CC BY
15УДК 582.281.21:616-002.828
DOI: 10.24412/1999-6780-2021-1-53-56
ОБРАЗОВАНИЕ ГИГАНТСКИХ
КЛЕТОК ШТАММАМИ ГРИБОВ РОДА LICHTHEIMIA, ВЫДЕЛЕННЫМИ ОТ БОЛЬНЫХ МУКОРМИ-КОЗОМ
Ковыршин C.B. (студент), Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, Чилина Г.А. (зав. лаб.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Изучена способность формировать гигантские клетки у 9 штаммов Lichtheimia spp. (L. corymbifera, L. ramosa, L. ornata). Установлено, что образование данных структур лучше всего наблюдать при выращивании культур грибов на картофельно-глюкозном агаре и среде Са-буро. Максимального развития гигантские клетки достигают на 2-3-й неделях роста культуры.
Ключевые слова: гигантские клетки, Lichtheimia
GIANT CELLS FORMATION IN LICHTHEIMIA SPP. ISOLATES FROM PATIENTS WITH MUCORMYCOSIS
Kovyrshin S.V. (student), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
The ability to form giant cells was sttidied in 9 strains of Lichtheimia spp. (L. corymbifera, L. ramosa, L. ornata). The formation of these structures was better observed for fungal cultures on potato-dextrose agar and Sabouraud glucose agar. Giant cells reached their maximal development after 2 or 3 weeks of growth.
Key words: giant cells, Lichtheimia
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Lichtheimia - одни из основных возбудителей мукормикоза [1]. Точную видовую идентификацию мукоромицетов выполняют молекуляр-но-генетическими методами, однако предварительную идентификацию родов и видов возбудителей можно провести по морфологическим особенностям культур грибов, что доступно для клинических микробиологических лабораторий. Одним из отличи-
* Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, e-mail: tatiyana.bogomolova@szgmu.ru
тельных фенотипических признаков Lichtheimia spp. являются гигантские клетки (ГК) — сильно вздутые, ветвящиеся или неветвящиеся гифы, часто с каплевидными включениями, имеющие толстые клеточные стенки [2-3].
Известно, что разные виды рода Lichtheimia проявляют различную скорость роста на питательных средах, особенно при повышенных температурах [3, 4]. Эти особенности также важно учитывать при фенотипической идентификации культур Lichtheimia spp.
Цель работы — выявление и сравнение строения ГК у разных видов и штаммов грибов рода Lichtheimia, выделенных из биоматериалов больных мукормикозом, исследование образования гигантских клеток на разных питательных средах, изучение скорости роста культур Lichtheimia spp. при 45 °С.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучено 9 штаммов Lichtheimia spp., полученных из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина: L. corymbifera (РКПГ F-1837; РКПГ F-1493; РКПГ F-2020; РКПГ F-1568; РКПГ F-1601), L. ramosa (РКПГ F-1456; РКПГ F-2007; РКПГ F-2019), L.ornata (РКПГ F-1507).
Все штаммы Lichtheimia spp. были выделены от пациентов с различными клиническими формами мукормикоза и идентифицированы до вида с помощью молекулярно-генетических методов.
Каждый штамм рода Lichtheimia был пересеян на картофельно-глюкозный агар (КГА), сусло-агар и агар Сабуро. Посевы инкубировали при t° 28 °С в течение 2-4 недель. Микроскопическое исследование колоний проводили 1 раз в неделю, отмечали наличие и особенности строения гигантских клеток (ГК). Выполняли фотодокументирование результатов исследования с помощью микроскопа Leica DM LB2 со встроенной камерой DFC320 (Leica, Германия).
Для изучения скорости роста каждый штамм был инкубирован при 45 °С в чашках Петри с агари-зованной средой Сабуро в течение 3 суток с последующим измерением диаметра колоний.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Скорость роста культур при 45 °С.
После 72 ч культивирования на агаре Сабуро диаметры колоний составили: для L. ornata — 4 см, L. ramosa - 7 см, L. corymbifera - от 4 до 6 см в зависимости от штамма. Полученные размеры колоний соответствуют описанию видов, приведенному в атласе клинически значимых грибов G.S. de Hoog et al. [4]. Максимальной скоростью роста при 45 °С обладают штаммы вида L. ramosa.
Образование гигантских клеток у исследуемых штаммов Lichtheimia spp.
В результате культивирования штаммов разных видов в течение трех недель и наблюдения за изменениями в их морфологическом строении с помощью микроскопического исследования удалось выявить для каких видов характерно наличие гигантских клеток и на каких средах они образуются.
Все штаммы L. corymbifera формировали разнообразные по форме ГК через 2 недели (Рис. 1).Были замечены образования как сферической, так и неправильной (разветвленной), а иногда даже расплывающейся во все стороны формы. Гигантские клетки проходили разные стадии созревания, были разнообразных размеров, иногда заполняющих всё поле зрения микроскопа. Наиболее активное образование ГК наблюдали на КГА и на среде Сабуро, и только через 3 недели единичные ГК были обнаружены на сусло-агаре (табл. 1-3). Через 2,5 недели с начала роста культур огромное количество образований заполнили полностью окружающую мицелий среду. Через 3 недели они присутствовали, но в гораздо меньших количествах.
Штамм L.ornata проявил наименьшую активность образования ГК. На протяжении 3 недель посредством микроскопии выявлено малое количество разветвленных клеток на КГА и среде Сабуро и не было обнаружено таковых на сусло агаре (Рис.2 А, Б, табл. 1-3).
Штаммы L. ramosa показали самое большое разнообразие форм гигантских клеток. За исключением сусло-агара, испытанные питательные среды были благоприятными для образования ГК. Колонии, растущие на КГА, образовывали максимальное количество клеток шарообразной и разветвленной формы на 2 неделе роста, впоследствии их число уменьшилось (Рис. 3, табл. 1-3). На среде Сабуро наблюдали схожее с КГА количество гигантских клеток на всем протяжении культивирования. По сравнению с L. corymbifera, штаммы L. ramosa формировали ГК меньших размеров, в основном свободно расположенные, а не интеркалярные.
Таблица 1
Интенсивность образования гигантских клеток штаммами
Lichtheimia spp. на агаризованной среде Сабуро
Штамм Длительность культивирования
1 неделя 2 недели 3 недели 4 недели
L.corym bífera PKIYF-1837 + + + + + + + +
L.corym bífera PKIYF-1493 + + + + + + +
L.corym bífera PKIYF-2020 + + + + + +
L.corym bífera PKIYF-1568 + + + + + + +
L.corym bífera PKIYF-1601 + + + + + + + +
L.ornata PKIYF-1507 - - - +
L. ramosa PKIYF-2007 + + + + + + + +
L. ramosa PKIYF-1456 + + + + + + + +
L. ramosa PKIYF-2019 + + + + + + + +
Таблица 2 Интенсивность образования гигантских клеток штаммами ИсМЬеШа эрр. на картофельно-глюкозном агаре
Штамм Длительность культивирования
1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя
L.corym bífera PKIYF-1837 + + + + + + +
L.corym bífera PKIYF-1493 + + + + + + + ++
L.corymbifera PKIYF-2020 + + + + + + +
L.corym bífera PKYF-1568 + + + + + + ++
L.corym bífera PKIYF-1601 + + + + + + + +
L.ornata PKYF-1507 - - + +
L. ramosa PKIYF-2007 + + + + + + + +
L. ramosa PKIYF-1456 + + + + + + + + ++
L. ramosa PKIYF-2019 + + + + + ++ ++
Таблица 3
Интенсивность образования гигантских клеток штаммами _ЦсМИеша эрр. на сусло агаре_
Штамм Длительность культивирования
1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя
L.corym bífera PKYF-1837 + + + -
L.corym bífera PKIYF-1493 + + + -
L.corym bífera PKIYF-2020 - - + +
L.corym bífera PKYF-1568 - - + +
L.corym bífera PKIYF-1601 + + + + +
L.ornata PKYF-1507 - - - -
L. ramosa PKIYF-2007 + + + +
L. ramosa PKIYF-1456 + + + +
L. ramosa PKIYF-2019 + + + + +
Примечание к табл. 1-3: + - единичные ГК, + + - от 5 до 10 ГК, + + + - более 10 ГК в микропрепарате.
Рис.1. Гигантские клетки штаммов /.. согутЬ^ега. А - штамм РКПГ Р-1837, КГА, 2 неделя роста, ув. хЮО; Б - штамм РКПГ Р-1837, среда Сабуро, 3 неделя роста, ув. хЮО; В - штамм РКПГ Р-1493, среда Сабуро, 2 неделя роста, ув. х400; Г - штамм РКПГ Р-1837, среда Сабуро, 2 неделя роста, ув. хЮО.
Рис. 2. Гигантские клетки ЫсМЬеша ота£а РКПГ Р-1507, КГА, 2 недели роста, ув. х400. А - начальная стадия формирования ГК; Б - разветвленная ГК с большим количеством капель масла.
Рис. 3. Гигантские клетки штаммов L. ramosa. А - штамм РКПГ F-1456, КГА, 2 неделя роста, округлая форма, ув.х400; Б -штамм РКПГ F-1456, КГА, 2 неделя роста, разветвленная форма, ув.хЮО; В - штамм РКПГ F-2007, среда Сабуро, 3 неделя роста, ув.х400; Г - штамм РКПГ F-2007, КГА, 3 неделя роста, округлая форма с ослизнением, ув.х400.
ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование ГК является отличительным признаком мукоромицетов из рода ЫсЫкетга [2-4].
В литературе имеются сведения о различиях в интенсивности образования и формах ГК у разных видов рода ЫсЫИет1а при выращивании на различных питательных средах [3-4]. В связи с этим нами было проведено исследование способности к образованию ГК у изолятов 1лсЫкеита эрр., выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге.
Из трех испытанных нами сред эффективными для изучения способности лихтеимий к образованию ГК оказались агар Сабуро и среда КГ А, обеспечивающие активную продукцию ГК и максимальное разнообразие форм этих клеток. Сусло-агар является неподходящей средой для образования ГК у мукоромицетов.
В нашем исследовании наименьшую активность в продукции ГК проявил штамм /.. отсНа. По данным зарубежных исследователей [4], этот критический вид можно отличить от основного вида /.. согутЫ/ега по образованию крупных, сильно разветвленных ГК при выращивании на агаре с дрожжевым экстрактом, тогда как штаммы /.. corymbifera не образуют ГК на этой среде. В связи с этим планируется продолжить исследование единственного имеющегося в РКПГ штамма Ь. огпаШ на среде с дрожжевым экстрактом.
Мы подтвердили, что оптимальным временем культивирования мукоромицетов для наблюдения ГК является срок 2-3 недели. Также полученные нами результаты изучения скорости роста различных видов ¡ЛсЫкеита при температуре 45 °С совпали с указанными в научной литературе и подтвердили правильность идентификации культур.
При исследовании культур ЫсШкегтга эрр. разного возраста стало возможным детальное изучение морфологии ГК и стадии их развития. Клетки могут быть как интеркалярными, так и свободно находящимися в среде. На молодых культурах заметны крупные вздутия мицелия, к которым стягиваются вакуоли с питательными веществами. Согласно данным А1а8йпеу-Ьдшегс1о А. и соавторов [3], затем ГК
начинают удваивать количество мембран, толщина которых варьируется от 3 до 14 мкм. На более поздних стадиях своего созревания ГК имеют внутри себя большое количество капель масла и других веществ, а также выходящие из внутренней части выросты, которые имеют в себе небольшое количество вакуолей. Далее возможно ослизнение ГК (Рис. 3 Г). По форме клетки варьируются от шарообразных с четким выделением описанных выше элементов до разветвленных образований, в том числе пальцевидной формы, не имеющих слизи и выростов, но содержащие в себе намного больший объем вакуолей.
Вероятно, гигантские клетки являются структурами, предназначенными для запасания питательных веществ. Они имеют в своем строении вакуоли с питательными веществами, в том числе с каплями масла.
ВЫВОДЫ
Все изученные штаммы Lichtheimia spp. проявили способность к образованию ГК, при этом наибольшее разнообразие форм клеток получено на КГА. Наибольшую интенсивность образования ГК наблюдали на 2-3 неделях роста культур.
Штаммы L. ramosa формировали ГК быстрее, чем штаммы двух других видов. Изоляты !.. ramosa и L. corymbifera проявили разнообразие в форме гигантских клеток: обнаружены как сферические, так и разветвленные формы, а у штаммов L. ramosa отмечали также ослизняющиеся ГК.
Изученный штамм !.. ornato был наименее активен в образовании ГК, так как ни большого количества, ни разнообразия форм этих клеток не было выявлено.
Планируются дальнейшие исследования процессов формирования ГК у культур мукоромицетов с использованием большего количества штаммов и дополнительных питательных сред.
Работа выполнена в рамках Государственного задания «Изучение морфо-биологическш особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитами» (2019-2021 гг.). ЛИТЕРАТУРА
1. Хостелиди С.Н., Шадривова О.В., Борзова Ю.В. и др. Клинико-лабораторные особенности мукормикоза у взрослых. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (2): 22-27. [Khostelidi S.N., Shadrivova O.V., Borzova Yu.V., et al. Clinical and laboratory features of mucormycosis in adults. Problems in Medical Mycology. 2020; 22 (2): 22-27 (InRuss)]. doi:10.24412/1999-6780-2020-2-22-28
2. Саттон Д., Фотергилл А., Ринапъди M. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. М.: Издательство «Мир», 2001: 486 с. [Sutton D., Fothergill A., Rinaldi M. Determinant of pathogenic and conditionally pathogenic fungi. M.: Mir Publishing House, 2001: 486 p. (In Russ)].
3. Alastruey-Izquierdo A., Hoffmann K., de Hoog G.S., et al. Species recognition and clinical relevance of the zygomy-cetous genus Lichtheimia (syn. Absidia Pro Parte, My codachis). J. Clin. Microbiol. 2010. 48: 2154-2170. doi: 10.1128/JCM.01744-09
4. Atlas of Clinical Fungi (electronic version) CBS 201 Поступила в редакцию журнала 31.03.2021 Рецензент: H.A. Босак
