Scientific and Technical Journal). Special issue No. 63 "Kamchatka-2"]. Moscow: Gornaya kniga, 2016. No. 11. P. 186—194. [in Russian]
6. Johnson D. B. Importance of microbial ecology in the development of new mineral technologies. Hydrometallurgy, 2001. No. 59, P. 147—157.
7. Rawlings D. E., Johnson D. B. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology, 2007. Vol. 153. P. 315—324.
8. Garcia-Moyano A., Gonzalez-Toril E., Aguilera A., Amils R. Comparative microbial ecology study of the sediments and the water column of the Rio Tinto, an extreme acidic environment. FEMS Microbiology Ecology, 2012. Vol. 81. No. 2, P. 303—314.
9. Mendez M. O., Maier R. M. Characterization of a bacterial community in an abandoned semiarid lead-zinc mine tailing site. Applied and Environmental Microbiology, 2008. Vol. 74. No. 12. P. 3899—3907.
10. Winch S., Mills H. J., Kostka J. E., Fortin D., Lean D. R. S. Identification of sulfate-reducing bacteria in methylmercury-contaminated mine tailings by analysis of SSU rRNA genes. FEMS Microbiology Ecology, 2009. Vol. 68. No. 1. P. 94—107.
