Научная статья на тему 'Окисление лигнина пероксидом водорода в среде вода–ДМСО в присутствии пероксидазы хрена'

Окисление лигнина пероксидом водорода в среде вода–ДМСО в присутствии пероксидазы хрена Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
498
147
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ФЕРМЕНТ / ПЕРОКСИДАЗА / ЛИГНИН / ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИД / ENZYME / PEROXIDASE / LIGNIN / DIMETHYL SULFOXIDE

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Покрышкин С. А., Боголицын К. Г., Хабаров Ю. Г.

Показано сохранение активности фермента при наличии в растворе до 30 % ДМСО в реакции окисления лигнина, установлена возможность ферментативного окисления олигои полимерных препаратов лигнина

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Покрышкин С. А., Боголицын К. Г., Хабаров Ю. Г.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Oxidation of Lignin with Hydrogen Peroxide in Water/DMSO Binary Solvent in the Presence of Horseradish Peroxidase

Peroxidase remained active in the presence of up to 30% DMSO in the solution for lignin oxidation. The possibility of enzymatic oxidation of oligomeric and polymeric phenolic compounds is substantiated.

Текст научной работы на тему «Окисление лигнина пероксидом водорода в среде вода–ДМСО в присутствии пероксидазы хрена»

ХИМИЧЕСКАЯ ПЕРЕРАБОТКА ДРЕВЕСИНЫ

УДК 544.472:547.992.3

С.А. Покрышкин1, К.Г. Боголицын1’2, Ю.Г. Хабаров1

1 Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова

2 Институт экологических проблем Севера УрО РАН

Покрышкин Сергей Александрович родился в 1987 г., окончил в 2009 г. Архангельский государственный технический университет, аспирант кафедры теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Имеет 2 публикации в области ферментативной кинетики и катализа.

E-mail: serge.physchem@yandex.ru

Боголицын Константин Григорьевич родился в 1949 г., окончил в 1971 г. Архангельский лесотехнический институт, доктор химических наук, профессор, директор ИЭПС УрО РАН, проректор по научной работе и заведующий кафедрой теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова, заслуженный деятель науки РФ. Имеет более 480 научных работ в области развития фундаментальных принципов «зеленой» химии и разработки физико-химических основ процесса переработки древесины.

E-mail: bogolitsyn@iepn.ru

Хабаров Юрий Германович родился в 1950 г., окончил в 1972 г. Архангельский лесотехнический институт, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры технологии ЦБП Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Имеет 180 печатных работ в области химии древесины, органической и аналитической химии.

E-mail: khabarov.yu@mail.ru

ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА В СРЕДЕ ВОДА-ДМСО В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА*

Показано сохранение активности фермента при наличии в растворе до 30 % ДМСО в реакции окисления лигнина, установлена возможность ферментативного окисления олиго- и полимерных препаратов лигнина.

Ключевые слова: фермент, пероксидаза, лигнин, диметилсульфоксид.

Задача мониторинга качества вод промышленных предприятий в настоящее время является актуальной. На предприятиях ЦБП токсичные фенольные компоненты в технологических водах обнаруживаются на всем протяжении технологического процесса. После удаления легкоокисляемых мономерных фенолов сточные воды содержат большое количество лигнинных веществ, которые накапливаются в водоемах. Разрушение их под действием ультрафиолетового излучения солнца, микроорганизмов, окисления кислородом воздуха создает постоянный фон токсичных компонентов и снижает уровень кислорода в водоеме [2, 4, 5]. Поэтому определение содержания олиго- и полимерных лигнинных веществ является актуальным с точки зрения как оптимизации технологии, так и экологического мониторинга [6]. Одно из перспективных направлений - использование биосенсоров, основанных на ферментах, позволяет повысить экспрессность, увеличить чувствительность и селективность анализа [17].

Классические растительные пероксидазы, в частности пероксидаза из корней хрена (HRP), обладают высокой стабильностью, более высоким рН-оптимумом и возможностью окисления фенольных соединений непосредственно, без медиаторов или вторых субстратов [11, 15]. Фермент пероксидаза (КФ 1.1.11.7) широко применяется в иммуноферментном анализе [12, 21], при конструировании ферментных электродов [13, 16, 20], создании биомаркеров [14]. Нативная пероксидаза хрена катализирует окисление пероксидом водорода широкого круга фенольных субстратов [3, 19]. Для окисления малорастворимых в воде высокомолекулярных фенольных соединений перспективно использование водно-органических смешанных растворителей. Одним из хорошо известных растворителей для лигнинов является ДМСО [8].

Работа выполнена в Центре коллективного пользования научным оборудованием (ЦКП НО) «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова при поддержке Минобрнауки РФ.

© Покрышкин С.А., Боголицын К.Г., Хабаров Ю.Г., 2013

В работах [1, 9, 18] показана возможность окисления фенольных соединений пероксидазой хрена в водно-органических средах.

Цель данной работы - изучить процесс окисления лигнина в бинарном растворителе вода-ДМСО в присутствии пероксидазы хрена и возможность применения данного фермента для создания новых методик определения лигнина. В качестве объекта исследования была выбрана пероксидаза HRP (КФ 1.1.11.7) - гем-содержащий фермент, относящийся к классу пероксидаз растений.

В работе использовали коммерческий препарат С2 пероксидазы хрена (BBI «Enzymes») со спектральным показателем чистоты Rz = 2,30. Активность фермента определяли по скорости реакции окисления гваякола пероксидом водорода [10].

Концентрацию пероксида водорода контролировали спектрофотометрическим методом с использованием 2-лучевого УФ спектрофотометра Specord250Plus («Analytik Jena») по полосе поглощения 230 нм (молярный коэффициент поглощения 72,7 М" -см" ). В качестве субстрата применяли гваякол производства «Sigma-Aldrich». Реактивы соответствовали квалификации «ос.ч.».

Параметры проведения ферментативной реакции соответствовали определенным ранее [7]. Реакцию пероксидазного окисления лигнина (концентрация (5...500) -10-3 г/л) пероксидом водорода (0,1-10"3 М) проводили при температуре 25 °С в среде фталатного буферного раствора (0,1 М) при концентрации ДМСО 30 % масс. Процесс инициировали введением пероксидазы хрена (0,015 мг/мл) при объеме реакционной смеси 3 мл. Запись спектров и кинетических кривых окисления гваякола производили на Specord250Plus. За ходом реакции следили по поглощению в области характеристической полосы продукта ферментативного окисления гваякола. Начальную скорость реакции рассчитывали по результатам измерений тангенса угла наклона начального линейного участка кинетической кривой.

Молекулярно-массовое распределение анализировали методом эксклюзионной хроматографии* с использованием ВЭЖХ системы LC-20 («Shimadzu», Япония), оснащенной насосом LC-20 ADsp, автосамплером SIL-20A, термостатом колонок CT0-20A, спектрофотометрическим детектором SPD-20A. Разделение проводили на колонке Styragel (300x4,6 мм), заполненной стиролдивинилбензольным гелем с диаметром частиц 5 мкм («Waters», США) при температуре 50° С. В качестве элюента использовали диметилформамид с добавкой бромида лития (0,05 М) для подавления полиэлектролитных эффектов. Объем вводимой пробы -10 мкл, концентрация - 1 мг/мл. Система отградуирована с использованием монодисперсных стандартов полистирола в диапазоне молекулярных масс от 100 до 100 тыс. Да. Детектирование осуществляли при длине волны 280 нм. Данные собирали и обрабатывали с использованием програмного обеспечения WinGPC (PSS, Германия).

В качестве модельных субстратов фермента использовали образцы диоксанлигнина, сульфатного лигнина, лигносульфоната, выделенных из ели, и натронного лигнина пшеничной соломы. Готовили растворы препаратов лигнина в ДМСО с концентрацией 10 г/л, которые добавляли в реакционную смесь до получения требуемой концентрации лигнина. Раствор лигнина в присутствии пероксида водорода без добавления фермента оставался стабильным в течение 3 ч. При добавлении в реакционную смесь пероксидазы хрена наблюдалось увеличение оптической плотности в области 400.600 нм (рис. 1).

Рис. l. Электронные

поглощения

ферментативного

диоксанлигнина в 30 %-м водном

растворе ДМСО (продолжительность реакции варьировали от 0 до 10 мин)

спектры

продуктов

окисления

400

425

450

475

500 525

Длина волны, нм

550

575

* Авторы выражают благодарность м.н.с. ЦКП НО «Арктика» Н. В. Ульяновскому за анализ проб методом эксклюзионной ВЭЖХ.

В процессе ферментативного окисления в спектрах проявлялся максимум при 490 нм, отсутствующий в исходных спектрах и использованный в дальнейшем для определения скорости реакции.

В диапазоне концентраций препаратов лигнина 5...500 мг/л была определена скорость протекания реакции, построены зависимости начальной скорости реакции и максимальной оптической плотности реакционной смеси от концентрации лигнина (рис. 2).

б

Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции (а) и максимальной оптической плотности реакционной смеси (б) от концентрации сульфатного лигнина (1) и диоксанлигнина (2)

В ходе реакции для образцов диоксанлигнина и сульфатного лигнина было обнаружено увеличение оптической плотности, для образцов лигносульфоната и натронного лигнина признаков протекания реакции не обнаружено. Это можно объяснить ионной формой фенольных ОН-групп в оптимальном для фермента диапазоне рН. В диапазоне концентраций лигнина от 5 до 100 мг/л полученные зависимости начальной скорости (У0) и максимальной оптической плотности (Дпах) от концентрации лигнина (рис. 2) являются линейными, выходящими из центра координат, и описываются уравнениями вида

Г0 = ах и ,Отах = Ьх .

Угловые коэффициенты а и Ь приведены в табл. 1.

а

Таблица 1

Параметры зависимостей начальной скорости и максимальной оптической плотности от

концентрации лигнина

Коэффициент Диоксанлигнин Сульфатный лигнин

а 4Д6^0-6 6,42-10-6

Ь 3,63а0-4 1,06^10-3

1,4 Г

1,2

СО *1,0

Го,8

О §0,6 §

|0,4 О

0,2 О

Ю 100 1000 10 ООО 100 ООО

Молекулярная масса, Да

Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение препарата диоксанлигнина до реакции (1) и через 60 мин после начала реакции (2)

Отклонение экспериментальных точек от линейной зависимости при высоких концентрациях лигнина обусловлено насыщением субстрат-связывающих сайтов фермента. Полученные данные создают предпосылки для разработки метода определения содержания лигнинных веществ после перевода их в раствор в системе вода-ДМСО.

Для препарата диоксанлигнина дополнительно методом эксклюзионной хроматографии было изучено изменение молекулярно-массового распределения в ходе реакции. Полученные результаты свидетельствуют об уменьшении доли низкомолекулярных фракций и некотором возрастании молекулярной массы препарата лигнина при снижении степени его полидисперсности (рис. 3, табл. 2), что свидетельствует о совместном протекании процессов окисления и полимеризации лигнина под действием фермента, а также о вступлении в реакцию не только низко-, но и высокомолекулярных фрагментов лигнина.

Таблица 2

Молекулярно-массовые характеристики препарата диоксанлигнина

Значение показателя

Показатель до после

окисления окисления

Молекулярная

масса, Да:

Mn 1 540 2 030

Mw 4 660 5 480

Mz 9 040 10 100

Полидисперсность 3,0 2,7

Выводы

Показано, что фермент (пероксидаза хрена) проявляет активность в реакциях окисления лигнинных веществ при значительном содержании ДМСО в растворе (до 30 %).

Установлено, что ферментативному каталитическому окислению могут быть подвержены как мономерные фенолы, так и олиго- и полимерные препараты, находящиеся в исследуемом растворе.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработок ферментативных биосенсоров для определения лигнина в водно-органических средах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.Н.Повышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, № 2. С. 143-148.

2. Грушко Я.М. Сброс лигнина в водоемы с промышленными сточными водами //Влияние фенольных соединений на гидробионтов. Иркутск, 1981. С. 109-116.

3. Использование пероксидаз различного происхождения для определения фенолов / Т.Н. Шеховцова [и др.] // Журн. аналит. химии. 1994. Т. 49, № 12. С. 1317-1323.

4. Калинкина Н.М. Эколого-токсикологическая оценка опасности сульфатного лигнина для гидробионтов: автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 1993. 22 с.

5. Криульков В.А., Каплин В.Т., Ганин Г.И. Механизм превращения лигнина и его производных в природной среде // Химия и использование лигнина. Рига.: Зинатне, 1974. С. 397-408.

6. Оптимизация нормирования сброса стоков предприятий ЦБП в водотоки / Т.Ф. Личутина, И.В. Мискевич, О.С. Бровко, М.А. Гусакова. Екатеринбург: УрО РАН, 2005. 212 с.

7. Покрышкин С.А., Боголицын К.Г., Аксенов А.С. Кинетические закономерности ферментативного окисления гваякола в водной и водно-органической средах // Лесн. журн. 2012. №3. С.100-106. (Изв. высш. учеб. заведений).

8. Физическая химия лигнина / К.Г. Боголицын [и др.]. М.: Академкнига, 2010. 492 с.

9. Яблоцкий К.В. Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов: Автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 2010. 28 с.

10. Bergmeyer H. U. Methods of enzymatic analysis 2nd Edition. New York: Academic Press, 1974. P. 495.

11. Dominic W.S. Wong. Structure and аction mechanism of ligninolytic Enzymes // Appl. Biochem. Biotechnol. 2009. N 157. Р. 174-209.

12. Horseradish peroxidase-functionalized Pt hollow nanospheres and multiple redox probes as trace labels for a sensitive simultaneous multianalyte electrochemical immunoassay / Song Z [etc.] // Chem. Commun. (Camb). 2010. N 46. P. 6750-6752.

13. Korkut S., Keskinler B., Erhan E. An amperometric biosensor based on multiwalled carbon nanotube-poly(pyrrole)-horseradish peroxidase nanobiocomposite film for determination of phenol derivatives // Talanta. 2008. N 76. P. 1147-1152.

14. Membrane targeted horseradish peroxidase as a marker for correlative fluorescence and electron

microscopy studies / J. Li, Y. Wang, S.L. Chiu, H.T. Cline // Front Neural Circuits. 2010. N 4. P. 6.

15. Nigel C. Veitch. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme // Phytochemistry. 2004. N 65. Р. 249-259.

16. Reagentless biosensor for hydrogen peroxide based on self-assembled films of horseradish peroxidase/laponite/chitosan and the primary investigation on the inhibitory effect by sulfide / Shan D. [ect.] // Biosens. Bioelectron. 2010. N 26. P. 536-541.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

17. Sadana A., Sadana N. Handbook of Biosensors and Biosensor Kinetics. Elsevier, the Netherlands, 2011.

18. Stability of free and immobilized peroxidase in aqueous-organic solvent mixtures / Azevedo Anna M. [

etc.] // J. of Molecular Catalysis B.: Enzymatic. 2001. N 15. P. 147-153.

19. Torres E., Ayala M. Biocatalysis Based on Heme Peroxidases. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg. 2010.

358 s.

20. Yao H., Hu N. pH-switchable bioelectrocatalysis of hydrogen peroxide on layer-by-layer films assembled by concanavalin A and horseradish peroxidase with electroactive mediator in solution // J. Phys. Chem. B. 2010 N 114. P. 3380-3386.

21. Zhang S. Zou J. Yu F. Investigation of voltammetric enzyme-linked immunoassay based on a new system of HAP-H2O2-HRP // Talanta. 2008. N 76. P.122-127.

Поступила 30.04.13

S.A. Pokryshkin1, K. G. Bogolytsin1’2, Yu. G. Khabarov1

1 Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov

2 Institute of Ecological Problems of the North, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Oxidation of Lignin with Hydrogen Peroxide in Water/DMSO Binary Solvent in the Presence of Horseradish Peroxidase

Peroxidase remained active in the presence of up to 30% DMSO in the solution for lignin oxidation. The possibility of enzymatic oxidation of oligomeric and polymeric phenolic compounds is substantiated.

Keywords: enzyme, peroxidase, lignin, dimethyl sulfoxide.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.