Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной Escherichia coli Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019

Юшин Ю.В., Подкопайло Р.В., Петрова Д.А., Егоров К.А., Трухин В.П.

ОБЗОР ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ КУЛЬТИВАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ESCHERICHIA COLI

Федеральное государственное унитарное предприятие «Санкт-петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства, 198320, Санкт-Петербург, г. Красное село

Данная обзорная статья посвящена мировому опыту использования стандартизированных питательных сред, подходящих для эффективного культивирования рекомбинантной Escherichia coli с целью получения от культуры оптимальных объемов выхода целевого продукта. Кишечная палочка является универсальным организмом для синтеза белковой массы. Согласно устоявшейся технологии в бактериальную культуру посредством плазмид вводятся гены синтеза целевого белка, что позволяет осуществлять биологический синтез необходимых протеиновых молекул в промышленных объемах для последующего выделения необходимых в производстве ферментов. В мировой практике биотехнологии также разработаны эффективные системы для синтеза в E. coli рекомбинантных белков. Модифицированные культуры клеток используют при разработке вакцин, для синтеза иммобилизованных ферментов и решения многих других производственных задач. Условия культивирования оказывают немалое влияние на скорость роста колонии, ее качественные показатели, особенности протекания внутренних процессов и итоговое значение синтеза целевого белка. В связи с необходимостью столь точного прогноза результатов биотехнологического процесса для конкретных задач целесообразно использовать определенные питательные среды, тем самым снижая количество неизвестных факторов производства. В статье рассмотрен современный опыт применения наиболее распространенных и актуальных для биотехнологических производств питательных сред, их состав, методики приготовления и нормы расхода. Представлены результаты исследований зависимости эффективности синтеза молекул целевого пептида от количества определенных компонентов, входящих в состав сред. Обозначено влияние на синтез белка и колониальный рост некоторых физических факторов, сопутствующих процессам биотехнологического производства.

Ключевые слова: Escherichia coli; питательные среды; LB; TB; SB; SOB; SOC; 2хYT;

NZCYM.

Для цитирования: Юшин Ю.В., Подкопайло Р.В., Петрова Д.А., Егоров К.А., Трухин В.П. Обзор питательных сред, используемых для культивации рекомбинантной Escherichia coli. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(3): 444-453.

Для корреспонденции: Юшин Юрий Владимирович, ведущий специалист отдела науки и инноваций Департамента разработки и исследований ФГУП «СПбНИИВС» ФМБА России, 198320, Санкт-Петербург, г. Красное село. E-mail: y.v.yushin@spbniivs.ru

Yushin Yu.V., Podkopailo R.V., Petrova D.A., Egorov K.A., Trukhin V.P.

REVIEW OF NUTRIENT MEDIA USED FOR CULTIVATION OF RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI

Saint-Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Sera of the Federal Medical Biological Agency, Saint-Petersburg, 198320, Russian Federation

This review article is devoted to the world experience of using standardized nutrient media suitable for the effective cultivation of recombinant Escherichia coli in order to obtain the optimum yield from the culture of the target product. E. coli is a universal organism for the synthesis ofprotein mass. According to the established technology, the genes of target protein synthesis are introduced into the bacterial culture by means ofplasmids, which provides a biological synthesis of the necessary protein molecules in industrial volumes for the subsequent isolation of the necessary enzymes in the production. In the world practice of biotechnology, effective systems for the synthesis of recombinant proteins in E. coli have also been developed. Modified cell cultures are used in the development of vaccines, for the synthesis of immobilized enzymes and the solution of many other industrial problems. Cultivation conditions have a significant impact on the growth rate of the colony, its quality indices, the characteristics of the

MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES

internal processes and the final value of the synthesis of the target protein. In connection with the need for such an accurate forecast of the results of the biotechnological process for specific tasks, it is advisable to use certain nutrient media, thereby reducing the number of unknown factors ofproduction. The article describes the modern experience of application of the most common and relevant nutrient media for biotechnological production, their composition, preparation methods, and consumption rates. The results of studies of the dependence of the efficiency of the synthesis of molecules of the target peptide on the number of certain components that make up the media are presented. There is indicated an influence on protein synthesis and colonial growth of some physical factors associated with the processes of biotechnological production.

Keywords: Escherichia coli; nutrient media; LB; TB; SB SOB, SOC, 2хYT, NZCYM.

For citation: Yushin Yu.V, Podkopailo R.V., Petrova D.A., Egorov K.A., Trukhin V.P. Review of nutrient media used for cultivation of recombinant Escherichia coli. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(3): 444-453. (In Russian).

For correspondence: Yuri V. Yushin, Leading Specialist, Department of Science and Innovation, Department of Development and Research of the Saint-Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Sera of the Federal Medical Biological Agency, Saint-Petersburg, 198320, Russian Federation. E-mail: y.v.yushin@spbniivs.ru

Information about authors:

Yushin Yu.V, https://orcid.org/0000-0002-3462-0270; Podkopailo R.V., https://orcid.org/0000-0002-3235-7640; Petrova D.A., https://orcid.org/0000-0001-7283-2146; Trukhin V. P.,https://orcid.org/0000-0002-6635-363X

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: April 23, 2019 Accepted: September 09, 2019

Введение

Кишечная палочка (Escherichia coli) - гра-мотрицательная палочковидная бактерия, обитающая в нижней части кишечника теплокровных организмов. Большинство штаммов E. coli безвредны, но серотип O157:H7 патогенный и может вызывать тяжелые пищевые отравления. Штаммы в норме являются частью флоры кишечника животных и человека. Польза для организма хозяина состоит в способности синтезировать некоторые витамины, например группы K, а также предотвращать развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике. Кишечная палочка легко культивируется в условиях лаборатории и является одним из самых изученных прокариотических микроорганизмов, поэтому используется во многих отраслях науки.

Кишечная палочка - универсальный организм для синтеза чужеродных белков [1]. Посредством плазмид в нее вводятся чужие гены, что позволяет осуществлять биосинтез белков для промышленной ферментации [2]. Также разработаны системы для синтеза в E. coli ре-комбинантных белков [3]. Модифицированные культуры клеток используют при разработке

вакцин, для синтеза иммобилизованных ферментов и решения многих других производственных задач [4].

Результативность культивирования может разниться в зависимости от используемой питательной среды. Многолетним опытом подтверждено, что условия роста колонии играют ключевую роль в оптимизации производства желаемого белка. Следовательно, оптимизация культуральной среды - приоритетная задача для увеличения выхода желаемого продукта.

Согласно требованиям Евразийской экономической комиссии производителю необходимо подать сведения об источнике и истории получения, системе и процедурах контроля и поддержания банка клеток, испытаниях на чистоту и стабильность, кариотипировании и исследованиях туморогенности субстрата. В связи с этим среда, используемая в производстве согласно стандартам Надлежащей производственной практики, должна быть стандартизирована и валидирована для обеспечения стабильности результата и исключения ее влияния на процесс производства продукта.

Таким образом, подбор оптимальной среды является важнейшей задачей любого

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

биотехнологического производства. Цель работы - проанализировать мировой опыт подбора сред для выращивания рекомбинантной E. coli.

Общее описание сред

Для выращивания E. coli и ее рекомби-нантных штаммов стандартной считается среда Lysogeny broth (LB) [1].

Описано несколько вариантов среды LB, но в общем их состав сходен и включает пептиды и казеиновые пептоны, витамины, микроэлементы.

Пептиды, пептоны и незаменимые аминокислоты вводятся в среду посредством трипто-на. Витамины и микроэлементы добавляют путем введения экстракта дрожжей. Дополнительно вводят хлорид натрия как источник ионов. Стандартно добавляют 10 г NaCl и 1 г глюкозы из расчета на 1 литр среды.

Рецепты среды LB различаются количеством добавляемого NaCl, в зависимости от предпочтений конкретных штаммов. Например, среды с пониженной концентрацией солей (Lennox LB и Luria LB) используют при культивировании культур совместно с антибиотиками, чувствительными к уровню солей в растворе.

Для приготовления 1 литра среды LB необходимо взвесить 10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 10 г NaCl, растворить в 800 мл дистиллированной воды, довести в мерном цилиндре, автоклавировать при 121°C в течение 20 мин. После охлаждения содержимое перемешивается для равномерного распределения компонентов среды. Доведение pH не требуется в связи с его динамическим изменением, связанным с деятельностью бактерий.

Обзор состава сред. Состав и методики приготовления

Среды LB считаются классическими и используются для стандартных манипуляций с E. coli. Состав различается по наличию NaCl: LB по Miller, содержит 1% NaCl, а по Lennox - 0,5% NaCl. Среды с низкой концентрацией солей используются для выращивания культур с чувствительными к количеству соли антибиотиками, например карбенициллином [5].

Сравнительный состав сред LB представлен далее:

• по Miller: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; натрия хлорид - 10,0 г/л; бактериологический агар - 15,0 г/л; pH среды 7,0 ± 0,2;

• по Lennox: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; натрия хлорид - 5,0 г/л; бактериологический агар - 15,0 г/л; pH среды 7,0 ± 0,2.

Среды LB богаты питательными веществами и применяются для поддержания культуры E. coli [6-10]. Входящий в состав среды триптон служит источником азота и углерода, различных минералов и аминокислот, необходимых для роста E. coli. Дрожжевой экстракт является источником витаминов, в частности группы B и других метаболитов. Хлорид натрия поддерживает необходимое осмотическое давление. Бактериологический агар является желирующим агентом.

Для приготовления среды необходимо растворить 40 г сухой смеси компонентов в 1 л дистиллированной воды, нагреть до полного растворения, стерилизовать в автоклаве 15 мин при 121°C, хранить при 8-15°C. Расход на приготовление составляет: агар LB по Lennox - 35 г на 1 л; бульон LB по Lennox - 20 г на 1 л; агар LB по Miller -40 г на 1 л; бульон LB по Miller - 25 г на 1 л.

В зависимости от требуемых условий эксперимента с рекомбинантной E. coli авторские методики предполагают различные добавки к среде LB, например добавление молочной сыворотки [11], глицерина [12], хлорида кальция [2].

Например, в исследовании [13] среду дополнили 0,1 мл KCl для обеспечения механической стабильности каррагинанового геля с целью сохранения иммобилизованных клеток культуры.

В эксперименте [14] AgNO3 использовался для облегчения конъюгации.

Среда 2xYeastextractand Tripton (2xYT) разработана для роста рекомбинантной E. coli [15-17], а также используется для размножения фага М13 [18]. Компоненты среды богаты азотом и ростовыми факторами, что позволяет получать высокий титр фага в больших количествах без истощения клетки-хозяина. Входящие в ее состав аминокислоты и витамины способствуют быстрому росту рекомбинант-ных штаммов E. coli [19-21]. Внешний вид

среды - светло-бежевый сыпучий гомогенный материал, растворимый в дистиллированной воде. Готовый 3,1 % раствор выглядит как средне-янтарная однородная прозрачная жидкость. Расход на приготовление составляет 31 г на 1 л. Состав среды 2хYT: казеиновый пептон (расщепленный ферментами поджелудочной железы) - 16,0 г/л, дрожжевой экстракт - 10,0 г/л, натрия хлорид - 5,0 г/л, pH среды 7,0 ± 0,2 при 25°C.

Внесение изменений в регламент использования данной среды оказывает влияние на результаты культивирования. Например, Shun Tamaki, Mitsuhiko Yagi и др. [22] показали, что производство искомого белка протекало более эффективно при температуре культивирования 28°C, по сравнению с общепринятыми условиями в 37°С. При этом изменения рН культуры не оказывали существенного влияния на конечный выход продукта. Показано также, что добавление глюкозы к среде 2хYT значительно снижает продукцию белка на ней, в то время как добавление глицерина увеличивает его выход.

Среды N-Zamine-Casaminoacid-Yeast-Extract-Magnesium-sulfate (NZCYM) применяются для культивирования рекомбинантных штаммов E. coli [23-26] и размножения бактериофага лямбда. В состав среды входят пептон, дрожжевой экстракт, панкреатический гидролизат казеина, казаминовые кислоты, витамины и другие необходимые метаболиты. Столь богатый состав обеспечивает быстрый рост биомассы [27-29]. Сульфат магния, входящий в состав среды, служит источником ионов магния, которые способствуют протеканию различных ферментативных процессов в клетке, включающих репликацию ДНК. Расход на приготовление составляет 22 г на 1 л. Состав среды NZCYM: пептон - 16,0 г/л, дрожжевой экстракт - 10,0 г/л, натрия хлорид -5,0 г/л, казаминовые кислоты - 1,0 г/л, сульфат магния - 0,89 г/л, pH среды 7,0 ± 0,2 при 25°C.

Для приготовления среды необходимо растворить 22 г в 1 л дистиллированной воды, нагреть до полного растворения, стерилизовать в автоклаве 15 мин при 121°C, хранить при 2-8°C.

Среды Super Optimal Broth (SOB) и Super Optimal broth with Catabolic repressor (SOC) богаты питательными веществами и применяются для выращивания клеток с последующей

MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES

их трансформацией [30, 31]. Состав сред отличается наличием в SOC глюкозы, которая обеспечивает необходимый энергетический ресурс для восстановления клеток после трансформации и репликации.

Триптон обеспечивает культуру азотом и углеродом, необходимыми для роста, ионы натрия и калия поддерживают необходимое осмотическое давление, дрожжевой экстракт является источником витаминов, в частности группы В, сульфат магния - источником ионов, необходимых для работы бактериальных ферментов. Расход на приготовление среды SOB составляет 28 г на 1 л; среды SOC - 30 г на 1 л.

Среда SOC специализирована для выращивания и поддержания компетентных клеток с последующей их трансформацией. Для приготовления среды необходимо растворить 30,2 г в 1 л дистиллированной воды, нагреть до полного растворения, стерилизовать в автоклаве 15 мин при 121°C, хранить при 2-8°C.

Среда SOB богата питательными веществами и применяется для культивирования и трансформации компетентных клеток. Для приготовления среды необходимо растворить 26,6 г в 1 л дистиллированной воды, нагреть до полного растворения, стерилизовать в автоклаве 15 мин при 121°C, хранить при 2-8°C. Сравнительный состав сред SOB и SOC представлен далее:

• SOB: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; натрия хлорид - 5,0 г/л; калия хлорид - 0,186 г/л; магния хлорид -0,96 г/л; pH среды 7,0 ± 0,2;

• SOC: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; натрия хлорид - 5,0 г/л; калия хлорид - 0,186 г/л; магния хлорид - 0,96 г/л; глюкоза - 3,6 г/л; pH среды 7,0 ± 0,2. Среда Terrific Bloth (TB) поддерживает

продолжительный рост клеток E. coli в лог-фазе, обеспечивая высокую плотность клеток [32-36]. В результате значительно повышается выход рекомбинантных белков и плазмидной ДНК. Применяется как альтернатива среде LB [37-42]. Триптон обеспечивает культуру азотом, витаминами, минералами и аминокислотами, необходимыми для роста E. coli; дрожжевой экстракт является источником витаминов, особенно В-группы; фосфаты обеспечивают

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

Таблица 1

Состав различных питательных сред,

используемых для культивирования E. coli

с целью получения белка hGH

Среда Состав

LB (Миллер) Триптон 10 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

NaCl 10 г/л

LB (Леннокс) Триптон 10 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

NaCl 5 г/л

LB + глицерин Триптон 10 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

NaCl 5 г/л

Глицерин 4 г/л

TB Триптон 12 г/л

Дрожжевой экстракт 24 г/л

Глицерин 4 г/л

K2HPO4 7,2 • 10-2 M

KH2PO4 1,7 • 10-2 M

SB Триптон 32 г/л

Дрожжевой экстракт 20 г/л

NaCl 5 г/л

SOB Триптон 20 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

NaCl 10-2 M

KCl 2,5 • 10-3 M

MgCl2 10-2 M

MgSO4 10-2 M

SOC Триптон 20 г/л

Дрожжевой экстракт 5 г/л

NaCl 10-2 M

KCl 2,5 • 10-3 M

MgCl2 10-2 M

MgSO4 10-2 M

Глюкоза 2 • 10-2 M

2xYT Триптон 16 г/л

Дрожжевой экстракт 10 г/л

NaCl 5 г/л

M9 Na2HPO4 6 г/л

KH2PO4 3 г/л

NH4Cl 1 г/л

NaCl 0,5 г/л

Глюкозы раствор 20% 10 мл/л

1 M MgSO4 • 7H2O 1 мл/л

101 M CaCl2 1 мл/л

Таблица 2

Эффективность использования различных питательных сред при выращивании E. coli с целью получения белка hGH

Среда Выработка биомассы Относительный уровень экспрессии hGH

LB (Миллер) 1,973 5,642

LB (Леннокс) 2,117 7,495

LB + глицерин 2,343 9,599

TB 3,022 11,053

SB 2,789 10,567

SOB 2,888 10,949

SOC 2,262 8,737

2xYT 2,455 10,182

M9 1,170 5,416

буферность системы. Состав среды ТВ: трип-тон - 12,0 г/л, дрожжевой экстракт - 24,0 г/л, гидрофосфат калия - 12,54 г/л, монофосфат калия - 2,31 г/л, рН среды 7,0 ± 0,2 при 25°С.

Для приготовления среды необходимо растворить 50,8 г в 900 мл дистиллированной воды, добавить 4 мл глицерина и довести до конечного объема 1000 мл, нагреть до полного растворения, стерилизовать в автоклаве 15 мин при 121°С, хранить при 2-8°С.

Количественные показатели продуктивности сред

Большое количество исследований посвящено подбору оптимальной среды для культивирования E. coli [43-47]. Оценивается наибольшая эффективность как для быстрого роста самих колоний E. coli, так и для обеспечения синтеза большой массы белка, синтезируемого реком-бинантной культурой.

К примеру, Michael V. Norgard, Kirsten Keem и др. [48] оценивают наиболее распространенные среды (LB, TB, SB, SOB, SOC, 2xYT, M9) по эффективности синтеза на них белка hGH (human growth hormone) при культивировании рекомбинантной E. coli. Работа описывает состав исследуемых сред (табл. 1), условия эксперимента и добавки, влияющие на результат синтеза целевого белка. В таблице приведены основные компоненты некоторых распространенных сред.

Эффективность сред оценивали по изменению оптической плотности полученных растворов в течение 4 ч после инкубации культуры.

Чтобы определить точный объем производства hGH, его очищали с использованием Ni-NTA колоночной хроматографии и количественно определяли по методу Брэдфорда (табл. 2).

Помимо результативности прямого синтеза белка на конкретной среде оценивался вклад отдельных компонентов, влияние их концентрации на общий результат использо-

MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES

Таблица 3 Статистический анализ влияния, оказанного изменением состава питательных сред, на продуктивность роста E. coli

Компонент Выработка биомассы Относительный уровень экспрессии hGH

коэффициент стандартное отклонение коэффициент стандартное отклонение

Константа 1,6223 0,0462 6,821,83 467,218

Глюкоза -0,0962 0,0475 -687,47 480,021

Глицерин 0,0547 0,0475 377,98 480,021

Фруктоза -0,1215 0,0475 -906,35 480,021

Экстракт дрожжей 0,2178 0,0475 1,581,26 480,021

Триптон 0,2410 0,0475 1,561,78 480,021

N^01 0,0636 0,0475 232,25 480,021

К2НР04 0,1689 0,0475 1,126,77 480,021

КИ2Р04 0,0843 0,0475 652,399 480,021

MgS04 -0,0955 0,0475 -410,335 480,021

вания среды. Каждый из элементов задавался в минимальной и максимальной концентрации, после чего было произведено сравнение результата со значением продукции белка, полученным в контрольной группе, приготовленной стандартным способом в трех повтор-ностях.

В частности было изучено влияние следующих составляющих питательной среды:

• источников углерода (глюкоза, глицерин, фруктоза);

• питательных факторов (экстракт дрожжей, триптон, N^01);

• минеральных добавок (К2НР04, КН2Р04, MgSO4).

Наличие источников азота считается основным условием бактериального роста. Подходящими источниками азота в данном исследовании сочли дрожжевой экстракт, триптон и хлорид аммония (КН4С1). Как показано в табл. 3, неорганический источник азота (№Н4С1) неэффективен (р > 0,05), в то время как дрожжевой экстракт и триптон оказали значительное положительное влияние на рост и производство белка (р < 0,05).

Сравнение трех различных источников углерода показало, что на продукцию белка глюкоза

и фруктоза оказывают отрицательное влияние, а глицерин - положительное. Однако различия незначительны.

Исходя из данных результатов, можно заключить, что в отличие от азота наличие источников углерода не подходит в качестве фактора для увеличения производства E. coli и hGH.

В исследованных источниках минералов K2HPO4 установлен как единственный фактор, который оказал значительное положительное влияние на рост E. coli и hGH (p < 0,05).

Статистический анализ полученных данных представлен следующим образом (см. табл. 3) и демонстрирует влияние отдельных факторов на рост биомассы бактерий и продуцирование ими hGH.

Условия культивирования также значительно влияют на продукцию белка в реком-бинантной E. coli. В различных исследованиях изменениям подвергались разнообразные факторы: температура выращивания, аэрация, давление, время синтеза и активации молекул [31, 49-53].

Например, James Coyer, Janet Andersen и др. [54] изучали влияние температуры (рис. 1). Диапазон изменения температуры был выбран от 20 до 40°С, культура выращивалась

Рис. 1. Эффект температурных условий культивирования в среде TB. Наблюдается корреляция между конечным содержанием белка и температурой выращивания культуры перед замером.

Измерение оптической плотности раствора проведено при длине волны 600 нм (OD600).

в шейкере-инкубаторе. Отмечено, что рост клеток был максимальным при 20 и 28°С, что указывает на оптимальную температуру в этом диапазоне. Ферментация при повышенных температурах (30-40°С) привела к уменьшению клеточного роста и продукции рекомбинантно-го белка, при 40°С - на 50%.

Помимо этого показано, что оптимальным временем индуцирования культуры к продукции белка является начальная фаза клеточного цикла (рис. 2).

По результатам многих исследований наибольший рост биомассы и максимальную продукцию белка дает среда ТВ [21, 33-35, 38-40, 55-59].

Рис. 2. Эффект времени предварительного индуцирования культуры IPTG. Наблюдается корреляция между конечным содержанием белка и временем предварительной экспозиции культуры IPTG с целью экспрессии целевого белка.

Измерение оптической плотности раствора проведено при длине волны 600 нм (OD600).

Заключение

На сегодняшний день разработаны и стандартизированы разнообразные питательные среды. Они разнятся по составу и специфике использования.

Согласно данным изученных литературных источников, наиболее эффективной как для быстрого роста самих колоний E. coli, так и для обеспечения синтеза большой массы белков в рекомбинантной культуре является Terrific Bloth (TB).

Однако результаты культивирования будут

разниться для отдельных штаммов и отдельных

целевых белков. Поэтому в каждом конкретном

случае среда может быть оптимизирована за

счет определенных добавок, а также изменения

факторов окружающей среды.

Благодарность. Выражаем благодарность работникам НПК НЛФ ФГУП «СПбНИИВС» ФМБА России и лично заместителю директора по научной работе ФГУП «СПбНИИВС» ФМБА России, кандидату биол. наук Екатерине Николаевне Жиренкиной.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

(2-59 см. в REFERENCES)

1. Конон А.Д., Петровский С.В., Шамбурова М.Ю. и др. Особенности биотехнологий клостридиальных коллагеназ - перспективных ферментов медицинского назначения. Медицина экстремальных ситуаций. 2016; 56(2): 45-57.

REFERENCES

1. Konon A.D., Petrovskiy S.V., Shamburova M.Yu., et al. Features of clostridial collagenase' biotechnology -emerging enzymes for medical application. Meditsina ehkstremal'nykh situatsij. 2016; 56(2): 45-57. (in Russian)

2. Dean A., Pederson D.S., Simpson R.T. Isolation of Yeast Plasmid Chromatin. Methods in Enzymology. 1989; 170: 26-41.

3. Dagert M., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells (Transformation with pBR322 plasmid DNA; recombinant DNA; ampicillin resistance). Gene. 1979; 6(1): 23-8.

4. Ducka P., Eckhard U., Schönauer E. et al. A universal strategy for high-yield production of soluble and functional clostridial collagenases in E. coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009; 83(6): 1055-65.

5. Chung C.T., Niemela S.L., Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and

MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES

storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1989; 86(7): 2172-5.

6. Elbahloul Y., Frey K., Sanders J., Steinbüchel A. Protamylasse, a Residual Compound of Industrial Starch Production, Provides a Suitable Medium for Large-Scale Cyanophycin Production. Applied and Environmental Microbiology. 2005; 71(12): 7759-67.

7. Galli G., Matteoni R., Bianchi E. et al. Replica filter assay of human ß-adrenergic receptors expressed in E. coli. Biochemical and biophysical research communications. 1990; 173(2): 680-8.

8. Songer J.G., Libby S.J., Iandolo J.J., Cuevas W.A. Cloning and Expression of the Phospholipase D Gene from Corynebacterium pseudotuberculosis in Escherichia coli. Infection and Immunity. 1990; 58(1): 131-6.

9. Rice P.W., Dahlberg J.E. A Gene BetweenpolA and glnA Retards Growth of Escherichia coli When Present in Multiple Copies: Physiological Effects of the Gene for Spot 42 RNA. Journal of Bacteriology. 1982; 152(3): 1196-210.

10. Nordström K., Aagaard-Hansen H. Maintenance of bacterial plasmids: Comparison of theoretical calculations and experiments with plasmid R1 in Escherichia coli. Molecular and General Genetics. 1984; 197(1): 1-7.

11. Yoshimoto T., Tone H., Honda T. et al. Sequencing and High Expression of Aminopeptidase P Gene from Escherichia coli HB101. The Journal of Biochemistry. 1989; 105(3): 412-6.

12. Bremer H., Lin-Chao S. Analysis of the Physiological Control of Replication of ColEl-type Plasmids. Journal of Theoretical Biology. 1986; 123(4): 453-70.

13. Huang J., Dhulster P., Thomas D., Barbotin J.-N. Agitation rate effects on plasmid stability in immobilized and free-cell continuous cultures of recombinant E. coli. Enzyme and Microbial Technology. 1990; 12(12): 933-9.

14. Starodub M.E., Trevors J.T. Silver resistance in Escherichia coli R1. Journal of Medical Microbiology. 1989; 29(2): 101-10.

15. Gong T., Li W., Wang Y. et al. Expression of mouse beta defensin 2 in Escherichia coli and its broad-spectrum antimicrobial activity. Brazilian Journal of Microbiology. 2011; 42(3): 1180-7.

16. Mohsenifar A., Lotfi A.S., Ranjbar B. et al. A Study of the Oxidation-Induced Conformational and Functional Changes in Neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 2007; 11(1): 41-6.

17. Zheng C., Zhao Z., Li Y. et al. Effect of IPTG amount on apo- and holo- forms of glycerophosphate oxidase expressed in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 2011; 75(2): 133-7.

18. Dash L., Subramaniam S., Khulape S.A. et al. Development and Utilization of VHH Antibodies Derived from Camelus Dromedarius Against Foot-and-Mouth Disease Virus. Animal Biotechnology. 2019; 30(1): 57-62.

19. Rahimi R., Ebtekar M., Moazzeni S.M. et al. Optimization of multi-epitopic HIV-1 recombinant protein

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

expression in prokaryote system and conjugation to mouse DEC-205 monoclonal antibody: implication for in vivo targeted delivery of dendritic cells. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2015; 18(2): 145-52.

20. Lee P.C., Mijts B.N., Schmidt-Dannert C. Investigation of factors influencing production of the monocyclic carotenoid torulene in metabolically engineered Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2004; 65(5): 538-46.

21. Choi H.-P., Lee Y.-M., Yun C.-W., Sung H.-C. Extracellular 5-Aminolevulinic Acid Production by Escherichia coli Containing the Rhodopseudomonas palustris KUGB306 hemA Gene. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2008; 18(6): 1136-40.

22. Tamaki S., Yagi M., Nishihata Y. et al. Modification of N-Terminal Amino Acids of Fungal Benzoate Hydroxylase (CYP53A15) for the Production of p-Hydroxyben-zoate and Optimization of Bioproduction Conditions in Escherichia coli. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2018; 28(3): 439-47.

23. Penin F., Geouijon C., Montserret R. et al. Three-dimensional Structure of the DNA-binding Domain of the Fructose Repressor from Escherichia coli by 1H and 15N NMR. Journal of Molecular Biology. 1997; 270(3): 496-510.

24. Ling Z., Tran K.C., Arnold J.J., Teng M.N. Purification and characterization of recombinant human respiratory syncytial virus nonstructural protein NS1. Protein Expression and Purification. 2008; 57(2): 261-70.

25. Huang L., Sineva E.V, Hargittai M.R.S. et al. Purification and characterization of hepatitis C virus non-structural protein 5A expressed in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 2004; 37(1): 144-53.

26. Ikon N., Shearer J., Liu J. et al. A facile method for isolation of recombinant human apolipoprotein A-I from E. coli. Protein Expression and Purification. 2017; 134: 18-24.

27. Kohara Y., Akiyama K., Isono K. The Physical Map of the Whole E. coli Chromosome: Application of a New Strategy for Rapid Analysis and Sorting of a Large Ge-nomic Library. Cell. 1987; 50(3): 495-508.

28. Li J.-M., Russell C.S., Cosloy S.D. Cloning and structure of the hemA gene of Escherichia coli K-12 (Recombinant DNA; 5-aminolevulinic acid; C5 pathway; heme biosynthesis; sequence; phasmid). Gene. 1989; 82(2): 209-17.

29. Jepson C.D., March J.B. Bacteriophage lambda is a highly stable DNA vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2004; 22(19): 2413-9.

30. Chan W.-T., Verma C.S., Lane D.P., Gan S.K.-E. A comparison and optimization of methods and factors affecting the transformation of Escherichia coli. Bioscience Reports. 2013; 33(6): 931-43.

31. Hanahan D. Studies on Transformation of Escherichia coli with Plasmids. Journal of Molecular Biology. 1983; 166(5): 557-80.

32. Huang H., Hu L., Yu W. et al. Heterologous overproduction of 2[4Fe4S]- and [2Fe2S]-type clostridial ferredox-ins and [2Fe2S]-type agrobacterial ferredoxin. Protein Expression and Purification. 2016; 121: 1-8.

33. Khasa Y.P., Khushoo A., Tapryal S., Mukheijee K.J. Optimization of Human Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (hGM-CSF) Expression Using Asparaginase and Xylanase Gene's Signal Sequences in Escherichia coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2011; 165(2): 523-37.

34. Larentis A.L., Argondizzo A.P.C., dos Santos Esteves G. et al. Cloning and optimization of induction conditions for mature PsaA (pneumococcal surface adhesin A) expression in Escherichia coli and recombinant protein stability during long-term storage. Protein Expression and Purification. 2011; 78: 38-47.

35. Li Z., Gu Z., Wang M. et al. Delayed supplementation of glycine enhances extracellular secretion of the recombinant a-cyclodextrin glycosyltransferase in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2010; 85(3): 553-61.

36. Ng W.K., Lim T.S., Lai N.S. Expression of soluble human Neonatal Fc-receptor (FcRn) in Escherichia coli through modification of growth environment. Protein Expression and Purification. 2016; 127: 73-80.

37.Frey K.M., Oppermann-Sanio F.B., Schmidt H., Steinbüchel A. Technical-Scale Production of Cyano-phycin with Recombinant Strains of Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 2002; 68(7): 3377-84.

38. He X.-Z., Li W.-S., Blount J.W., Dixon R.A. Regioselec-tive synthesis of plant (iso)flavone glycosides in Esch-erichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 2008; 80(2): 253-60.

39. Ku J.T., Simanjuntak W., Lan E.I. Renewable synthesis of n-butyraldehyde from glucose by engineered Escherichia coli. Biotechnology for Biofuels. URL: https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/ track/pdf/10.1186/s13068-017-0978-7 (accessed date: 26.03.2019).

40. Kangwa M., Yelemane V, Polat A.N. et al. High-level fed-batch fermentative expression of an engineered Staphylococcal protein A based ligand in E. coli: purification and characterization. AMB Express. URL: https:// amb-express.springeropen.com/track/pdf/10.1186/ s13568-015-0155-y (accessed date: 26.03.2019).

41. Shafiee F., Rabbani M., Jahanian-Najafabadi A. Optimization of the Expression of DT386-BR2 Fusion Protein in Escherichia coli using Response Surface Methodology. Advanced Biomedical Research. URL: http://www.ad-vbiores.net/temp/AdvBiomedRes6122-202195_053659. pdf (accessed date: 26.03.2019).

42. Kahaki F.A., Babaeipour V., Memari H.R., Mofid M.R. High Overexpression and Purification of Optimized Bacterio-Opsin from Halobacterium Salinarum R1 in E. coli. Applied biochemistry and biotechnology. 2014; 174(4): 1558-71.

43. Luna-Suárez S., Medina-Godoy S., Cruz-Hernández A., Paredes-López O. Expression and characterization of the acidic subunit from 11S Amaranth seed protein. Biotechnology Journal. 2008; 3(2): 209-19.

44. Nigro M., Martin V., Kaufer F. et al. High Level of Expression of the Toxoplasma gondii-Recombinant Rop2 Protein in Escherichia coli as a Soluble Form for Optimal Use in Diagnosis. Molecular Biotechnology. 2001; 18(3): 269-73.

45. Pal G., Srivastava S. Scaling Up the Production of Recombinant Antimicrobial Plantaricin E from a Heterolo-gous Host, Escherichia coli. Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2015; 7(3): 216-21.

46. Park C.-S., Park C.-S., Shin K.-C., Oh D.-K. Production of D-psicose from D-fructose by whole recombinant cells with high-level expression of D-psicose 3-epimer-ase from Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2016; 121(2): 186-90.

47. Groman N.B. Factors in Lysis and Lysis Inhibition by Lambda Bacteriophage. Journal of Bacteriology. 1965; 90(6): 1563-8.

48. Norgard M.V, Keem K., Monahan J.J. Factors affecting the transformation of Escherichia coli Strain x1776 BY pBR322 PLASMID DNA. Gene. 1978; 3(4): 279-92.

49. Piccolomini A.A., Fiabon A., Borrotti M., De Lucrezia D. Optimization of thermophilic trans-isoprenyl diphosphate synthase expression in Escherichia coli by response surface methodology. Biotechnology and Applied Biochemistry. 2015; 64(1): 70-8.

50. Couto M.R., Rodrigues J.L., Rodrigues L.R. Optimization of fermentation conditions for the production of curcumin by engineered Escherichia coli. Journal of the Royal Society Interface. URL: https://royalsocietypub-lishing.org/doi/pdf/10.1098/rsif.2017.0470 (accessed date: 26.03.2019).

51. Hegde K., Veeranki V.D. Production Optimization and Characterization of Recombinant Cutinases from Ther-mobifida fusca sp. NRRL B-8184. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2013; 170(3): 654-75.

MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES

52. Zamani M., Berenjian A., Hemmati S. et al. Cloning, Expression, and Purification of a Synthetic Human Growth Hormone in Escherichia coli Using Response Surface Methodology. Molecular Biotechnology. 2015; 57(3): 241-50.

53. Losen M., Frölich B., Pohl M., Büchs J. Effect of Oxygen Limitation and Medium Composition on Escherichia coli Fermentation in Shake-Flask Cultures. Biotechnology Progress. 2004; 20(4): 1062-8.

54. Coyer J., Andersen J., Forst S.A. et al. micF RNA in ompB Mutants of Escherichia coli: Different Pathways Regulate micF RNA Levels in Response to Osmolar-ity and Temperature Change. Journal of Bacteriology. 1990; 172(8): 4143-50.

55. D'Ari R., Jaffé A., Bouloc P., Robin A. Cyclic AMP and Cell Division in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 1988; 170(1): 65-70.

56. Yang Y.J., Haught R.C., Goodrich J.A. Real-time contaminant detection and classification in a drinking water pipe using conventional water quality sensors: Techniques and experimental results. Journal of Environmental Management. 2009; 90(8): 2494-506.

57. Krause M., Ukkonen K., Haataja T. et al. A novel fed-batch based cultivation method provides high cell-density and improves yield of soluble recombinant proteins in shaken cultures. Microbial Cell Factories. URL: https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/track/ pdf/10.1186/1475-2859-9-11 (accessed date: 26.03.2019).

58. Durrani F.G., Gul R., Sadaf S., Akhtar M.W. Expression and rapid purification of recombinant biologically active ovine growth hormone with DsbA targeting to Escherichia coli inner membrane. Applied Microbiology and Biotechnology. 2015; 99(16): 6791-801.

59. Collins T., Azevedo-Silva J., da Costa A. et al. Batch production of a silk-elastin-like protein in E. coli BL21(DE3): key parameters for optimization. Microbial Cell Factories. URL: https://microbialcellfactories. biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/1475-2859-12-21 (accessed date: 26.03.2019).

Поступила 23 апреля 2019 Принята в печать 09 сентября 2019