CC BY
133
ХИМИЧЕСКАЯ ПЕРЕРАБОТКА ДРЕВЕСИНЫ
УДК 544.472:547.992.3
С.А. Покрышкин1, К.Г. Боголицын1’2, Ю.Г. Хабаров1
1 Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова
2 Институт экологических проблем Севера УрО РАН
Покрышкин Сергей Александрович родился в 1987 г., окончил в 2009 г. Архангельский государственный технический университет, аспирант кафедры теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Имеет 2 публикации в области ферментативной кинетики и катализа.
E-mail: serge.physchem@yandex.ru
Боголицын Константин Григорьевич родился в 1949 г., окончил в 1971 г. Архангельский лесотехнический институт, доктор химических наук, профессор, директор ИЭПС УрО РАН, проректор по научной работе и заведующий кафедрой теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова, заслуженный деятель науки РФ. Имеет более 480 научных работ в области развития фундаментальных принципов «зеленой» химии и разработки физико-химических основ процесса переработки древесины.
E-mail: bogolitsyn@iepn.ru
Хабаров Юрий Германович родился в 1950 г., окончил в 1972 г. Архангельский лесотехнический институт, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры технологии ЦБП Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Имеет 180 печатных работ в области химии древесины, органической и аналитической химии.
E-mail: khabarov.yu@mail.ru
ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА В СРЕДЕ ВОДА-ДМСО В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА*
Показано сохранение активности фермента при наличии в растворе до 30 % ДМСО в реакции окисления лигнина, установлена возможность ферментативного окисления олиго- и полимерных препаратов лигнина.
Ключевые слова: фермент, пероксидаза, лигнин, диметилсульфоксид.
Задача мониторинга качества вод промышленных предприятий в настоящее время является актуальной. На предприятиях ЦБП токсичные фенольные компоненты в технологических водах обнаруживаются на всем протяжении технологического процесса. После удаления легкоокисляемых мономерных фенолов сточные воды содержат большое количество лигнинных веществ, которые накапливаются в водоемах. Разрушение их под действием ультрафиолетового излучения солнца, микроорганизмов, окисления кислородом воздуха создает постоянный фон токсичных компонентов и снижает уровень кислорода в водоеме [2, 4, 5]. Поэтому определение содержания олиго- и полимерных лигнинных веществ является актуальным с точки зрения как оптимизации технологии, так и экологического мониторинга [6]. Одно из перспективных направлений - использование биосенсоров, основанных на ферментах, позволяет повысить экспрессность, увеличить чувствительность и селективность анализа [17].
Классические растительные пероксидазы, в частности пероксидаза из корней хрена (HRP), обладают высокой стабильностью, более высоким рН-оптимумом и возможностью окисления фенольных соединений непосредственно, без медиаторов или вторых субстратов [11, 15]. Фермент пероксидаза (КФ 1.1.11.7) широко применяется в иммуноферментном анализе [12, 21], при конструировании ферментных электродов [13, 16, 20], создании биомаркеров [14]. Нативная пероксидаза хрена катализирует окисление пероксидом водорода широкого круга фенольных субстратов [3, 19]. Для окисления малорастворимых в воде высокомолекулярных фенольных соединений перспективно использование водно-органических смешанных растворителей. Одним из хорошо известных растворителей для лигнинов является ДМСО [8].
Работа выполнена в Центре коллективного пользования научным оборудованием (ЦКП НО) «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова при поддержке Минобрнауки РФ.
© Покрышкин С.А., Боголицын К.Г., Хабаров Ю.Г., 2013
В работах [1, 9, 18] показана возможность окисления фенольных соединений пероксидазой хрена в водно-органических средах.
Цель данной работы - изучить процесс окисления лигнина в бинарном растворителе вода-ДМСО в присутствии пероксидазы хрена и возможность применения данного фермента для создания новых методик определения лигнина. В качестве объекта исследования была выбрана пероксидаза HRP (КФ 1.1.11.7) - гем-содержащий фермент, относящийся к классу пероксидаз растений.
В работе использовали коммерческий препарат С2 пероксидазы хрена (BBI «Enzymes») со спектральным показателем чистоты Rz = 2,30. Активность фермента определяли по скорости реакции окисления гваякола пероксидом водорода [10].
Концентрацию пероксида водорода контролировали спектрофотометрическим методом с использованием 2-лучевого УФ спектрофотометра Specord250Plus («Analytik Jena») по полосе поглощения 230 нм (молярный коэффициент поглощения 72,7 М" -см" ). В качестве субстрата применяли гваякол производства «Sigma-Aldrich». Реактивы соответствовали квалификации «ос.ч.».
Параметры проведения ферментативной реакции соответствовали определенным ранее [7]. Реакцию пероксидазного окисления лигнина (концентрация (5...500) -10-3 г/л) пероксидом водорода (0,1-10"3 М) проводили при температуре 25 °С в среде фталатного буферного раствора (0,1 М) при концентрации ДМСО 30 % масс. Процесс инициировали введением пероксидазы хрена (0,015 мг/мл) при объеме реакционной смеси 3 мл. Запись спектров и кинетических кривых окисления гваякола производили на Specord250Plus. За ходом реакции следили по поглощению в области характеристической полосы продукта ферментативного окисления гваякола. Начальную скорость реакции рассчитывали по результатам измерений тангенса угла наклона начального линейного участка кинетической кривой.
Молекулярно-массовое распределение анализировали методом эксклюзионной хроматографии* с использованием ВЭЖХ системы LC-20 («Shimadzu», Япония), оснащенной насосом LC-20 ADsp, автосамплером SIL-20A, термостатом колонок CT0-20A, спектрофотометрическим детектором SPD-20A. Разделение проводили на колонке Styragel (300x4,6 мм), заполненной стиролдивинилбензольным гелем с диаметром частиц 5 мкм («Waters», США) при температуре 50° С. В качестве элюента использовали диметилформамид с добавкой бромида лития (0,05 М) для подавления полиэлектролитных эффектов. Объем вводимой пробы -10 мкл, концентрация - 1 мг/мл. Система отградуирована с использованием монодисперсных стандартов полистирола в диапазоне молекулярных масс от 100 до 100 тыс. Да. Детектирование осуществляли при длине волны 280 нм. Данные собирали и обрабатывали с использованием програмного обеспечения WinGPC (PSS, Германия).
В качестве модельных субстратов фермента использовали образцы диоксанлигнина, сульфатного лигнина, лигносульфоната, выделенных из ели, и натронного лигнина пшеничной соломы. Готовили растворы препаратов лигнина в ДМСО с концентрацией 10 г/л, которые добавляли в реакционную смесь до получения требуемой концентрации лигнина. Раствор лигнина в присутствии пероксида водорода без добавления фермента оставался стабильным в течение 3 ч. При добавлении в реакционную смесь пероксидазы хрена наблюдалось увеличение оптической плотности в области 400.600 нм (рис. 1).
Рис. l. Электронные
поглощения
ферментативного
диоксанлигнина в 30 %-м водном
растворе ДМСО (продолжительность реакции варьировали от 0 до 10 мин)
спектры
продуктов
окисления
400
425
450
475
500 525
Длина волны, нм
550
575
* Авторы выражают благодарность м.н.с. ЦКП НО «Арктика» Н. В. Ульяновскому за анализ проб методом эксклюзионной ВЭЖХ.
В процессе ферментативного окисления в спектрах проявлялся максимум при 490 нм, отсутствующий в исходных спектрах и использованный в дальнейшем для определения скорости реакции.
В диапазоне концентраций препаратов лигнина 5...500 мг/л была определена скорость протекания реакции, построены зависимости начальной скорости реакции и максимальной оптической плотности реакционной смеси от концентрации лигнина (рис. 2).
б
Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции (а) и максимальной оптической плотности реакционной смеси (б) от концентрации сульфатного лигнина (1) и диоксанлигнина (2)
В ходе реакции для образцов диоксанлигнина и сульфатного лигнина было обнаружено увеличение оптической плотности, для образцов лигносульфоната и натронного лигнина признаков протекания реакции не обнаружено. Это можно объяснить ионной формой фенольных ОН-групп в оптимальном для фермента диапазоне рН. В диапазоне концентраций лигнина от 5 до 100 мг/л полученные зависимости начальной скорости (У0) и максимальной оптической плотности (Дпах) от концентрации лигнина (рис. 2) являются линейными, выходящими из центра координат, и описываются уравнениями вида
Г0 = ах и ,Отах = Ьх .
Угловые коэффициенты а и Ь приведены в табл. 1.
а
Таблица 1
Параметры зависимостей начальной скорости и максимальной оптической плотности от
концентрации лигнина
Коэффициент Диоксанлигнин Сульфатный лигнин
а 4Д6^0-6 6,42-10-6
Ь 3,63а0-4 1,06^10-3
1,4 Г
1,2
СО *1,0
Го,8
О §0,6 §
|0,4 О
0,2 О
Ю 100 1000 10 ООО 100 ООО
Молекулярная масса, Да
Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение препарата диоксанлигнина до реакции (1) и через 60 мин после начала реакции (2)
Отклонение экспериментальных точек от линейной зависимости при высоких концентрациях лигнина обусловлено насыщением субстрат-связывающих сайтов фермента. Полученные данные создают предпосылки для разработки метода определения содержания лигнинных веществ после перевода их в раствор в системе вода-ДМСО.
Для препарата диоксанлигнина дополнительно методом эксклюзионной хроматографии было изучено изменение молекулярно-массового распределения в ходе реакции. Полученные результаты свидетельствуют об уменьшении доли низкомолекулярных фракций и некотором возрастании молекулярной массы препарата лигнина при снижении степени его полидисперсности (рис. 3, табл. 2), что свидетельствует о совместном протекании процессов окисления и полимеризации лигнина под действием фермента, а также о вступлении в реакцию не только низко-, но и высокомолекулярных фрагментов лигнина.
Таблица 2
Молекулярно-массовые характеристики препарата диоксанлигнина
Значение показателя
Показатель до после
окисления окисления
Молекулярная
масса, Да:
Mn 1 540 2 030
Mw 4 660 5 480
Mz 9 040 10 100
Полидисперсность 3,0 2,7
Выводы
Показано, что фермент (пероксидаза хрена) проявляет активность в реакциях окисления лигнинных веществ при значительном содержании ДМСО в растворе (до 30 %).
Установлено, что ферментативному каталитическому окислению могут быть подвержены как мономерные фенолы, так и олиго- и полимерные препараты, находящиеся в исследуемом растворе.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработок ферментативных биосенсоров для определения лигнина в водно-органических средах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.Н.Повышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, № 2. С. 143-148.
2. Грушко Я.М. Сброс лигнина в водоемы с промышленными сточными водами //Влияние фенольных соединений на гидробионтов. Иркутск, 1981. С. 109-116.
3. Использование пероксидаз различного происхождения для определения фенолов / Т.Н. Шеховцова [и др.] // Журн. аналит. химии. 1994. Т. 49, № 12. С. 1317-1323.
4. Калинкина Н.М. Эколого-токсикологическая оценка опасности сульфатного лигнина для гидробионтов: автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 1993. 22 с.
5. Криульков В.А., Каплин В.Т., Ганин Г.И. Механизм превращения лигнина и его производных в природной среде // Химия и использование лигнина. Рига.: Зинатне, 1974. С. 397-408.
6. Оптимизация нормирования сброса стоков предприятий ЦБП в водотоки / Т.Ф. Личутина, И.В. Мискевич, О.С. Бровко, М.А. Гусакова. Екатеринбург: УрО РАН, 2005. 212 с.
7. Покрышкин С.А., Боголицын К.Г., Аксенов А.С. Кинетические закономерности ферментативного окисления гваякола в водной и водно-органической средах // Лесн. журн. 2012. №3. С.100-106. (Изв. высш. учеб. заведений).
8. Физическая химия лигнина / К.Г. Боголицын [и др.]. М.: Академкнига, 2010. 492 с.
9. Яблоцкий К.В. Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов: Автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 2010. 28 с.
10. Bergmeyer H. U. Methods of enzymatic analysis 2nd Edition. New York: Academic Press, 1974. P. 495.
11. Dominic W.S. Wong. Structure and аction mechanism of ligninolytic Enzymes // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. N 157. Р. 174-209.
12. Horseradish peroxidase-functionalized Pt hollow nanospheres and multiple redox probes as trace labels for a sensitive simultaneous multianalyte electrochemical immunoassay / Song Z [etc.] // Chem. Commun. (Camb). 2010. N 46. P. 6750-6752.
13. Korkut S., Keskinler B., Erhan E. An amperometric biosensor based on multiwalled carbon nanotube-poly(pyrrole)-horseradish peroxidase nanobiocomposite film for determination of phenol derivatives // Talanta. 2008. N 76. P. 1147-1152.
14. Membrane targeted horseradish peroxidase as a marker for correlative fluorescence and electron
microscopy studies / J. Li, Y. Wang, S.L. Chiu, H.T. Cline // Front Neural Circuits. 2010. N 4. P. 6.
15. Nigel C. Veitch. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme // Phytochemistry. 2004. N 65. Р. 249-259.
16. Reagentless biosensor for hydrogen peroxide based on self-assembled films of horseradish peroxidase/laponite/chitosan and the primary investigation on the inhibitory effect by sulfide / Shan D. [ect.] // Biosens. Bioelectron. 2010. N 26. P. 536-541.
17. Sadana A., Sadana N. Handbook of Biosensors and Biosensor Kinetics. Elsevier, the Netherlands, 2011.
18. Stability of free and immobilized peroxidase in aqueous-organic solvent mixtures / Azevedo Anna M. [
etc.] // J. of Molecular Catalysis B.: Enzymatic. 2001. N 15. P. 147-153.
19. Torres E., Ayala M. Biocatalysis Based on Heme Peroxidases. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg. 2010.
358 s.
20. Yao H., Hu N. pH-switchable bioelectrocatalysis of hydrogen peroxide on layer-by-layer films assembled by concanavalin A and horseradish peroxidase with electroactive mediator in solution // J. Phys. Chem. B. 2010 N 114. P. 3380-3386.
21. Zhang S. Zou J. Yu F. Investigation of voltammetric enzyme-linked immunoassay based on a new system of HAP-H2O2-HRP // Talanta. 2008. N 76. P.122-127.
Поступила 30.04.13
S.A. Pokryshkin1, K. G. Bogolytsin1’2, Yu. G. Khabarov1
1 Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov
2 Institute of Ecological Problems of the North, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences
Oxidation of Lignin with Hydrogen Peroxide in Water/DMSO Binary Solvent in the Presence of Horseradish Peroxidase
Peroxidase remained active in the presence of up to 30% DMSO in the solution for lignin oxidation. The possibility of enzymatic oxidation of oligomeric and polymeric phenolic compounds is substantiated.
Keywords: enzyme, peroxidase, lignin, dimethyl sulfoxide.
