CC BY
25
© Горбачева С. В.
УДК: 616-008.921.7:[57.042.2+616.8-091.818]]-092.4 Горбачева С. В.
ОГРАНИЧЕНИЕ НИТРОЗАТИВНОГО СТРЕССА В УСЛОВИЯХ IN VITRO
ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ МОДУЛЯТОРОВ ТИОЛ-ДИСУЛЬФИДНОЙ СИСТЕМЫ
Запорожский государственный медицинский университет (г. Запорожье)
swg18@yandex.ua
Работа выполнялась на кафедре фармакологии и медицинской рецептуры Запорожского государственного медицинского университета в рамках госбюджетной темы «Молекулярно-биохимические механизмы формирования митохондриальной дисфункции нейронов головного мозга в условиях острой церебральной ишемии: новые мишени для нейропротекции» (№ государственной регистрации 0113, шифр 11000797).
Вступление. Существенная роль в механизмах гибели нейронов при ишемическом повреждении и развитии глута мат-кальциевого каскада принадлежит ЫО-опосредованным механизмам. Открытие ЫМЮА- рецепторов, которое происходит на фоне токсичных концентраций глутамата, вызывает поток ионов кальция внутрь клеток. Это в свою очередь вызывает активацию кальций-зависимой изофор-мы ЫО-синтазы и усиленное образование оксида азота, который участвует в повреждении нейронов. Механизм токсичности N0 включает ковалентную модификацию белков при взаимодействии с их ти-оловыми группами, а также непосредственное повреждение ДНК [5].
Особое внимание в инициации клеточной гибели уделяется тиол-дисульфидной системе (ТДС), в частности, относительно расширения представлений о механизмах цитотоксичности оксида азота. Интермедиаты ТДС обладают транспортными свойствами в отношении N0, повышая его биодоступность. Кроме того, большинство тиолов (глу-татион, цистеин, метионин) способны значительно ограничивать цитотоксичность N0 и его дериватов. Конкурентно связываясь с N0, глутатион образует комплекс в виде Б-нитрозоглутатиона, который является депо эндогенного N0. Эта реакция предупреждает связывание молекулы N0 с супероксидом и предотвращает образование пероксинитри-та, как наиболее токсичного соединения для клетки. Избыток N0 взаимодействует с гемовым железом и парными тиоловыми группами с образованием динитрозольного комплекса железа (□N10). Известно, что □МО является более сильным нитрози-лирующим агентом по сравнению с оксидом азота и взаимодействует с тиоловыми группами белков, гистидином, аспартатом, глутамином, метионином, цистеином, глутатионом. В результате образуются N и Б-нитрозотиолы [2].
Глутатион - один из основных внутриклеточных тиоловых соединений, который синтезируется
почти во всех клетках. Важное значение глутатиона в редокс-зависимых процессах определяется его участием в регуляции активности транскрипционных факторов, а также тем, что он является внутриклеточным антиоксидантом и играет роль «ловушки» свободных радикалов, является косубстратом в реакциях детоксикации пероксидов, катализируемых глутатионпероксидазой (ГПО), глутатионре-дуктазой (ГР) и глутатионтрансферазой (GST). Сохранение оптимального для клетки соотношения восстановленного глутатиона (GSH) к окисленному (GSSG) является важным условием для ее жиз неспособности [4,9].
Целью данного исследования является изучение возможных механизмов прерывания пато-биохимических реакций нитрозативного стресса в условиях in vitro путем введения в инкубационную нейрональную среду модуляторов тиол-дисульфид-ной системы.
Объект и методы исследования. Для исследований in vitro нейроны выделяли из коры головного мозга 4-недельных белых беспородных крыс. Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями о гуманном отношении к экспериментальным животным, согласно «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, которые используются в экспериментальных и других целях». Выделение обогащенных фракций нейронов и нейроглии проводилось в два этапа. На первом этапе мозговая ткань дезинтегрировалась с целью получения клеточной суспензии, на втором - осуществлялось дифференциальное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы и фикола. Для получения нейронов и нейроглии крыс декапитирова-ли, быстро вынимали мозг. Кору головного мозга отделяли от белого вещества, измельчали и переносили в раствор, содержащий 7,5% поливинилпир-ролидона (ПВП), 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 10 мМ СаС12. Полученную суспензию фильтровали через три сита под незначительным давлением для уменьшения потерь нейрональных клеток. После последовательного пропускания через сита клеточную суспензию наслаивали на градиент, состоящий из 1 М и 1,75 М сахарозы. Центрифугирование проводили при 60 000 g в рефрижераторной центрифуге VAC-25. В результате центрифугирования получали два слоя и плотный осадок. Верхний слой представлен остатками миелиновых оболочек, второй слой состоял из глиальных и нейрональных
клеток. Осадок представлен телами нейронов со степенью чистоты 90%. В дальнейшем проводили дополнительную очистку второго слоя путем повторной фильтрации и ультрацентрифугирования. Выделенные нейрональные клетки отмывали от сахарозы и альбумина охлажденным физиологическим раствором [6].
Для моделирования нитрозативного стресса в инкубационную среду в токсической концентрации (250 мкмоль) вносили динитрозольний комплекс железа (DNIC) [8]. После внесения инициирующего агента образцы инкубировали в течение 60 мин при температуре 370C. С целью изучения влияния модуляторов тиол-дисульфидной системы на ограничение реакций нитрозативного стресса исследуемые препараты вносили в инкубационную среду за 10 минут до добавления DNIC.
Выраженность нитрозативного стресса в ней-рональной суспензии оценивали по накоплению нитротирозина, который определяли иммунофер-ментным методом с использованием стандартного тест-набора «Nitrotirosine ELISA Kit» («HyCult biotechnology», Нидерланды) в соответствии с прилагаемой к набору инструкции.
Состояние системы глутатиона оценивали по содержанию его окисленной и восстановленной формы, а также по активности ключевых ферментов его метаболизма - глутатионредуктазы (ГР), глутатион^-трансферазы (Г-S-T) и глу-татионпероксидазы (ГПО). Содержание окисленного и восстановленного глутатиона определяли флюориметрически [8]. Активность ГР, Г-S-T и ГПО определяли спектрофотометриче-ски [1]. Выраженность оксидативного стресса оценивали по накоплению альдегидных (АФГ) и кетонных (КФГ) производных белковых молекул в реакции с динитрофенилгидразином [8].
Результаты исследования обработаны с использованием статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA® for Windows 6.0», а также «Microsoft Excel 2010». Статистическую обработку проводили с применением t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни. Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия с уровнем значимости менее 0,05 (95%) [7].
Результаты исследования и их обсуждение. Проведенные исследования показали, что внесение DNI C в концентрации 250 мкг/мл приводило к повышению маркера нитрозативного стресса - нитротирозина в 3,05 раза (табл. 1). Кроме того, наблюдалось смещение тиол-дисульфидного равновесия в сторону окисленных тиолов, о чем свидетельствует снижение уровня глутатиона восстановленного (в 5,1 раз) и увеличение в 3,05 раза его окисленной формы, на фоне снижения активности ключевых ферментов тиол-дисульфидной системы - Г-S-T - в 3,9 раза, ГР - в 2,7 и ГПО -
в 3,46 раз по отношению к интактным пробам на 60 минуту инкубации (табл. 2).
Развитие нитрозативного стресса вызывает снижение уровня восстановленного глутатиона за счет взаимодействия последнего с цитотоксическими дериватами N0. В подобную реакцию вступают тиоловые группы белков и пептидов, в результате чего образуются ^нитроамины, о чем может свидетельствовать повышение содержания нитротирозина. Некоторыми исследованиями установлено, что транспорт N0 происходит с образованием ^03, который затем нитрозилирует тиолы, еще более истощая запасы глутатиона и смещая тиол-дисуль-фидное равновесие [2,3]. Кроме того, неконтролируемый рост активных метаболитов N0 приводит к окислению белков и инактивации ферментов, что еще более истощает антиоксидантную систему нейрона. Подтверждением этому служит выявленный рост маркеров окислительной модификации белков. Так, уровень ранних маркеров повреждения белковых молекул - альдегидных производных увеличивался в 1,9 раз, а содержание более поздних кетопроизводных возростал в 2,4 раза на 60 минуту инкубации после внесения □N10 (табл. 1).
Введение в инкубационную среду модуляторов тиол-дисульфидной системы - тиотриазолина, тио-цетама, ангиолина и а-липоевой кислоты вызывало положительный эффект в отношении изучаемых показателей. Выявленное влияние используемых препаратов было разным по выраженности, но носило однонаправленный характер. Наиболее активным в ходе исследования был ангиолин. Внесение этого модулятора способствовало сохранности тиол-дис-ульфидного равновесия. Из таблицы 2 следует, что внесение ангиолина способствовало повышению восстановленного глутатиона в 3,7 раз и снижение окисленной формы в 2,4 раза. Положительный эф-
Таблица 1.
Показатели оксидативного и нитрозативного стресса в нейрональной суспензии через 60 минут после внесения DNIC (250мкг/мл)
Показатель АФГ, у.е./г белка КФГ, у.е./г белка Нитротирозин, нмоль/г белка
Интактная суспензия 6,59 ± 2,09 3,02 ± 0,45 12,15 ± 2,18
Суспензия с добавлением ^N10 12,51 ± 1,31* 7,27 ± 1,01* 37,16 ± 4,99*
Суспензия с добавлением ^N10 + тиоцетам 10,07 ± 1,17# 4,95 ± 0,68# 25,22 ± 1,88#
Суспензия с добавлением ^N10 + ангиолин 8,58 ± 1,21 # 4,36 ± 0,59# 18,74 ± 2,03#
Суспензия с добавлением ^N10 +тиотриазолин 10,57 ± 0,72# 4,84 ± 0,57# 25,85 ± 1,22#
Суспензия с добавлением ^N10 + липоевая кислота 11,63 ± 1,03 5,74 ± 0,75# 30,03 ± 2,05
Примечание: * - р < 0,05 по отношению к интактной суспензии; # - р < 0,05 по отношению к суспензии с добавлением DNIC
Таблица 2.
Состояние тиол-дисульфидной системы в нейрональной суспензии через 60 минут после внесения DNIC (250мкг/мл)
Показатель Глутатион восстановл., мкмоль/л Глутатион окисленный, мкмоль/л ГПО, ммоль/ (мин.* г белка) Г-S-l", ммоль/ (мин.* г белка) ГР, ммоль/ (мин.* г белка)
Интактная суспензия 2,98 ± 0,34 0,148 ± 0,024 19,07 ± 1,93 26,20 ± 3,07 12,03 ± 2,05
Суспензия с добавлением ^N10 0,58 ± 0,2* 0,452 ± 0,096* 5,5 ± 0,7* 6,73 ± 1,48* 4,42 ± 1,52*
Суспензия с добавлением ^N10 + тиоцетам 1,83 ± 0,23# 0,284 ± 0,039# 10,58 ± 1,12# 16,68 ± 2,41# 7,31 ± 0,64#
Суспензия с добавлением ^N10 + ангиолин 2,14 ± 0,14# 0,186 ± 0,035# 12,6 ± 1,46# 20,16 ± 1,62# 9,25 ± 1,2#
Суспензия с добавлением ^N10 +тиотриазолин 1,5 ± 0,15# 0,265 ± 0,032# 9,44 ± 1,47# 15,85 ± 1,48# 7,05 ± 0,93#
Суспензия с добавлением ^N10 + липоевая кислота 1,06 ± 0,12# 0,339 ± 0,057# 7,59 ± 1,08 11,9 ± 1,43# 6,12 ± 0,81#
Примечание: * - р < 0,05 по отношению к интактной суспензии; # - р < 0,05 по отношению к суспензии с добавлением DNIC
фект выявлен и в отношении ферментов системы глутатиона, на что указывает повышение активности изучаемых ферментов: ГПО - в 2,3 раза, Г-S-T -в 3 раза, ГР - в 2,1 раза (табл. 2). Следствием такого действия явились более низкие уровни ни-тротирозина и маркеров окислительной модификации белков (табл. 1).
Применение других модуляторов также ограничивало реакции нитрозативного стресса за счет стабилизирующего влияния на тиол-дисульфидное равновесие.
Выводы
Из выше изложенного следует, что применение модуляторов тиол-дисульфидной системы в условиях нитрозативного стресса способствует сохранности оптимального соотношения восстановленной и окисленной форм глутатиона. Это приводит к активной мобилизации тиол-дисульфидной системы и нейтрализации продуктов свободно-радикального окисления. Кроме того, увеличение функциональности ТДС в условиях нитрозативного стресса в условиях in vitro способствует повышению биодо-
ступности оксида азота, а также уменьшает цитоток-сичность его активных дериватов, что проявлялось в виде снижения уровня нитротирозина. Вероятно, что в условиях нитрозативного и оксидативного стресса, благодаря указанным механизмам, изученные средства увеличивают устойчивость нервной ткани к явлениям ишемии.
Таким образом, полученные нами результаты раскрывают значение глутатионовой системы нейрона как важной мишени нейропротективной терапии при состояниях, которые сопровождаются гиперпродукцией оксида азота и нарушением его биодоступности, а также являются экспериментальным обоснованием для клинического применения модуляторов тиол-дисульфидной системы.
Перспективами дальнейших исследований является изучение эффективности тиол-содержащих препаратов на других моделях гипоксическо-го повреждения мозга и других тканей организма в опытах in vitro и in vivo, с целью раскрытия их регулирующего влияния на процессы метаболизма и поддержание жизнеспособности.
Литература
1. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа / В. С. Асатиани. - М.: «Наука», 1969. - 739 с.
2. Беленичев И. Ф. Нейропротекция и нейропластичность / И. Ф. Беленичев, В. И. Черний, Е. А. Нагорна [и др.]. - Киев: Логос,
2015. - 512 с.
3. Василенко К. П. Окислительный глутатион вызывает активацию рецептора эпидермального фактора роста и МАР-киназ
ERK 1,2 / К. П. Василенко, Е. Б. Бурова, В. Г. Антонов // Цитология - 2006. - Т. 48, № 6. - С. 500 - 507.
4. Калинина Е. В. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов /
Е.В. Калинина, Н. Н. Чернов, М. Д. Новичкова // Успехи биол. наук. - 2014 - Т. 54. - С. 299 - 348.
5. Луцкий М. А. Окислительный стресс в патогенезе инсульта /М. А. Луцкий, Р. В. Тонких, А. П. Анибал // Журнал неврологии и
психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2007. - Т. 107, С. 37 - 42.
6. Прохорова М. И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / М. И. Прохоро-
ва. - Л.: Изд-во Ленинградского университета. - 1982. - 272 с.
7. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /
О.Ю. Реброва. - М., Медиасфера, 2002, 312 с.
8. Чекман И. С. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов /
И.С. Чекман, Ю. И. Губский, И. Ф. Беленичев. - К.: ГФЦ МОЗ Украины, 2010. - 81 с.
9. Mari M. Mitochondrial glutathione: features, regulation and role in disease / M. Mari, A. Morales, A. Colell, C. Gar^a-Ruiz //
Biochimica et Biophysica Acta - 2013. - Vol.1830. - P. 3317 - 3328.
УДК: 616-008.921.7:[57.042.2+616.8-091.818]]-092.4
ОБМЕЖЕННЯ Н1ТРОЗАТИВНОГО СТРЕССУ В УМОВАХ IN VITRO ШЛЯХОМ ВИКОРИСТАННЯ МОДУЛЯТОР1В Т1ОЛ-ДИСУЛЬФ1ДНОТ СИСТЕМИ
Горбачова С. В.
Резюме. Використання модуляторiв тiол-дисульфiдноI системи в умовах ытрозативного стресу сприяе збереженню тiол-дисульфiдноI рiвноваги. Використанi препарати пщвищують бiодоступнiсть оксиду азоту та зменшують цитотоксичнiсть його активних дерива^в. Найбiльш активним серед доогмджуваних засобiв виявився ангiолiн, використання якого сприяло збшьшенню вiдновленого глутатiона в 3,7 разiв на фонi зни-ження окислено! форми у 2,4 рази. Позитивний ефект спостер^ався у вщношеннф активностi ферментiв -глутатiонпероксидази, глутатюн-З-трансферази та глутатiонредуктази. Наслiдком тако! дм було зменшення рiвню нiтротирозину на 49,6% и маркерiв окисно! модифкацп бiлкiв в середныому на 35%.
Ключовi слова: нiтрозативний стресс, суспензiя нейронiв, тiол-дисулыфiдна система, глутатiон, моду-лятори
УДК: 616-008.921.7:[57.042.2+616.8-091.818]]-092.4
ОГРАНИЧЕНИЕ НИТРОЗАТИВНОГО СТРЕССА В УСЛОВИЯХ IN VITRO ПУТЕМ ПРИМЕНЕНИЯ МОДУЛЯТОРОВ ТИОЛ-ДИСУЛЬФИДНОЙ СИСТЕМЫ
Горбачева С. В.
Резюме. Использование модуляторов тиол-дисулыфидной системы в условиях нитрозативного стресса способствует сохранности тиол-дисулыфидного равновесия. Использованные препараты повышают био-доступносты оксида азота и снижают цитотоксичносты его активных дериватов. Наиболее активным среди изучаемых препаратов был ангиолин. Его применение способствовало увеличению восстановленного глу-татиона в 3,7 раза и снижению его окисленной формы в 2,4 раза. Положительный эффект отмечался в отношении активности ферментов - глутатионпероксидазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы. Следствием такого влияния было снижение уровня нитротирозина на 49,6% и маркеров окислительной модификации белков в среднем на 35%.
Ключевые слова: нитрозативный стресс, нейрональная суспензия, тиол-дисульфидная система, глу-татион, модуляторы
UDC: 616-008.921.7:[57.042.2+616.8-091.818]]-092.4
NITROSATIVE STRESS RESTRICTION IN VITRO CONDITIONS USING MODULATORS OF THIOL-DISUL-FIDE SYSTEM
Gorbacheva S. V.
Abstract. Particular emphasis in cell death initiation is placed on thiol-disulfide system and its significance in cytotoxity mechanisms of nitric oxide. TDS intermediates have transport properties in relation to NO and increase its bioavailability. Besides, most of the thiols are able to restrict significantly NO and its derivatives cytotoxity. Glutathione forms s-nitrosoglutathione complex having a competitive fixation with NO, which is the depot of endogenous NO. This reaction anticipates a fixation of NO molecule with superoxide and prevents a formation of peroxynitrite, which is the most toxic compound for a cell. NO excess interacts with heme iron and binate thiol groups with a formation of dinitrosole iron combination (DNIC). It is known that DNIC is the most strong nitrosylating agent in comparison with nitric oxide and it interacts with thiol groups of proteins.
The purpose of the given investigation is to study possible mechanisms of interruption of nitrosative stress pathobiochemical reactions in conditions in vitro by means of thiol-disulfide system modulators introduction into an incubating neuronal medium.
The neurons were released from the cerebral cortex of 4 weeks old white rats for the investigations in vitro. For a modeling of nitrosative stress into an incubating medium in a toxic concentration (250 mcmole) it was included the dinitrosole iron combination (DNIC). The performed investigations showed that DNIC introduction in concentration 250 mcg/mL caused the increase of nitrosative stress marker - nitrotyrosine in 3,05 times. Besides, it was observed thiol-disulfide balance shift into the side of oxidized thiols that is proved by the decrease of the reduced glutathione level (in 5,1 times) and the increase of its oxidized form in 3 times in case of the reduction of key enzymes activity of glutathione system - glutathione-S-transferase - in 3 times, glutathione reductase - in 2,7 times and glutathione peroxidase - in 3,46 times. Introduction thiol-disulfide system modulators such as thiotriazoline, tiocetam, angioline and a-lipoic acid into an incubating medium caused a positive effect relative to studying characteristics. Revealed effect of the used drugs was various by its intensity and was unidirectional. Angioline was the most active during the investigation. Introduction of the given modulator promoted a maintenentce of thiol-disulfide balance. Introduction of angioline promoted the increase of the reduced glutathione in 3,7 times and the decrease of the oxidized form in 2,4 times. Positive effect was also revealed according to the glutathione system enzymes. The increase of activity of the enzymes such as glutathione peroxidase (in 2,3 times), glutathione-S-transferase (in 3 times) and glutathione reductase (in 1 time) pointed to a positive effect that was also revealed according to the glutathione system enzymes A consequence of the given action were more low levels of nitrotyrosine and markers of oxidative protein modification.
Application of thiol-disulfide system modulators in conditions of nitrosative stress promotes maintenance of optimal proportion of reduced and oxidized glutathione forms. That leads to active mobilization of thiol-disulfide
system and neutralization of products of free-radical oxidation. Besides, the increase of thiol-disulfide system functionality in conditions of nitrosative stress in vitro conditions promotes the increase of bioavailability of nitric oxide and also decreases cytotoxity of its active derivatives that is shown in the decrease of nitrotyrosine level. Probably, in conditions of nitrosative and oxidative stresses due to the mentioned above mechanisms all studied resources increase cerebral tissue stability to ischemic phenomena.
The obtained results reveal a significance of glutathione system of a neuron as an important target of neuroprotective therapy in conditions accompanied by nitric oxide hyperproduction and disturbance of its bioavailability. Also these results are considered to be an experimental substantiation for clinical application of thiol-disulfide system modulators.
Keywords: nitrosative stress, neuronal suspension, thiol-disulfide system, glutathione, modulators.
Рецензент - проф. Костенко В. О.
Стаття надшшла 22.10.2015 року
