CC BY
50
УДК 547.565.2 1
С.А. Покрышкин1, К.Г. Боголицын1'2, А.С. Аксенов2
1 Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова 2Институт экологических проблем Севера УрО РАН
Покрышкин Сергей Александрович родился в 1987 г., окончил в 2009 г. Архангельский государственный технический университет, аспирант кафедры теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова. Имеет 2 публикации в области ферментативной кинетики и катализа.
E-mail: serge.physchem@yandex.ru
Боголицын Константин Григорьевич родился в 1949 г., окончил в 1971 г. Архангельский лесотехнический институт, доктор химических наук, профессор, директор ИЭПС УрО РАН, проректор по научной работе и заведующий кафедрой теоретической и прикладной химии Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова, заслуженный деятель науки РФ. Имеет более 480 научных работ в области развития фундаментальных принципов «зеленой» химии и разработки физико-химических основ процесса переработки древесины. E-mail: bogolitsyn@iepn.ru
Аксенов Андрей Сергеевич родился в 1982 г., окончил в 2004 г. Архангельский государственный технический университет, кандидат технических наук, зав. лабораторией химии растительных биополимеров ИЭПС УрО РАН. Имеет более 40 научных трудов в области химии биополимеров. E-mail: biopolimer@iepn.ru
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСЛЕНИЯ ГВАЯКОЛА В ВОДНОЙ И ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКОЙ СРЕДАХ
Определены кинетические параметры реакции пероксидазного окисления гваякола пероксидом водорода в водной и водно-органической средах. Изучено влияние состава буферного раствора на активность фермента пероксидазы хрена в среде вода-диметилсульфоксид на примере реакции окисления гваякола. Показано стабилизирующее действие фталатного буферного раствора на активность пероксидазы в среде вода-ДМСО.
Ключевые слова: ферментативная кинетика, пероксидаза хрена, диметилсульфоксид, гваякол.
Окисление гваякола пероксидазами в присутствии пероксида водорода представляет собой основу для широко распространенного колориметрического метода анализа с использованием ферментов. Однако природа
образующихся в ходе реакции окрашенных в коричневый цвет продуктов не до конца изучена. Кроме того, актуально изучение кинетических закономерностей окисления гваякола не только в водной, но и в водно-органической среде, в которой способны растворяться высокомолекулярные фенольные
соединения, например лигнины. Лучший бинарный растворитель для этих целей - смесь вода-диметилсульфоксид (ДМСО).
Пероксидаза из корней хрена (HRP), КФ 1.1.11.7 - гем-содержащий фермент, относящийся к классу пероксидаз растений, наиболее часто используется в биохимическом и медицинском анализах [2]. Гваякол является одним из природных субстратов для данного фермента, а также низкомолекулярным аналогом лигнина [4].
Цель данной работы - изучение влияния органического сорастворителя на кинетику процесса ферментативного окисления гваякола в водной
среде.
В работе использовали изоферментные препараты С2 и С3 пероксидазы хрена «BBI Enzymes» со спектральным показателем чистоты Rz = 2,30. Активность фермента определяли по скорости реакции окисления субстрата - гваякола пероксидом водорода [7].
Концентрацию пероксида водорода контролировали спектрофотометрическим методом с использованием УФ спектрофотометра Specord200 «Analytik Jena» по полосе поглощения 230 нм
© Покрышкин С.А., Боголицын К.Г., Аксенов А.С., 2012
(молярный коэффициент поглощения 72,7 М-1 хм-1). В качестве субстрата применяли гваякол производства «Sigma-Aldrich» Реактивы соответствовали квалификации «ос.ч.».
Реакцию пероксидазного окисления гваякола ((0,05... 1,70)-10-3 М) пероксидом водорода ((10...170)-10-6 М) проводили при температуре 25 °С в среде фосфатного, фталатного или ацетатного буферного раствора при концентрации ДМСО от 0 до 10 % мольн. Процесс инициировали введением пероксидазы хрена (0,05.1,00 ед./мл) при объеме реакционной смеси 3 мл. Спектры и кинетические кривые окисления гваякола записывали на двухлучевом спектрофотометре Specord200. Ход реакции контролировали по поглощению в области характеристической полосы продукта ферментативного окисления гваякола. По результатам измерений рассчитывали начальную скорость реакции и кинетические параметры - константу Михаэлиса (Кт) и максимальную скорость (¥т), характеризующие скорость образования и распада фермент-субстратного комплекса. Кинетические параметры ферментативной реакции определяли из зависимостей начальных скоростей от концентрации субстрата в двойных обратных координатах и в координатах Лайнуивера-Берка [3]. Молекулярно-массовые распределения были получены методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Стайер со спектрофотометрическим детектором производства «Аквилон».
3,0 р .
- А
§ 2,5 = >п
5 2,оЦЙ
9! §
и и г
О
°180 280 380 480 580 680
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения продуктов пероксидазного окисления гваякола в водной среде (время реакции 4 мин с интервалом 40 с; рН 6,0; концентрация Сгва = 1-10"3 М; СН2О2 = 0,1-10"6 М; CHRP =1 ед./мл)
Гваякол (2-метоксифенол) был использован как модельное соединение лигнина и классический субстрат пероксидазы хрена, применяемый для измерения ее активности [7]. Раствор гваякола в присутствии пероксида водорода стабилен. При добавлении в реакционную смесь пероксидазы хрена наблюдается увеличение оптической плотности в области 400.500 нм (рис. 1). В процессе ферментативного окисления в дифференциальных спектрах появляется максимум при 422 нм, отсутствующий в исходных. Он был использован в дальнейшем при кинетических исследованиях.
Продукт пероксидазного окисления гваякола, имеющий полосу поглощения 422 нм, может быть определен как 3,3'-диметокси-4,4'-бифенилхинон (рис. 2) [8]:
Э,3'-диметокси-4,4'-Вифенилхинон
Рис. 2. Молекулярно-мас-совое распределение продуктов ферментативного окис-
ления гваякола в водной среде (время реакции 30 с;
рН 6,0; Сгаа = 110-3 М; СШо2 = ' = 100-10-6 М; Снкр = 1 ед./мл)
Молекулярная масса
Поскольку ферментативное окисление гваякола - сложный процесс, идущий по смешанному ионно-радикальному механизму, в продуктах реакции присутствует не только данный димер, но и смесь олигомеров, что подтверждается полученным по методу ВЭЖХ молекулярно-массовым распределением образующихся в ходе реакции продуктов (рис. 2). Это объясняет отсутствие в ультрафиолетовых спектрах продуктов пероксидазного окисления гваякола изобестической точки и увеличение оптической плотности в широком диапазоне длин волн.
Как известно, пероксидаза хрена имеет ряд изоферментов, отличающихся между собой строением и каталитическими свойствами [9]. Поэтому было проведено сравнение ферментативной активности по отношению к гваяколу двух изоферментных препаратов (С2 и С3) пероксидазы хрена. Изучено влияние рН, концентраций субстратов и фермента на скорость реакции. рН, при котором достигалась наибольшая скорость реакции (рис. 3, а), определяли с использованием буферного раствора при концентрации фермента
Сщ.р = 0,2 ед./мл, гваякола Сгва = 1-10-3 М, пероксида водорода СН о2 =
= 100-10-6 М. Полученные зависимости имеют колоколообразную форму с пологим максимумом в диапазонах 5,5...6,5 для изофермента С3 и 6,0...6,5 для изофермента С2. Исследование влияния концентрации фермента (рис. 3, б) осуществляли при концентрации пероксида водорода 100-10-6
6,0). Поскольку в дальнейшем
М и концентрации гваякола 1-10"3 М в фосфатном буферном растворе (рН скорость реакции с ростом концентрации фермента линейно возрастала, использовали концентрацию,
соответствующую линейному ходу реакции в течение 3.5 мин (0,2 ед./мл). Влияние концентрации пероксида водорода (рис. 3, в) изучали при концентрации гваякола 1-10-3 М и концентрации фермента 0,2 ед./мл в фосфатном буферном растворе (рН 6,0). Зависимости начальной скорости реакции от концентрации пероксида водорода для двух изоферментов имеют вид прямой с выходом на плато при концентрации пероксида водорода (120.130)-10-6 М. Использование пероксида водорода концентрацией более 150-10-6 М приводит к снижению скорости реакции, что вызвано ингибированием фермента избытком субстрата-окислителя [3]. Влияние
концентрации гваякола (рис. 3, г) изучали при концентрации пероксида водорода 100-10-6 М и концентрации фермента 0,2 ед./мл в среде фосфатного буферного раствора (рН 6,0). Для гваякола также отмечена линейная зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата, которая выходила на плато при концентрации гваякола 0,8-10-3 М. Дальнейшего увеличения концентрации ингибирования избытком субстрата не наблюдалось.
Для исследования активности фермента в водно-органической среде был выбран изофермент С2, обладающий большей каталитической активностью. Для данного изофермента определены оптимальное значение рН, равное 6,0, и концентрации субстратов, соответствующие максимальной скорости реакции: 100-10-6 М - для пероксида водорода, 1-10-3 М - для гваякола (рис. 4).
Полученные данные свидетельствуют о высокой активности фермента по отношению к низкомолекулярным фенолам в водной среде. Для окисления высокомолекулярных фенольных соединений перспективно использовать водно-органическую среду, в которой они имеют большую растворимость. Для проведения реакции в среде смешанного водно-органического
Рис. 3. Зависимость начальной скорости реакции от рН раствора (а); концентраций фермента (б), пероксида водорода (в) и гваякола (г): 1 -препарат С2,
растворителя, как показано в [1, 5, 6], одним из основных способов адаптации фермента и сохранения активности является иммобилизация или включение его в полиэлектролитный комплекс, в частности, с хитозаном. Поскольку на процесс образования полиэлектролитного комплекса с пероксидазой влияет состав буферного раствора [1], нами было исследовано его действие на реакционную способность нативной пероксидазы в водно-органической среде. В качестве буферных растворов использовали фосфатный, фталатный и ацетатный, имеющие следующие характеристики: рН 6,0, ионная сила 0,1 моль/л, концентрация ДМСО - от 0 до 10 % мольн., фермента - Сжр = 0,8 ед./мл.
Как видно из полученных результатов (рис. 4), состав буферного раствора оказывает сильное влияние на кинетические параметры реакции. Так, при использовании фталатного
Рис. 4. Зависимость кинетических констант Vm (а, в) и ^ (б, г) ферментативной реакции от концентрации ДМСО и вида буферного раствора: а, б - гваякол, в, г - пероксид водорода; 1 - фталатный буферный раствор, 2 -фосфатный,
3 - ацетатный
- " = 30
? =25 2 220
-'lis
II
т 100 % ¡8« 7_ .С 60 ¿ '7-40 £20 I 0
U-2
я-з
0 % 1 % 5 % 10 %
i
О % 1 % 5 % 10 %
1 ч 250 л 200 I 150 ."100 о 50
J °
ч 250 £ 200
1 150 , - 100
2 50
о
Ык
.ГУ—.
0 % 1 % 5 % 10 % б
1ш
i гтм i гь*. i
0% 1 % 5 % 10%
буферного раствора в водной среде полученные кинетические константы (Km и Vm) на 20.60 % больше, чем при использовании фосфатного или ацетатного. Введение 1 % ДМСО приводит к снижению констант реакции в среднем на 40.80 %, при этом уменьшается разница между константами, вызванная влиянием буферных растворов, что можно объяснить сильным воздействием органической фазы на фермент. В тоже время, добавка ДМСО оказывает сравнительно меньшее воздействие на активность пероксидазы во фталатном буферном растворе, что говорит о некотором стабилизирующем действии фталат-иона. При сравнении полученных кинетических параметров реакции установлено, что наиболее сильно в присутствии ДМСО фталат-ион стабилизирует взаимодействие фермента с гваяколом, но не оказывает заметного влияния на комплекс пероксиадза-пероксид водорода.
Таким образом, проведенные исследования кинетических свойств фермента в водно-органической среде показали снижение скорости реакции ферментативного окисления гваякола в присутствии нативной пероксидазы хрена при увеличении содержания ДМСО в растворе. Подтверждено предположение о влиянии состава буферного раствора на реакционную способность фермента и его стабильность в органической фазе. Установлено, что наибольшее стабилизирующее воздействие на фермент оказывает фталатный буферный раствор. Для дальнейшего увеличения стабильности биокатализатора необходимо переводить его в иммобилизованное состояние. Перспективным методом является включение пероксидазы в полиэлектролитный комплекс с хитозаном.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Веселова И.А., Кирейко А.В., Шеховцова Т.ДПовышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т.45, № 2. С. 143-148.
2. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 303-322.
3. ДиксонМ, Уэбб Э. Ферменты / пер. с англ. В 3 т. Т. 1. М.: Мир, 1982. 389 с.
4. Физическая химия лигнина / К.Г. Боголицын [и др.]. М.: Академкнига, 2010. 492 с.
5. Яблоцкий К.В. Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определения ее ингибиторов и субстратов: автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 2010. 28 с.
6. Azevedo Anna M., Durate M.F. Stability of free and immobilized peroxidase in aqueous-organic solvent mixtures // J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. N 15. Р. 147-153.
7. Bergmeyer H. U. Methods of enzymatic analysis 2nd Edition. New York: Academic Press, 1974. 495 p.
8. Doerge D.R., Divi R.L., ChurchwellM.I. Identification of the colored guaiacol oxidation product produced by peroxidases // Analytical biochemistry. 1997. N 250. Р. 10-17.
9. Torres E., Ayala M. Biocatalysis based on heme peroxidases. Berlin-Heidelberg: Springer, 2010. 358 p.
Поступила 20.10.11
S.A. Pokryshkin1, K.G. Bogolytsyn1'2, A.S. Axenov2
Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov
2Institute of Ecological Problems of the North, Ural Division of RAS
Kinetic Regularities Parameters of Guaiacol Enzymic Oxidation in the Aquatic and Water-Organic Mediums
Kinetic parameters of peroxidase oxidation reaction of guaiacol by the hydrogen peroxide in the aquatic and water-organic mediums have been characterized. Effect of buffer solution composition on the enzymatic activity of horseradish peroxidase in the water-dimethyl
sulfoxide medium has been studied. Stabilizing effect of phthalate buffer solution on the peroxidase activity is shown.
Key words: fermentative kinetics, horseradish peroxidase, dimethyl sulfoxide, guaiacol.
