CC BY
83
УДК 630*813.11:577.15
КАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЛИГНИНА ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ КАТАЛИЗАТОРА
© М.А. Айзенштадт , К.Г. Боголицын, С.А. Покрышкин
Архангельский государственный технический университет, Набережная Северной Двины, 17, Архангельск, 163002 (Россия) E-mail: fishim@agtu.ru
Изучена кинетика реакции каталитического окисления гваякола, феруловой кислоты, ацетованилона и ванилинового спирта пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена в качестве катализатора. Определены кинетические параметры реакции: Кт эф и V m эф. Изучено влияние рН реакционной среды, концентрации субстрата окислителя, субстрата восстановителя, фермента на скорость пероксидазного окисления модельных соединений; определены оптимальные условия окисления.
Ключевые слова: ферменты, пероксидаза хрена, пероксид водорода, каталитическое окисление, лигнин, модельные соединения лигнина.
Работа поддержана грантом Администрации Архангельской области (проект №04-04 «Ферментативное окисление растительных биополимеров нерегулярного строения и полифункциональной природы», июнь 2009 г.).
Введение
Наиболее существенный вклад в загрязнение рек и других природных водных объектов вносит деятельность предприятий целлюлозно-бумажной промышленности, что обусловлено сложностью и многостадий-ностью осуществляемого на них технологического процесса. Образующиеся в результате сточные воды содержат широкий спектр загрязняющих веществ, серосодержащих и хлорсодержащих реагентов, применяемых для варки и отбелки, продуктов их реакций с компонентами древесины - органических и неорганических компонентов, причем точный состав их, даже в качественном отношении, не всегда можно заранее предвидеть. Одним из основных показателей качества сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий является содержание в них лигнинных веществ, которые представляют собой группу родственных высокомолекулярных соединений ароматической природы. Они не относятся к опасным токсичным соединениям. Вместе с тем при попадании в природный водоем группа конденсированных и малотрансформируемых лиг-нинных веществ имеет низкую скорость разложения и поэтому склонна к накоплению, что значительно ухудшает органолептические показатели водоемов и условия жизни гидробионтов. А опасные для здоровья вещества могут образовываться из лигнинных соединений в результате вторичных окислительновосстановительных процессов в водоеме [1, 2].
Таким образом, одной из актуальных аналитических задач в химической технологии древесины является совершенствование системы производственного экологического контроля путем разработки и внедрения новых высокочувствительных, информативных и экспрессных методов определения лигнинных веществ. Для решения указанной задачи перспективно применение ферментативных методов анализа. Они широко используются для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических
* Автор, с которым следует вести переписку.
задач. Все более широкое распространение получают работы, связанные с изучением биотрансформации и биодеградации лигнина.
В настоящее время ведущую роль в окислительной деструкции лигнина отводят ферментам, относящимся к классу оксидоредуктаз, а именно к суперсемейству пероксидаз растений. Наиболее широкое применение благодаря своей высокой каталитической активности в процессе окисления лигнина нашли грибные пе-роксидазы: LiP, MnP, лакказа и некоторые растительные пероксидазы - пероксидаза хрена.
Особенности строения приведенных выше пероксидаз достаточно хорошо изучены; данные пероксидазы имеют схожее строение активного центра, однако наиболее широкое применение в процессе окисления лигнина нашли грибные пероксидазы. Что же касается пероксидазы хрена, то ее использование ограничено небольшим кругом исследований в области окисления простых мономерных фенольных структур. При этом с точки зрения ее практического применения необходимо отметить высокую стабильность данного фермента и более высокий рабочий рН-оптимум в отличие от грибных пероксидаз [3]. Отмеченные факты дают возможность предположить перспективность использования - пероксидазы хрена как катализатора процессов биодеградации лигнина.
Данный процесс целесообразно изучать, используя органические структуры, моделирующие фрагменты макромолекулы лигнина (наличие функциональных групп, характерных связей и атомных группировок). Реакционно-активными центрами макромолекулы лигнина являются карбонильные, карбоксильные и фенольные группы, расположенные в пара-положении ароматического кольца. В связи с этим при изучении каталитического окисления модельных соединений структурного звена лигнина в качестве объектов исследования выбраны гваякол, феруловая кислота, ацетованилон и ванилиновый спирт.
Таким образом, цель данного исследования - изучение субстратной специфичности фермента класса ок-сидоредуктаз - пероксидазы хрена по отношению к модельным соединениям структурного звена лигнина гваяцильного ряда с различными заместителями в боковой цепи и установление кинетических закономерностей процесса их окисления комплексом HRP-H2O2.
С этой целью были выполнены исследования влияния концентрации субстрата-восстановителя (модельного соединения лигнина), рН реакционной среды, концентрации катализатора, концентрации субстрата-окислителя (пероксида водорода) на кинетику процесса пероксидазного окисления модельных соединений лигнина пероксидом водорода.
Экспериментальная часть
В работе использовали препарат пероксидазы из корней хрена (EC 1.11.1.7 «Reanal», Венгрия, U = 350500 ед/мг; RZ=0,6). Раствор с содержанием пероксидазы хрена 1-10 мкМ готовили растворением препарата в 0,1 М боратном буферном растворе (рН 7,0). Для поддержания постоянной ионной силы и повышения устойчивости раствора фермента добавляли 0,1 М раствор нитрата натрия. Точную концентрацию пероксидазы хрена устанавливали спектрофотометрически (е403= 9,4-104 М-1см-1) [4].
Для поддержания требуемого значения рН раствора использовали боратный (рН 7,0), фосфатный (рН 6,0) и ацетатный (рН 4,5-5,5) буферные растворы, приготовленные согласно [5]. Значение рН растворов контролировали с помощью стеклянного и хлорсеребряного электродов на рН-метр-иономере «Эксперт-001» (ООО «Электроникс-Эксперт», Москва, Россия).
Раствор заданной концентрации пероксида водорода готовили в деионизированной воде (жк =10...9 мкСм, Водолей №520, НПП «Химэлектроника», Москва, Россия) из концентрированного раствора H2O2 (с=30%,
о.с.ч., «Химмед», Россия). Точную концентрацию приготовленного раствора пероксида водорода контролировали спектрофотометрически (е2зо=72,7 моль-1 см-1) [6].
Растворы модельных соединений лигнина готовили ежедневно растворением точной навески жидкого/твердого препарата в этанол-ректификате: гваякол (2-метоксифенол, puriss (Merck)), феруловая кислота (3-метокси-4-оксикоричная кислота, purum (Aldrich)), ацетованилон (3-метокси-4-оксиацетофенон, purum (Aldrich)), ванилиновый спирт (3-метокси-4-оксибензиловый спирт, purum (Aldrich)).
Для изучения кинетики пероксидазного окисления выбранных субстратов использовали спектрофотометрический метод.
Реакции окисления модельных соединений лигнина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы из корней хрена проводили по следующей методике. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно необходимое количество буферного раствора, раствора пероксидазы хрена, раствора субстрата-восстановителя (модельного соединения лигнина) и раствора пероксида водорода. Общий объем реакционной
смеси составил 5 мл. После добавления пероксида водорода раствор перемешивали и фиксировали время начала реакции. Далее раствор помещали в кварцевую кювету (/=1 см) и после истечения 30 сек с момента начала реакции (для корректного последующего сопоставления полученных экспериментальных данных) регистрировали спектры поглощения продуктов реакции окисления через определенное время (15 сек).
Обсуждение результатов
Основными факторами, влияющими на механизм и кинетику взаимодействия фермента с модельными соединениями лигнина, являются рН, концентрации пероксида водорода, фермента и самого субстрата-восстановителя. Данные факторы также воздействуют на стабильность фермента, вызывая необратимые изменения его нативной конформации. Это необходимо учитывать, подбирая оптимальные условия для измерения активности и субстратной специфичности выбранного фермента.
На спектрофотометре Specord 200 Analytik Jena были записаны УФ-спектры продуктов пероксидазного окисления выбранных субстратов и с помощью компьютерной програмы WinASPECT ver. 1.7.0.79 © Analytik Jena AG рассчитаны их вторые производные. Это позволило установить характеристические полосы, соответствующие максимальному поглощению самого модельного соединения или продукта его окисления в фосфатном буферном растворе: для гваякола - при 470 нм (е470 =5000 М-1см-1), для феруловой кислоты -286 нм (е286 = 6707 М-1см-1), для ацетованилона - 274 нм (е274 = 8427 М-1см-1), для ванилинового спирта -230 нм (s230 = 6085 М-1см-1) [7, 8].
По полученным экспериментальным данным рассчитывали величину тангенса угла (tg а) наклона восходящего линейного участка кинетической кривой, построенной в координатах оптическая плотность (А) -время (t, с), и начальную скорость реакции (V0) по формуле (1) для гваякола и (2) для феруловой кислоты, ацетованилона и ванилинового спирта:
если ep > 0, то если ep = 0, то
dA/dt 1
tga
є p -єs Іє (є p -єs ) -1
(i)
Ac
At
AA J_
At Іє
tga l - є s
(2)
где tga - угол наклона кинетических кривых в координатах оптическая плотность (А) - время (1, сек); є- молярный коэффициент поглощения субстрата (є8) или продукта его окисления (єр) (М-1см-1); I - толщина кюветы (см)
На рисунке 1 представлены экспериментальные зависимости начальной скорости окисления от рН раствора. Экстремальный характер зависимости У0=/ (pH) в области рН 6,5-8,0 можно объяснить снижением активности различных каталитических групп фермента в этом диапазоне (рН-оптимум для пероксидазы хрена - 6,0).
6 6,5
рН
Рис. 1. Зависимости начальной скорости пероксидазного окисления модельных соединений пероксидом водорода от рН раствора. Ацетатный буферный раствор (4,5-5,5 рН), Фосфатный буферный раствор (5,5-8,0 рН); для гваякола: Сгв = 0,1 мМ, Сн2о2 = 1 мМ, Сн№= 2 нМ; для феруловой кислоты: Сфк = 0,1 мМ, Сн2о2 = 1 мМ, Сн№= 10 нМ; для ацетованилона: Сад= 0,1 мМ, Сн202 = 1 мМ, Сн№= 12 нМ; для ванилинового спирта: Свс = 0,1 мМ, Сн2о2 = 1 мМ, Сн№= 50 нМ
Зависимости начальной скорости реакции пероксидазного окисления модельных соединений от концентрации пероксидазы хрена, приведенные на рисунках 2-4, имеют классический вид выпуклой кривой, выходящей на плато (т.е. достигается кажущаяся предельная скорость, и увеличение концентрации фермента не влияет на величину начальной скорости реакции). Для дальнейших исследований в качестве оптимальной выбрали концентрацию пероксидазы, равную 2, 10, 12 и 50 нМ для гваякола, феруловой кислоты, ацетова-нилона и ванилинового спирта соответственно.
Зависимости начальной скорости реакций пероксидазного окисления модельных соединений от концентрации пероксида водорода представлены на рисунках 5-7. При малых концентрациях субстрата-окислителя эта зависимость носит линейный характер, что соответствует первому порядку реакции по основному субстрату. При концентрациях пероксида водорода (для гваякола > 5 мМ, феруловой кислоты > 10 мМ, ацетованилона > 6 мМ, ванилинового спирта > 0,03 мМ) кривая зависимости скорости реакции от его концентрации выходит на плато, т.е. порядок реакции по пероксиду водорода становится нулевым, что полностью соответствует схеме Михаэлиса-Ментен. С помощью линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен в координатах 8/У0 - 8 рассчитали кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (Кт эф) и максимальную скорость реакции (Ут эф). Для дальнейших исследований в качестве оптимальной выбрали концентрацию пероксида водорода 5 мМ, 10 мМ, 6 мМ и 0,03 мМ в реакции окисления гваякола, феруловой кислоты, аце-тованилона и ванилинового спирта соответственно.
При установленных оптимальных концентрациях пероксидазы (нИР) и пероксида водорода изучили влияние концентрации модельных соединений на начальную скорость реакции окисления. Из представленных на рисунках 8-10 данных видно, что зависимости аналогичны, полученным для пероксида водорода.
Для кинетической характеристики процесса пероксидазного окисления данных модельных соединений определяли Кт эф и Ут эф методом линеаризации уравнения Михаэлиса- Ментен в координатах 8/У0 - 8.
0,9 и 0,8 -,0,7Ц 0,6 -3 0,5 -2 0,4 -=“0,3 -'0,2 -0,1 -0 — 0
20
40 Chrp, нМ 60
80
10
Chrp, нМ
Рис. 2. Зависимость скорости реакции окисления ацетованилона от концентрации фермента (нИР): Сн2о2 - 6 мМ; Сац - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рН = 6,0
Рис. 3. Зависимость скорости реакции окисления ванилинового спирта от концентрации фермента (нИР): Сн2о2 - 0,03 мМ; СВС - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рН = 7,5
Рис. 4. Зависимость скорости реакции окисления гваякола / феруловой кислоты от концентрации фермента (нИР): для гваякола: Сн2о2 - 5 мМ;
Сгв - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рН = 6,0; для феруловой кислоты: Сн2о2 - 10 мМ; СФК - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рН = 6,0
Снир, нМ
Сн202, мМ
Рис. 5. Зависимость скорости реакции окисления феруловой кислоты от концентрации н2О2:
СниР= 10 нМ; СФК - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0
Сн202, мМ
Рис. 6. Зависимость скорости реакции окисления ванилинового спирта от концентрации н2О2: СниР= 50 нМ; СВС - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 7,5
Рис. 7. Зависимость скорости реакции окисления гваякола / ацетованилона от концентрации н2О2: для гваякола: СниР= 2 нМ;
Сгв - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0; для ацетованилона: СниР=
12 нМ; САЦ - 0,1 мМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0 Сн2°2, мМ
Анализ полученных экспериментальных данных, систематизированных в таблицах 1 и 2, показал, что максимум каталитической активности пероксидазы в реакции окисления модельных соединений лигнина пероксидом водорода наблюдается при различных соотношениях концентрации катализатора, субстрата-восстановителя и субстрата-окислителя, другими словами - отмечается разная реакционная способность выбранных модельных соединений лигнина в изучаемой реакции. Полученные значения Кт эф по субстрату-окислителю (И202), Кт эф по субстрату-восстановителю (н8), а также Ут эф , представленные в таблице 2, позволили подтвердить, что перок-сидазное окисление выбранных субстратов протекает с различной эффективностью.
С в.с., *106 М
Рис. 8. Зависимость скорости реакции окисления феруловой кислоты от ее концентрации:
Сн2О2 = 10 мМ; СниР= 10 нМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0
Рис. 9. Зависимость скорости реакции окисления ванилинового спирта от его концентрации:
Сн2О2 = 0,03 мМ; СниР= 50 нМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 7,5
Н
и
а
Сгв/ ац*104, М
Рис. 10. Зависимость скорости реакции окисления гваякола / ацетованилона от концентрации гваякола/ацетованилона: для гваякола: Сн2о2=5 мМ; СниР=
2 нМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0; для ацетованилона: С н2о2=6 мМ; СниР= 12 нМ; 0,1 М фосфатный буферный раствор с рн = 6,0
Таблица 1. Оптимальные концентрации компонентов реакции пероксидазного окисления модельных соединений
Субстраты (АН) X, нм Є, М-1см-1 Оптимальные концентрации рн
ШР, нМ Н202, мМ! АН, мМ
Гваякол 470 5000 2,00 5,00 0,12 6,0
Феруловая кислота 286 6707 10,00 10,00 0,10 6,0
Ацетованилон 274 8427 12,00 6,00 0,20 6,0
Ванилиновый спирт 230 6085 50,00 0,03 0,20 7,5
Таблица 2. Кинетические параметры реакции пероксидазного окисления модельных соединений
Субстрат
Кинетические Гваякол Феруловая кислота Ацетованилон Ванилиновый спирт
параметры (0,00)* (0,41)* (0,81)* (0,08)*
НБ Н2О2 НБ Н2О2 НБ Н2О2 НБ Н2О2
Уш эф*106 М/мин 538,00 105,00 3,22 9,97 87,70 90,20 500,22 96,10
Кт эф*105 М 7,90 20,30 8,84 119,00 0,84 16,80 5,39 13,64
* а-константы Гаммета заместителей в и-положении к ОНфен.
Данный факт можно объяснить с позиции структурных особенностей молекул модельных соединений лигнина, выбранных для исследования. известно, что основным реакционным центром данных субстратов является фенольный гидроксил-анион, а содержащиеся в молекуле группировки, находящиеся в а-положении про-пановой цепи, обусловливают различный характер распределения электронной плотности в молекуле [10].
Так, при введении в молекулу «-заместителя электронно-донорной природы (например, -Сн20н в ванилиновом спирте) происходит повышение электронной плотности в м- и «-положении по отношению к заместителю и, следовательно, увеличение отрицательного заряда у кислородного атома фенолят - аниона. Это приводит к росту окислительной способности модельных соединений в реакции их пероксидазного окисления. А при введении в молекулу «-заместителей электронно-акцепторной природы (например, -Сн=Сн-С00н у феруловой кислоты и -С0-Сн3 для ацетованилона), обладающих сильным отрицательным индуктивным эффектом, электронная плотность в ароматическом кольце понижается, что приводит к эффективной делокализации избыточного отрицательного заряда кислородного атома в сопряженной системе и снижению активности модельных соединений к пероксидазному окислению пероксидом водорода.
Для подтверждения разного влияния заместителей на реакционную способность модельных соединений можно использовать значения с-констант Гаммета, представленых в таблице 2 [11, 12]. Обнаружено, что фенолы, имеющие меньшее значение с, легче поддаются пероксидазному окислению. Исключение наблюдается для феруловой кислоты, что может быть связано с наличием в ее молекуле заместителя, содержащего сопряженную с ароматическим ядром двойную связь. Это приводит к отличиям в распределении электронной плотности и, следовательно, в реакционной способности. на основе изложенного, можно предположить, что реакционная способность модельных соединений к пероксидазному окислению убывает в ряду гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
Таким образом, проведенные исследования кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина свидетельствуют о том, что введение п-заместителей с различными донорно-акцепторными свойствами в молекулу модельного соединения в значительной степени влияет на активность реакционного центра - фенольной гидроксильной группы, а следовательно, и на способность органического соединения к перок-сидазному окислению.
Коллектив авторов выражает благодарность за оказанную помощь в обсуждении и представлении
результатов д.х.н., проф. Т.Н. Шеховцовой, Московский государственный университет им. Ломоносова, химический факультет, кафедра аналитической химии.
Список литературы
1. Боголицын К.Г., Айзенштадт М.А., Почтовалова А.С., Соболева Т.В. Трансформация лигнинных веществ в производственных, сточных и природных водах в зоне деятельности предприятий ЦБП // Физикохимия лигнина: Материалы II междунар. конф. Архангельск, 2007. С. 167-171.
2. Боголицын К.Г., Айзенштадт М.А., Почтовалова А.С., Шеховцова Т.Н. Применение ферментативного метода для оценки содержания фенольных компонентов в технологических, сточных и природных водах // Аналитика России: Материалы II Всерос. конф. по аналитической химии с междунар. участием. Краснодар, 2007. С. 318.
3. Айзенштадт М.А., Боголицын К.Г. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений // Химия растительного сырья. 2009. №2. С. 5-18.
4. Schmidt A., Schumacher J.T., Reichelt J., Hecht H-J., and Bilitewski U. Mechanistic and Molecular Investigations on Stabilization of Horseradish Peroxidase C // Anal. Chem. 2002. №74. Р. 3037-3045.
5. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. М., 1991. 544 с.
6. Klapper M., Hackett D.P. The Oxidatic Activity of Horseradish Peroxidase // The Journal of Biological Chemistry. 1963. V. 238. №11. Р. 3736-3742.
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., 1982. Т. 1. 389 с.
8. Айзенштадт М.А., Покрышкин С.А. Ферментативное определение модельных соединений лигнина гваяцильного ряда // Ломоносов: Материалы XV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. М., 2008. С. 122124.
9. Bogolitsyn K.G., Aizenshtadt M.A. Kinetics of enzyme catalyzed oxidation of lignin model compounds by horseradish peroxidase - hydrogen peroxide complex // 10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp EWLP. Stockholm, Sweden, 2008. P. 384-387.
10. Браунс Ф.Э. Химия лигнина / Ф.Э. Браунс, Д.А. Браунс. М., 1964. 540 с.
11. Справочник химика: В 3 т. Л., 1964. Т. 3. 1008 с.
12. Горбова Н.С. Кислотно-основные свойства родственных лигнину фенолов в системе вода-апротонный растворитель: Дис. ... канд. хим. наук. Архангельск, 2002. 120 с.
Поступило в редакцию 30 июля 2009 г.
