CC BY
39
7. Шаповалова Е. Ю. Особенности биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железой и окончательной почкой в раннем эмбриогистогенезе у человека при маточной имплантации / Е. Ю. Шаповалова, Т. А. Бойко, Н. И. Майструк // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т. 11, № 2, - С. 182-186.
8. Vetter M. R. Morphogenesis and histochemistry of the developing mouse kidney / C. W. Gibrles, M. R. Vetter // Journal of morphology. -2005. -V.120, №2. - P.135-155.
ЗМ1НА АКТИВНОСТ1 СИНТЕЗУ Б1ЛКА В еМБРЮГЕНЕЗ! ЛЕГЕНЬ I НИРОК ЩУР1В П1СЛЯ ВВЕДЕННЯ ПАРАЦЕТАМОЛУ ТА НИМЕСУЛИДУ ВАГ1ТНИМ САМКАМ Харченко С.В.
Вивчено змют РНК в кл^инах eпiтелiя та мезенхими у легенях та нирках щурiв, що розвиваються у нормi та пщ впливом парацетамолу i нимесулиду. Встановлено поступове зниження кшьмсп РНК в процес розвитку eмбрiонiв в клитинах eпiтелiальних та мезенхимних закладок легень i нирок щурiв контрольно!' групи. У зародш щурiв, матерi яких получали вивчаeмi дози парацетамолу та нимесулиду спостер^аються статистично достовiрнi змiни змiсту РНК.
Ключевые слова: эмбриогенез крысы, легкие, почки, парацетамол, нимесулид.
CHANGE OF PROTEIN SYNTHESIS ACTIVITY IN EMBRYOGENESIS OF RAT LUNGS AND KIDNEY AFTER MATERNAL INGESTION OF PARACETAMOL AND NIMESULIDE Kcharchenko S.V.
Content of RNA in epithelial and mesenchymal cells of developing rat lung and kidney in control group and under influence of paracetamol and nimesulide were investigated. It is determined that in the process of embryo development in the cells of epithelium and mesenchyme of rat lung and kidney in control group there is a gradual decline of RNA content. For the embryos whose mothers received investigated doses of paracetamol and nimesulide there were statistically reliable changes of RNA amount in the lungs and kidney cells.
Key words: embryogenesis of rat, lungs, kidney, paracetamolum, nimesulid.
УДК.611 -013.7/8+611 -018+611.24+618.31
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОЯВЛЕНИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИИ КОЛЛАГЕНОВ I, II, III И IV ТИПОВ В РАННЕМ ЭМБРИОГИСТОГЕНЕЗЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЧЕЛОВЕКА ПРИ
ТИПИЧЕСКОЙ ИМПЛАНТАЦИИ
Внеклеточные факторы, которые регулируют рост и дифференцировку клеточных популяций в зачатке поджелудочной железы слабо изучены [11]. Соединительная ткань железы и ее волокнистые компоненты не только ограничивают главные морфологические структуры - дольки, но и являются неотъемлемой частью стенок выводных протоков [7]. Соединительная ткань выполняет функцию мягкого остова всей поджелудочной железы и составляющих ее структурно-функциональных ансамблей [3]. Развитие волокнистого состава соединительной ткани железы в пренатальном онтогенезе изучалось рядом авторов [2; 4], но эти сведения фрагментарны и неполны. В нашем предыдущем сообщении описано становление биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железы человека с помощью гистохимии [6]. 19 известных типов коллагенов кодируется 33-мя генами [8]. Сочетанная активация этих генов в разные сроки гестации приводит к фенотипическому их проявлению в виде появления коллагенов разных типов в эмбриональном периоде поджелудочной железы. Появление современного метода иммуногистохимии позволяет с помощью моноклональных антител конкретизировать тип коллагена и сроки его появления в развивающейся железе, о чем отсутствуют сведения в доступной литературе.
Целью работы было изучение сроков появления и локализации коллагеновых волокон, содержащих коллаген I, II, III И IV типов, в составе волокнистой стромы поджелу-
дочной железы у зародышей человека, развивавшихся в матке при отсутствии явно выраженных повреждающих факторов внешней и внутренней среды.
Материал и методы исследования. Изучены 114 зародышей человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином ("Menzel-Glaser", Германия). Для освобождения антигенов после фиксации формалином использовали тепловую демаскировку антигенов в микроволновой печи "Sumsung" при мощности 800 Вт в течение 10 минут в цитратном буфере при рН 6,0 [5].
Для изучения разных типов коллагена первичными антителами были моноклональные антитела к коллагену первого типа (Isotype Ig G1, Chemicon International), коллагену второго типа (клон COLL-II, Isotype Ms Ig G1-kappa, Chemicon International), коллагену третьего типа (Isotype Ig G1, Chemicon International) и коллагену четвертого типа (клон CIV 22, Dako Cytomation). В качестве растворителя антител использовали раствор Antibody Diluent (Dako Cytomation). Дальнейшую обработку проводили с помощью системы визуализации En vision (DAKO) в течение 10 минут с каждым реактивом с биотинилированными антителами и стрептавидин-пероксидазным комплексом. Затем проводили реакцию с хромогеном DAB (Dako Cytomation), оценивая качество взаимодействия под контролем микроскопа на протяжении от 20 секунд до 3 минут. Для адекватного представления структуры ткани срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 минут. Результат расценивали как позитивный при выпадении солей хромогена на коллагеновых волокнах поджелудочной железы. С целью контроля метода была проведена серия исследований с использованием позитивных и негативных образцов, которые служили эталонами. Волокна позитивные по отношению экспрессии маркеров изучали как минимум на 5-ти срезах. В каждом из них определяли количество окрашенных в коричневый цвет коллагеновых волокон в 10 полях зрения на площади 502,08 мкм2 (увел. х 400 микроскопа «Olympus CX-41») с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову [1].
Результаты исследования и их обсуждение. Как показали наши исследования, первое появление единичных коллагеновых волокон III типа в эмбриональной соединительной ткани развивающейся поджелудочной железы обнаруживается у зародышей в возрасте 45 суток (16 мм длины) в области формирующейся капсулы. Вероятно, в эмбриональном периоде в различных органах первыми появляются именно коллагеновые волокна третьего типа [10]. Клеточные элементы уплотнены в этой области и обнаруживают первые признаки дифференцировки в молодые фибробласты. В дальнейшем нежная сеть коллагеновых волокон III типа обнаруживается у зародышей в возрасте 46-49 суток (17-20 мм длины) между эпителиальными закладками железы, вокруг главного выводного протока дорзальной закладки и протоков 1-го порядка. В капсуле эти волокна наиболее многочисленны и сравнительно толстые. У зародышей в возрасте 50 суток (21-мм длины) формирующийся волокнистый каркас поджелудочной железы пополняется коллагеновыми волокнами I типа, которые впервые обнаруживаются в капсуле железы в виде единичных волокон. В более старшем возрасте (зародыши в возрасте 52-60 суток, 23-30 мм длины) коллагеновые волокна III типа образуют широкопетлистую сеть, наиболее выраженную вокруг главного выводного протока и протоков первого порядка. Стенки протоков 2-го и 3-го порядка имеют меньшее количество более тонких коллагеновые волокна III типа, среди клеточных элементов которых проходят пучки сложно переплетающихся волокон. Коллагеновые волокна I типа повторяют те же закономерности появления и гистотопографии, что и коллагеновые волокна III типа. В сравнительном отношении коллагеновые волокна III типа всегда преобладают и являются более толстыми. Соотношение коллагеновых волокон первого и третьего типа 1,6:3,3. В 62 суток (зародыши 32 мм длины) в строме поджелудочной железы впервые выявляются коллагеновые волокна II типа. Они тонкие, немногочисленные и их количество заметно не увеличивается до конца изученного периода эмбриогенеза. Коллагеновые волокна II типа вплетаются в волокнистый каркас железы между закладками выводных протоков, сгущаясь вокруг кровеносных сосудов. В капсуле они полностью отсутствуют. В 11 недель (зародыши 46-56 мм длины) в базальной мембране кровеносных сосудов, кровоснабжающих поджелудочную железу, впервые обнаруживаются коллагеновые волокна IV типа. В базальной мембране эпителия выводных протоков таких
волокон нет. К концу 12-й недели пренатального развития (зародыши 70 мм длины) строма органа между закладками выводных протоков и ацинусов образована коллагеновыми волокнами I, II и III типов (рис.), находящимися в соотношении 2,8:1,8: 6,2.
Наиболее яркими по связыванию бензидиновой метки и более крупными являются коллагеновые волокна III типа. Самые толстые коллагеновые волокна I и III типов образуют капсулу железы. Здесь их соотношение 3,7:9,1. Коллагеновые волокна IV типа имеются только в базальной мембране эндотелия кровеносных сосудов. В базальной мембране ацинусов и выводных протоков этот вид коллагена отсутствует, хотя известно, что в базальных мембранах этих образований взрослых мышей коллаген IV типа обнаруживается [11].
A'
> у>1,
:у ф Я 'jy -.. ' б
Wr^ri $ *mJr v/» а
Рис. Срезы поджелудочной железы зародыша 12 недель, 70 мм длины. Окраска иммуногистохимическим методом. Дополнительное окрашивание гематоксилином Майера. Визуализация в системе En vision. а - позитивная реакция на коллаген первого типа; б - позитивная реакция на коллаген третьего типа.
Интересно отметить, что на ранних стадиях развития бензидиновая метка появляется не только на коллагеновых волокнах соответствующего типа, но и в цитоплазме эпителиальных клеток закладок выводных протоков. У более поздних зародышей такая окраска эпителиальных клеток отсутствует. Возможно, не только фибробласты поджелудочной железы принимают участие в биосинтезе коллагеновых волокон у ранних зародышей, о чем имеются единичные сообщения в доступной литературе [9].
1.В строме поджелудочной железы человека к 12-ти неделям эмбриогенеза присутствуют коллагеновые волокна I, II и III типов. Коллагеновые волокна IV типа имеются только в базальной мембране эндотелия кровеносных сосудов.
2. Первыми появляются коллагеновые волокна III типа в капсуле железы у зародышей в возрасте 45 суток (16 мм длины). Коллагеновые волокна I типа впервые обнаруживаются здесь же, но позднее у зародышей в возрасте 50 суток (21-мм длины). Коллагеновые волокна I типа повторяют динамику и гистотопографию коллагеновых волокон III типа, но их значительно меньше.
3. Коллагеновые волокна II типа присутствуют только в строме поджелудочной железы после 62 суток развития (зародыши 32 мм длины) и заметно не увеличиваются количественно и в толщину до конца изученного периода эмбриогенеза.
4. Коллагеновые волокна IV типа входят в состав базальной мембраны эндотелия кровеносных капилляров, начиная с 11 недель гестации (зародыши 46-56 мм длины).
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов - Москва: Медицина, 1991. - 380 с.
2. Ахтемийчук Ю. П. eмбрiотопографiчнi взаемовщношення дванадцятипало'Г кишки з органами та структурами черевно' порожнини / Ю.П. Ахтемийчук // Таврический мед.-биол. Вестник. - 2002. - Т.5, №3. - С. 23-25.
3. Галкина Ю. М. Развитие и строение органов человека и млекопитающих животных в онтогенезе / Ю. М. Галкина // Российские морфологические ведомости. - 1999. - N 1-2. - 49с.
4. Кокощук Г. I. Структурне забезпечення функцюнальноТ' активност пщшлунковоТ' залози в ембрюнгальному пер^ розвитку людини / Г. I. Кокощук, Г. М. Черткова // Буковин. мед. вюник. -1999. - №1. - С.116-120.
5. Коржевский Д. Э. Применение методов теплового демаскирования антигенов на парафиновых срезах головного мозга крысы / Д. Э. Коржевский, Е. А. Юмкина // Морфология. - 2005. - Т. 127, № 2. - С. 76-77.
6. Шаповалова Е. Ю. Особенности биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железой и окончательной почкой в раннем эмбриогенезе у человека при маточной имплантации / Е. Ю. Шаповалова, Т. А. Бойко, Н. И. Майструк // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т. 11, № 2. - С. 182-186.
7. Gittes G. K. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors / G. K. Gittes, P. E. Galante, D. Hanahan // Development. - 1996. - Vol.122. - P.439-447.
8. Myers J. C. Biochemical and immunochistochemical characterization of human type XIX defines a novel class of basement membrane zone collagens / J. C. Myers, A. Bageris, V. Abraham // Am. J. Pathol. - 1997.
- V. 151, N 6. - P. 1729-1740.
9. Sandberg M. M.. Co-expression of collagens II and XI and alternative splicing of exon 2 of collagen II in several developing human tissues / M. M. Sandbera, H. E. Hirvonen, K. J. Elima // Biochem. J. - 1993. - V. 294, N 2. - P. 595-602.
10. Sandberg M. M. Construction of a human pro alpha 1 (III) collagen cDNA clone and localization of type III collagen expression in human fetal tissues / M. M. Sandbera, J. K. Makela, P. Multimaki // Matrix. - 1989.
- V. 9, V 2. - P. 82-91.
11. Jiang F. X. Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic beta-cells / F. X.Jiang, D. S. Cram, H. J. DeAizpurua // Diabetes. - 1999. - V. 48, N 4. - P. 722-730.
ЗАКОНОМ1РНОСТ1 ПОЯВИ I ЛОКАЛ1ЗАЦП КОЛАГЕНУ I, II, III I IV ТИП1В В РАННЬОМУ ЕМБР1ОГ1СТОГЕНЕЗ1 ПЩШЛУНКОВОТ ЗАЛОЗИ У ЛЮДИНИ ПРИ ТИПОВ1Й
1МПЛАНТАЦП Шаповалова О. Ю., Майструк Н. I., Дем'яненко I. А.
Становлення колагенового складу волокнистого каркасу пщшлунковоТ залози вивчене за допомогою методу iммуногистохимiТ у 124 зародюв людини у вiцi вщ 21 доби до 12 тиж^в вну^утробного розвитку, яю були фксированни формалшом i залит в парафш. Первинними антiтеламi були моноклональн антитта до колагену I, II, III i IV титв. Отримано, що в стромi пщшлунковоТ залози людини до 12-ти тиж^в ембрюгенезу присутн колагеновi волокна I, II i III титв. Колагеновi волокна IV типу е в базальнш мембран ендотелю кровоносних судин з 11-ти тижнв гестацп (зародки 46-56 мм довжини). Першими з'являються колагеновi волокна III типу в капсулi залози у зародюв у вiцi 45 дiб (16 мм довжини). Колагеновi волокна I типу вперше виявляються тут же тзнше у зародюв у вiцi 50 дiб (21 мм довжини). Колагеновi волокна I типу повторюють динамку i гистотопографю колагенових волокон III типу, але Тх значно менше. Колагеновi волокна II типу присутн в стромi пюля 62 дiб розвитку (зародки 32 мм довжини) i помто не збтьшуються юльюсно i в товщину до шця вивченого перюду ембрюгенезу.
Ключовi слова: пщшлункова залоза, колагеновi волокна, ембрюни людини.
REGULARITIES OF APPEARANCE AND LOCALIZATION OF COLLAGEN TYPES I, II, III AND IV IN HUMAN PANCREAS EARLY EMBRIOHISTOGENESIS DURING TYPICAL IMPLANTATION Shapovalova Ye. Yu., Maystruk N. I.,
Demyanenko I. A. Becoming of collagen composition of fibril framework of pancreas was studied by the method of immunohistochemistry on 124 human embryos in age from 21 days to 12 weeks of intrauterine development. Embryos were fixed in formalin and embedded in the paraffin. Primary antibodies were monoclonal antibodies to the collagen types I, II, III and IV. It was received, that in 12 weeks of embryogenesis stroma of human pancreas consisted of collagen fibers types I, II and III. The collagen fibers of the type IV were present from the 11 weeks of gestation (embryos 46-56 mm of length) in the basal membrane of blood vessels endothelium. The collagen fibers type III appeared firstly in the capsule of embryos gland in age 45 days (16 mm of length). The collagen fibers type I firstly revealed here in age 50 days (21mm of length). The collagen fibers type I repeated histotopography of collagen fibers type III, but they considerably less. Collagen fibers type II were in stroma after 62 days of development (embryos 32 mm of length) and notably not increased in number and in a thickness to the end of the studied period of embryogenesis.
Key words: pancreas, collagen fibers, human embryos.
