CC BY
27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 611-018:611.778:611.91+611.9
Е.Ю. ШАПОВАЛОВА1, Т.А. КОЛОМОЕЦ2, А.В. МАРТЫНЮК3
ОБРАЗОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ДЕРМЫ КОЖИ У ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА
ПЕРВЫХ ТРЕХ МЕСЯЦЕВ РАЗВИТИЯ
ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С. И. Георгиевского»1,2,3, Украина, Симферополь
Д.м.н.1,2, к.м.н.3
Аннотация: Малая изученность проблемы соединительнотканных пороков развития кожи послужила основанием для настоящего морфологического исследования. Результаты работы базируются на 122 зародышах и предплодах человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития. Это дало возможность изучить зародыши человека на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода, что соответствует уровням развития по Стритеру от Х до XXIII и началу плодного периода и стадиям, принятым сейчас в Институте Карнеги, от 9 до 23.
Ключевые слова: эмбриогенез человека, кожа, коллагеновые волокна, эластичные волокна, гистохимия, иммуногист охимия.
Введение. Малая изученность проблемы соединительнотканных пороков развития кожи послужила основанием для настоящего морфологического исследования [6]. Это обширная глава в дерматологии, которая, по далеко не полной классификации, включает более десяти клинических форм [13], причем среди них ряд системных заболеваний, таких как туберозный склероз, синдром Бушке-Оллендорф, псевдоксантома эластическая [5,9]. Соединительнотканные пороки развития обусловлены спорадическим или наследственным нарушением синтеза, чаще избыточным, коллагена и/или эластина, гиперпролиферацией фибробластов [11,14].
Значение соединительной ткани для функции каждого органа очень велико. Именно компоненты межклеточного вещества играют ведущую роль в морфогенезе и дифференцировке эпителиальных клеток [4]. Сведения о дифференцировке мезенхимы в соединительную ткань дермы не получили должного освещения в изученной нами литературе и не дают точных данных о динамике этого процесса. Факты о биосинтезе белка коллагена, образовании на его основе коллагеновых волокон стромы дермы кожи эмбрионов человека немногочисленны, кратки и выполнены в большинстве случаев на лабораторных животных [10]. Появление современного метода иммуногистохимии позволяет с помощью моноклональных антител конкретизировать тип коллагена и сроки его появления в развивающейся коже, о чем отсутствуют сведения в доступной литературе. 19 известных типов коллагенов кодируется 33-мя генами [12]. Последовательная их активация и приводит к фенотипическому проявлению в виде появления коллагенов разных типов в эмбриональном периоде.
Цель и задачи. Целью и задачей нашего исследования явилось определение начальных сроков появления первых признаков дифференцировки мезенхимы в эмбриональную соединительную ткань, закономерностей этого процесса и динамики начальных этапов синтеза эластических и разных типов коллагеновых волокон в ходе нормального эмбриогенеза дермы кожи человека в первые три месяца гестации.
Материал и методы. Результаты работы базируются на 122 зародышах и предплодах человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития. Это дало возможность изучить зародыши человека на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода, что соответствует уровням развития по Стритеру от X до XXIII и началу плодного периода и стадиям, принятым сейчас в Институте Карнеги, от 9 до 23. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином [8]. Ретикулярные волокна выявляли импрегнацией по Гомори [7]. Для визуализации эластических и коллагеновых волокон использовали комбинированную окраску по Вейгерту и Ван - Гизону. Идентификацию гликозаминогликанов производили толуидиновым синим при различных значениях рН (от 3,6 до 5,6) буфера Михаэлиса с ферментативным контролем бактериальной и тестикулярной гиалуронидазой [2].
Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином ("Menzel-Glaser", Германия). Для освобождения антигенов после фиксации формалином использовали тепловую демаскировку антигенов в микроволновой печи "Sumsung" при мощности 800 Вт в течение 10 минут в цитратном буфере при рН 6,0 [3].
Для изучения разных типов коллагена первичными антителами были моноклональные антитела к коллагену I типа (Isotype Ig G1, Chemicon International), коллагену II типа (клон COLL-II, Isotype Ms Ig G1-kappa, Chemicon International), коллагену III типа (Isotype Ig G1, Chemicon International) и коллагену IV типа (клон CIV 22, Dako Cytomation). В качестве растворителя антител использовали раствор Antibody Diluent (Dako Cytomation). Дальнейшую обработку проводили с помощью системы визуализации En vision (DAKO) в течение 10 минут с каждым реактивом с биотинилированными антителами и стрептавидин-пероксидазным комплексом. Затем проводили реакцию с хромогеном DAB (Dako Cytomation), оценивая качество взаимодействия под контролем микроскопа на протяжении от 20 секунд до 3 минут. Для адекватного представления структуры ткани срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 минут. Результат расценивали как позитивный при выпадении солей хромогена красного цвета на коллагеновых волокнах дермы. С целью контроля метода была проведена серия исследований с использованием позитивных и негативных образцов, которые служили эталонами. Волокна позитивные по отношению к экспрессии маркеров изучали как минимум на 5-ти срезах. В каждом из них определяли количество окрашенных в красный цвет коллагеновых волокон в 10 полях зрения на площади 502,08 мкм2 (увел. х 400 микроскопа «Olympus CX-41») с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову [1].
Результаты исследования и их обсуждение. У самого раннего изученного нами зародыша в возрасте 21 суток
ЭКСПЕРИМЕНТАЛДЫ ЖЭНЕ КЛИНИКАЛЫК ЗЕРТТЕУЛЕР
(1,4 мм теменно-копчиковой длины) туловище покрыто однослойным кубическим эпителием с круглыми или овальными ядрами. Границы между клетками хорошо просматриваются. Эктодермальный эпителий не имеет еще четкой базальной мембраны. Местами выявляется выселение эктодермальных клеток в подлежащую мезенхиму. Такие клетки по сравнению с клетками мезенхимы имеют более светлые ядра. Они приобретают звездчатую форму и на некотором расстоянии неотличимы от других элементов мезенхимы. С 38-и суток зародыш снаружи покрыт эктодермальным эпителием, который состоит их двух рядов клеток. Базальные клетки кубической формы со слабо базофильной цитоплазмой. Клеточные границы видны не везде. Большие богатые хроматином ядра имеют округлую форму. Хорошо выражена базальная мембрана. Под эпителием располагается будущая дерма кожи в виде неуплотненной мезенхимы, формирующей синцитий из отростчатых клеток. Окраска срезов толуидиновым синим на буфере Михаэлиса при всех примененных значениях рН дает ортохроматическую синюю окраску синцития. В дальнейшем у зародышей в возрасте 43 суток (14 мм длины) элементы периэпителиальной мезенхимы несколько уплотняются и ориентируются вдоль базальной мембраны. В данном возрасте нами впервые зафиксированы гликозаминогликаны (ГАГ) в виде нежной сиреневой метахроматической окраски, появившейся в цитоплазме молодых дифференцирующихся из мезенхимоцитов фиброблатов и межклеточном пространстве после окраски срезов раствором толуидинового синего в буфере Михаэлиса с рН = 4,13 и 5,32. Обработка материала раствором красителя в буфере со значением рН = 3,2 дает синее ортохроматическое окрашивание этих же участков. Такая избирательность позволяет судить о том, что в клетках мезенхимы произошло усложнение обмена углеводов и они приступили к синтезу гиалуроновой кислоты, одного из важнейших компонентов основного вещества соединительной ткани. Подтверждением тому служит и неустойчивость метахроматического окрашивания к действию бактериальной и тестикулярной гиалуронидазы. К концу последующих двух суток у зародышей (45 суток) в мезенхиме кожи длиной 16 мм кроме гиалуроновой кислоты синтезируется небольшое количество хондроитинсульфатов А и С. Полисахаридные эфиры серной кислоты, присутствующие в хондроитинсульфатах А и С, дают метахромазию с толуидиновым синим, приготовленным на буфере Михаэлиса с рН = 3,2. Способность синтезировать гиалуроновую кислоту, знаменующую трансформацию клеток мезенхимы в молодые фибробласты и мезенхимы в эмбриональную соединительную ткань, приобрели в описываемом возрасте все клетки периэпителиальной мезенхимы.
На 46-е сутки (зародыши длиной 17 мм) развивающийся эпидермис состоит уже из 2-3-х рядов кубических клеток со слабой базофильной цитоплазмой с округлыми или слегка овальными ядрами. В базальном ряду ядра находятся в апикальной части клеток, в результате чего к базальной мембране прилежит безъядерная цитоплазматическая полоска. На поверхности кубических клеток лежит один слой плоских клеток перидермы с овальными темными ядрами. В клетках и межклеточном веществе эмбриональной соединительной ткани кожи продолжается дальнейшее увеличение количества гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов А и С. В будущей дерме кожи впервые обнаруживаются эластические волокна в виде нежной сеточки коричневого цвета (рисунок 1). При окраске по Гомори впервые у зародышей в возрасте 47 суток (18 мм длины) между молодыми фибробластами выявляется тонкая сеточка аргирофильных волокон. Молодые фибробласты имеют удлиненную форму и слабую базофильную цитоплазму. После иммуногистохимической окраски в эмбриональной соединительной ткани дермы зародышей этого возраста между молодыми фибробластами обнаруживаются коллагеновые волокна III типа. Теперь становится ясно, что ретикулярные волокна являются коллагеновыми волокнами третьего типа. Такие волокна появляются первыми в слоях дермы, непосредственно прилежащих к эпидермису (рисунок 1). Их количество, подсчитанное с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову, составляет в среднем примерно 3,1.
На 62-е сутки (зародыши 32 мм длины) эпидермис кожи охраняет двухслойное строение. Базальный слой состоит из кубических клеток с базофильной цитоплазмой. На поверхности этих клеток лежит второй слой, образованный мелкими клетками с более темными круглыми ядрами. Базальная мембрана развита слабо. В формирующейся дерме наблюдается образование густой сети эластических и коллагеновых волокон III типа, проходящих в различных направлениях. Количество коллагеновых волокон III типа, подсчитанное с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову, составляет, в среднем, примерно 6,4. Отмечается некоторое увеличение содержания гиалуроновой кислоты с примесью хондроитинсульфатов А и С в данном возрасте.
К 10-ти неделям пренатального развития (зародыши 33-45 мм длины) в дерме мезенхима полностью заместилась клетками фибробластического ряда и их количество на единицу площади уменьшилось по сравнению с ранее
Стадия 19. Зародыш в возрасте 46 суток (17 мм длины). Срез кожи человека. Сеточка эластических волокон в дерме. Окраска по Вейгерту и Ван-Гизону. Увеличение: ок. 10, об.
Рисунок 1.
Батыс Цазацстан медицина журналы №1-2 (38) 2013 ж.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
¿г
описанными зародышами. Отмечается также уменьшение содержания ГАГ, что, видимо, связано с начавшимися процессами активного коллагенообразования. Коллаген «маскирует» ГАГ. Помимо большого количества коллагеновых волокон III типа здесь обнаруживаются впервые коллагеновые волокна I типа. Их соотношение составляет 7,2:2,8. Коллагеновые волокна I типа повторяют динамику и гистотопографию коллагеновых волокон III типа, но их значительно меньше.
На 11-й неделе пренатального онтогенеза среди коллагеновых волокон I и III типов в дерме кожи появляется тонкая сеточка коллагеновых волокон II типа. Волокна II типа локализованы в глубоких слоях дермы и не имеют контакта с эпидермисом (рисунок 2). Соотношение коллагеновых волокон I, II и III типов составляет 3,6:2,3: 8,3.
В конце изученного периода внутриутробного развития к 12-ти неделям (зародыши 70 мм длины) толщина эпидермиса заметно увеличилась. На четко видимой базальной мембране в области головы лежит 3-4 слоя кубических
эпителиальных клеток со слабой базофильной цитоплазмой и округло-овальными ядрами. Поверхностные клетки несколько уплотнены. В области тела предплодов эпидермис состоит из 2-3-х слоев клеток. В эмбриональной соединительной ткани дермы образовалась хорошо развитая сеть капилляров. Большинство аргирофильных волокон коллагенизируются, о чем свидетельствует их розовая окраска при обработке пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Фиброциты здесь оксифильны, веретеновидной формы. Их базофильные ядра повторяют форму клеток. Между коллагеновыми волокнами имеется сеть эластических волокон. В коже туловища эластические волокна преимущественно сконцентрированы под эпидермисом, а коллагеновые волокна присутствуют глубже. Большинство коллагеновых волокон - это волокна I типа. Эти волокна образуют ориентированные пучки в глубоких слоях кожи туловища. Фиброциты здесь оксифильны, веретеновидной формы. Их базофильные ядра повторяют форму клеток. В дерме головы коллагеновые волокна тоньше и не образуют ориентированных пучков. Между коллагеновыми волокнами I типа имеются коллагеновые волокна II и III типов. Коллагеновые волокна III типа уменьшились количественно и более многочисленны в сосочковом слое дермы, а коллагеновые волокна II типа - в будущем сетчатом слое дермы. В среднем соотношение коллагеновых волокон I, II и III типов составляет 7,9:2,6:5,8. Коллагеновые волокна IV типа не выявляются.
Выводы. 1. Способность клеток мезенхимы кожи усложнять биосинтетические процессы и активно секретировать компоненты основного вещества соединительной ткани - ГАГ знаменует трансформацию их в молодые фибробласты и появление эмбриональной соединительной ткани. Вначале синтезируется гиалуроновая кислота, затем более сложные биополимеры - хондроитинсульфаты А и С, и вслед за ними появляются аргирофильные (коллагеновые волокна III типа) и эластические волокна.
2. Первое появление гиалуроновой кислоты в эмбриональной соединительной ткани кожи фиксируется в возрасте 45 суток (зародыши 16 мм длины). В последующие двое суток обнаруживаются вначале эластические, а затем аргирофильные волокна (коллагеновые волокна III типа).
3. В конце 12-ой недели (зародыши 70 мм длины) коллагеновые волокна II типа образуют ориентированные пучки в глубоких слоях дермы туловища, эластические волокна преимущественно сконцентрированы под эпидермисом. В дерме кожи головы эластических волокна образуют сеть, коллагеновые волокна I, II и III типов не образуют ориентированных пучков. Коллагеновые волокна IV типа не обнаружены.
4. Первыми в дерме кожи появляются коллагеновые волокна III типа. Коллагеновые волокна I типа обнаруживаются позднее. Коллагеновые волокна I типа повторяют динамику и гистотопографию коллагеновых волокон III типа, но их значительно меньше.
5. Коллагеновые волокна II типа присутствуют в дерме на 11-й неделе (зародыши 46-56 мм длины) развития и заметно не увеличиваются количественно и в толщину до конца изученного периода эмбриогенеза.
Перспективы дальнейших исследований. Изучение особенностей становления коллагенового каркаса дермы кожи на основе методов гисто- и иммуногистохимии в раннем эмбриогистогенезе поможет вскрыть закономерности нормального развития этого органа, нарушающегося при формировании пороков развития соединительной ткани кожи.
Список литературы:
1. Г.Г. Автандилов Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - Москва: Медицина, 1991. - 380 с.
2. Л.П. Горальський Основи пстолопчно'Т техшки i морфофункцюнальш методи дослщжень у нормi та при патологи /
Срез кожи зародыша 11 недель, 56 мм длины. Позитивная реакция на коллаген второго типа в глубоких слоях дермы кожи. Окраска иммуногистохимическим методом. Дополнительное окрашивание гематоксилином Майера. Визуализация в системе En vision. Увеличение: ок. 10, об. 40.
Рисунок 2.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛДЫ ЖЭНЕ КЛИНИКАЛЫК ЗЕРТТЕУЛЕР ^
Л.П. Горальський, В.Т. Хомич, О.1. Кононський. - Житомир «Полюся», 2011. - 215 с.
3. Д.Э. Коржевский Применение методов теплового демаскирования антигенов на парафиновых срезах головного мозга крысы / Д.Э. Коржевский, Е.А. Юмкина // Морфология. - 2005. - Т. 127, № 2. - С. 76-77.
4. Н.И. Майструк Особенности биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железой и окончательной почкой в раннем эмбриогистогенезе у человека при маточной имплантации / Н.И. Майструк, Т.А. Бойко, Е.Ю. Шаповалова // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т. 11, № 2, - С. 182-186.
5. В.Н. Мордовцев Генетика в дерматологии / В.Н. Мордовцев, З.Б. Кешилева, А.С. Сергеев. - Алматы, 2001. - 53 с.
6. А.А. Пономарев Редкие кожно висцеральные синдромы / А.А. Пономарев, Е.П. Куликов, Н.С. Караваев. Рязань, 1998. - 600 с.
7. Руководство по гистологической, гистохимической и иммуногистохимической технике/ В.Д. Марковский, И.В. Сорокина, Н.В. Гольева [и др.]. - Харьков, 2010. - 151 с.
8. В.В. Семченко Гистологическая техника / В.В. Семченко, С.А. Барашкова, В.И. Ноздрин. - Омск, 2006. - 289 с.
9. Bale S.S. Genetics for Dermatologists / S. S. Bale // London, Re Medica publishing. - 2000. - P. 253.
10. Gautam R.K. Isolated collagenoma: a case report with a review of connective tissue nevi of the collagen type. II / R.K. Gautam, H.K. Kar, R.K. Jain // J Dermatol. - 1996. - Vol. 23, N 7. - P. 476-478.
11. Giro Gabriella M. Buschke -Ollendorff syndrome associated with elevated elastin production by affected skin fibroblasts in culture / Gabriella M. Giro, Duvis Madeleine, T. Lyme // The journal of investigative dermatology. - 1992. - V. 99, № 2. - P. 129- 137.
12. Myers J.C. Biochemical and immunochistochemical characterization of human type XIX defines a novel class of basement membrane zone collagens / J.C. Myers, A. Bageris, V. Abraham // Am. J. Pathol. - 1997. - V. 151, N 6. - P. 1729-1740.
13. Pierard G.E. Nevi of connective tissue a reappraisal of their classification / G. E. Pierard, V. Charles, Lapiere // The American journal of dermatopathology. - 1995. - V. 7, N 4. - P. 325-333.
14. Zars В. Connective tissue nevus / В. Zars, D.D. Strachan. // Medicine Journal. - 2001. - N 2. - P. 5-7.
ТУЙ1Н
Е.Ю. ШАПОВАЛОВА1, Т.А. КОЛОМОЕЦ2, А.В. МАРТЫНЮК3 АДАМ ¥РЫГЫНЫН АЛГАШКЫ УШ АЙЫНДАГЫ ДАМУЫНДА ТЕР1 ДЕРМАСЫ КОМПОНЕНТТЕРНЩ ТУЗ1ЛУ1
С. И. Георгиев атындагы Кырым мемлекетлк медицина университет^2,3, Украина, Симферополь
м.г.д.1,2, м.г.к.3
Курса^штт дамудыч 21 тэултнен 12 - аптага дейшп 122 адам урыгында дерманыч талшыкты компоненттер^ч калыптасуы гистохимия жэне иммуногистохимия эдiстерi кемепмен зерттелдк I, II, III, жэне IV типт коллагендерге моноклональды антиденелер алгашкы антиденелер болып табылды. Тер^ч мезенхима жасушалары биосинтез процесш кYрделендiрiп, дэнекер лшшч непзп заты - ГАГ белсендi синтездеп, жас фибробласттардыч дамуына жэне эмбрионалды дэнекер лшшч пайда болуына алып келетшдИ аныкталды. Тер^ч эмбрионалды дэнекер тшшде алгашкы гиалурон кышкылыныч пайда болуы 45 тэултте (узындыгы 16мм урык) байкалды. Одан кейшп ею тэулкте эуелi эластикалык, содан кейш аргирофильдi талшыктар (III типт коллаген талшыктары) аныкталды. 12^i аптаныч сочында (узындыгы 70мм урык) II типт коллаген талшыктары денешч дерма кабыктарыныч тереч кабаттарында шогырлар тYзедi, эластикалык талшыктар эпидермис астына орналасады. Бас терiсiнiч дермасында эластикалык талшыктар тор тYзедi, I, II, III типт коллаген талшыктары шогырлар тYзбейдi. IV типтi коллаген талшыктары аныкталмады.
Нег'зг'! свздер: адам эмбриогенезi, mepi, коллаген талшыктары, эластикалык талшыктар, гистохимия, иммуногист охимия.
SUMMARY
YE.YU.SHAPOVALOVA1, T.A.KOLOMOYETS2, A.V. MARTYNYUK3
THE FORMATION OF THE COMPONENTS OF SKIN DERMIS AT HUMAN EMBRYOS OF THE FIRST THREE MONTHS OF DEVELOPMENT
State Crimean medical university named after S.I. Georgiyev1,2,3, Ukraine, Simferopol
MD12, PhD3
In this article is investigated about problems of connective tissue and their deformity in the development. The results of work are based on the 122 embryos and fetuses of the human on the age from 21 days to 12 weeks of the intrauterine development. It is given the opportunity to study the embryos of the human on the stage of subsequently from early age of the period of the nervous flut in the beginning of the definitive fetus period, according to the level of the development by Stritter from X to XXIII and beginning of the fetus period and stages, now take in the Institute of Karnage, from 9 to 23. The study of the peculiarity of the formation of collagen frame of the skin dermis on the basis of method of histo- and immunohistochemistry in the early embtiohistogenese to help open conformity with law normal development of this organ, disturbing at the formation of deformity of the development of the connective tissue of the skin.
Key words: human embryos, dermis of skin, collagen fibers, elastic fibers, histochemistry, immunohistochemistry.
Батыс Казахстан медицина журналы №1-2 (38) 2013 ж.
