ОБОСНОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИММУННЫХ МАРКЕРОВ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ЭФФЕКТА В УСЛОВИЯХ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ РИСКА НА РАБОТНИКОВ ГОРНОРУДНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 613.64: 616.717-057

О.В. Долгих1'2'3, Н.В. Зайцева1'2, А.В. Кривцов1, К.Г. Горшкова1, Д.В. Ланин1'2, О.А. Бубнова1'2, Д.Г. Дианова1,

Т.С. Лыхина1, Н.А. Вдовина1

ОБОСНОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИММУННЫХ МАРКЕРОВ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ЭФФЕКТА В УСЛОВИЯХ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ РИСКА НА РАБОТНИКОВ ГОРНОРУДНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения»

82, ул. Монастырская, г. Пермь 614045, Россия 2ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

15, ул. Букирева, Пермь 614990, Россия 3ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» 29, Комсомольский просп., г. Пермь 614990, Россия

Проведена оценка и обоснование иммунологических и генетических маркеров в условиях комбинированного воздействия факторов риска на работников горнорудной промышленности. Проанализированы особенности полиморфизма 29 генов, вариантные аллели которых могут принимать участие в формировании производственно обусловленной патологии, и представляющие собой маркеры чувствительности риска ее возникновения. Подобрана ассоциация генов, характеризующаяся достоверно измененным по отношению к группе сравнения полиморфизмом (ген супероксиддисмутазы SOD2, ген рецептора дофамина ANKK1, ген сульфтрансаминазы SULT1A1, ген мети-лентетрагидрофолатредуктазы MTHFR, ген эндотелиального фактора роста VEGF, ген фактора некроза опухоли TNFальфа), которая в условиях комбинированного воздействия вредных производственных факторов (пыль сильвинита, шум) горнорудной промышленности может служить адекватным комплексом маркеров чувствительности развития производственно обусловленной патологии. Наблюдалась повышенная продукция маркеров иммунной цитокиновой регуляции: фактора некроза опухоли и васкулярного эндотелиального фактора роста. В качестве маркеров чувствительности рекомендованы гены SOD2, ANKK1, SULT1A1, MTHFR, VEGF, TNFальфа, а кодируемые ими цитокины (фактор некроза опухоли и эндотелиальный фактор роста) — в качестве маркеров эффекта при оценке риска здоровью работников горнорудной промышленности.

Ключевые слова: полиморфизм генов, пыль сильвинита, шум, маркеры.

OV.Dolgikh1'2,3, NV.Zaitseva1'2, AV.Krivtsov1, K.G.Gorshkova1, DV.Lanin1'2, O.A.Boubnova1'2, D.G.Dianova1, T.S.Lykhina1, N.AVdovina1. Justifying genetic and immune markers of efficiency and sensitivity under combined exposure to risk factors in mining industry workers

«Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies»

82, Monastyrskaya St., Perm 614045, Russia

2FSBEIHPE «Perm State National Research University»

15, Bukireva St., Perm 614990, Russia

3FSBEI HPE «Perm State National Research Polytechnic University»

29, Komsomolsky Pr., Perm 614990, Russia

The authors evaluated and justified immunologic and genetic markers under combined exposure to risk factors in mining industry workers. Analysis covered polymorphism features of 29 genes with variant alleles possibly participating in occupationally conditioned diseases formation and serving as sensitivity markers of these diseases risk. The genes association selected demonstrates reliably changed polymorphism vs. the reference group (SOD2 superoxide dismutase gene, ANKK1 dophamine receptor gene, SULT1A1 sulphtransaminase gene, MTHFR methylene tetrahydrofolate reductase gene, VEGF endothelial growth factor gene, TNF-alpha tumor necrosis factor gene). Under combined exposure to occupational hazards (sylvinite dust, noise) in mining industry, this association can serve as adequate marking complex of sensitivity to development of occupationally conditioned diseases. Increased production of immune cytokine regulation markers: tumor necrosis factor and vascular endothelial growth factor. Genes SOD2, ANKK1, SULT1A1, VEGF, TNFalpha are recommended as sensitivity markers, and the coded cytokines (tumor necrosis factor and endothelial growth factor) are proposed as effect markers in evaluation of health risk for workers in mining industry.

Key words: gene polymorphism, sylvinite dust, noise, markers.

Для сохранения здоровья трудоспособного населения важнейшее значение приобретают разработка и внедрение научно обоснованных лечебно-профилактических мероприятий, направленных на снижение уровня производственно обусловленной заболеваемости [1-4]. Поскольку отклонения в общей иммунологической реактивности могут проявиться даже при относительно низких уровнях воздействия комбинации физических (шум) и химических (аэрозоли) вредных производственных факторов, особенно актуальной является задача своевременного выявления маркеров возникающих патологических изменений [3-5]. При этом актуальной задачей является ранняя диагностика нарушений генетической предрасположенности и иммунной реактивности работающих на основе обоснования комплекса маркерных показателей чувствительности и эффекта [6-10].

Цель работы — определить генетические и иммунологические маркеры производственно обусловленных нарушений здоровья работающих, занятых во вредных производственных процессах на примере предприятия горнорудной промышленности Пермского края.

Материалы и методы. В обследовании приняли участие 132 работника горнодобывающего производства, машинисты горных выемочных машин, средний возраст 36,6±1,0 год, средний стаж 7,3±0,9, занятых на подземных работах, условия труда которых относятся к вредным 3-й степени 3-го класса (3.3 согласно Р 2.2.2006-05). Группу сравнения составили 53 человека, занятые профессиональной деятельностью в отсутствии изучаемых вредных факторов, средний возраст — 40,2±2,7 лет, средний стаж — 5,8±1,9 года. Группы были сопоставимы по возрасту, полу, стажу и этнической принадлежности.

Анализ функционального состояния иммунной системы проводился с использованием в качестве объекта фагоцитоза формалинизированных эритроцитов барана, метода радиальной иммунодиффузии по Ман-чини при определении сывороточных иммуноглобулинов, иммуноферментного анализа для идентификации межклеточных медиаторов фактора некроза опухоли и васкулярного эндотелиального фактора роста. Статистическую обработку результатов проводили с помощью описательной статистики и двухвыборочного 1>критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

Забор материала для ПЦР проводили методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Для определения генотипов использовали вариант ПЦР в режиме реального времени с помощью флюоресцентных меток и метод аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиготами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливают по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров. Амплификацию и детекцию осуществляли с помощью термоциклера CFX96, используя структуру праймеров и параметры темпе-

ратурных циклов, описанных в литературе. Для одновременной детекции нескольких продуктов реакции использовали разные флюоресцентные метки и зонды (мультиплексная ПЦР). В ходе исследования проводилось изучение полиморфизма 29 патогномонич-ных генов: гены подсемейства цитохрома, MTHFR, GSTA4 (глутатион-трансфераза), CPOX, SULT1A1, SOD2, ZMPSTE24 (цинк-металлопептидаза), ESR1, TERT, DRD2, SIRT1, TLR4 (толл-рецептор 4), система генов пироксисом PPAR, FAS, FOXP3, VEGF, APO-E, NO-синтаза, ММР, ТОТальфа, p53, BRCA1), HLA DR, согласно методическим рекомендациям «Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов» (МР 4.2.0075- 13 от 20.08.2013).

Обработка данных по генотипированию проводилась с использованием унифицированной программы «Ген Эксперт». Данная программа служит для расчета статистических параметров в исследованиях «случай-контроль», использующих SNP (диагностику однонуклеотидных полиморфизмов). Использовались статистические методы для описания равновесия частот генотипов и аллелей генов по равновесию Харди-Вайнберга.

Комплекс вредных производственных условий, действующих на работников основной группы, представлен такими факторами как тяжесть трудового процесса, шум, давление, запыленность воздуха, с высоким уровнем профессионального риска в отношении болезней органов дыхания, сердечно-сосудистой, нервной и ко стно-мышечной систем. При этом на рабочих местах отмечено существенное превышение установленных гигиенических нормативов по пыли, концентрация которой с преобладанием взвешенных частиц РМ10 составила 11,4-12,3 ПДК.

Результаты. Анализ показателей иммунной регуляции выявил у обследованных отклонения в функционировании клеточного врожденного звена иммунитета. У 76,5% работников группы наблюдения выявлено уменьшение фагоцитарной активности относительно референтного диапазона, а также снижение фагоцитоза в 72,7% случаев по сравнению с группой сравнения (p<0,05) (табл.1).

Уровни сывороточных иммуноглобулинов у большинства обследованных отличались от значений физиологической нормы, причем повышенная в 1,4 раза продукция IgA сочеталась со снижением содержания IgM (у 88,5% проб), достоверное изменение которого было отмечено также относительно группы сравнения (p<0,05).

Особенности межклеточной иммунной регуляции проявились в достоверном повышении (в 1,9 раза по сравнению с контрольными показателями) уровня проапоптотического цитокина фактора некроза опухоли. Маркер состояния эндотелия васкулярный эн-дотелиальный фактор роста при отсутствии значимых различий с группой сравнения достоверно отклонялся

Таблица 1

Показатели иммунного статуса и маркеры эффекта работников горнорудной промышленности

Показатель Группа сравнения (n=53) Группа наблюдения (n=132)

Абсолютный фагоцитоз, 109/дм3 1,892±0,296 1,417±0,122*

Процент фагоцитоза, % 43,189±4,359 33,114±2,001*

Фагоцитарное число, у.е. 0,733±0,088 0,605±0,052*

Фагоцитарный индекс, у.е. 1,668±0,062 1,773±0,046

г/дм3 11,016±0,519 11,365±0,332

^М, г/дм3 1,392±0,086 1,258±0,061*

^А, г/дм3 2,327±0,173 2,296±0,104

Маркеры эффекта

Васкулярный эндотели-альный фактор роста, пг/ см3 298,464±65,881 308,909±40,309

Фактор некроза опухолей, пг/см3 0,783±0,18 1,773±0,161*

Эритропоэтин, мМЕ/см3 - 19,891±5,429

Примечание. * — разница достоверна по отношению к группе сравнения (р<0,05)

от физиологической нормы по критерию кратности превышения (р<0,05).

Результаты генетического анализа 29 генных полиморфизмов у работающих позволили выявить ключевые гены, распространенность полиморфизмов которых достоверно отличалась от группы сравнения (p<0,05) (табл.2).

Преобладанием патологического гомозиготного генотипа над показателями группы сравнения отличался полиморфизм генов детоксикации, в частности генов сульфтрансаминазы SULT1A1 и мети-лентетрагидрофолатредуктазы MTHFR, связанных со 2-й фазой детоксикации ксенобиотиков (частота мутантного аллеля превышала аналогичную в группе сравнения более чем в 1,5 раза).

Кроме того, с повышенной в 2,5-3,0 раза распространенностью встречались в мутантном гомозиготном варианте: определяющий состояние эндотелия ген васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF); ген дофаминового рецептора ANKK1, ассоциированный с неврологическими заболеваниями; ген супероксиддисмутазы SOD2 уменьшающий последствия негативных воздействий факторов среды и препятствующий запуску перекисного окисления липидов, также повышенной частотой минорного аллеля характеризовался ген фактора некроза опухоли (TNF), отвечающий за иммунный ответ и апоптоз, прежде всего за счет гетерозиготного генотипа.

В таблицах 3 и 4 представлены примеры проведенного статистического анализа генетических отклонений однонуклеотидного полиморфизма (SNP)

Таблица 2

Особенности генетического полиморфизма у работающих предприятия горнорудной промышленности (р<0,05)

Ген Генотип/ аллель Группа наблюдения (n=75), % Группа сравнения (n=49), %

СС 40 72,2

CA 52 17,8

SOD2 АА 8 0

С 66 86,1

А 34 13,9

СС 56 91,7

CT 40 8,3

ANKK1 TT 4 0

С 76 91,7

Т 24 8,3

GG 52 38,5

GA 37 61,5

SULT1A1 АА 11 0

G 42 69,2

А 58 30,8

GG 36 72,7

GА 52 27,3

MTHFR АА 12 0

G 62 81,2

А 38 18,8

GG 44 72,7

GC 36 27,3

VEGF СС 32 0

G 50 81,2

С 50 18,8

GG 84 100

GА 16 0

TNF АА 0 0

G 92 100

А 8 0

гена SOD2 (супероксиддисмутазы) между выборками «случай» — работники группы наблюдения и «контроль» — работники, составившие группу сравнения.

Таблица 3

SNP-различия гена SOD2 между группами наблюдения и сравнения (мультипликативная модель, тест хи-квадрат, df = 1)

Аллели Случай Контроль х2 p OR

n = 25 n = 18 знач. 95% CI

Аллель С 0,660 0,861 4,45 0,04 0,31 0,10-0,95

Аллель А 0,340 0,139 3,19 1,05-9,70

Таблица 4

SNP-различия гена SOD2 между группами наблюдения и сравнения (аддитивная модель наследования — тест Кохрана-Армитаджа для линейных трендов, х1 = [0,1,2], df = 1)

Генотипы Случай Контроль х2 Р OR

n = 25 n = 18 знач. 95% CI

Генотип С/С 0,400 0,722 4,94 0,03 0,26 0,07-0,95

Генотип С/А 0,520 0,278 2,82 0,77-10,29

Генотип А/А 0,080 0,000 3,94 0,18-87,11

Группы выборок «случай» и «контроль» находятся в равновесии Харди-Вайнберга, поэтому данные могут быть проанализированы с применением мультипликативной модели. Распределение частот генотипов в выборке «случай», не соответствующее равновесию Харди-Вайнберга, требует использовать общую или аддитивную модель. В нашем случае различие генотипов гена супероксиддисмутазы между выборками достоверно описывается как мультипликативной, так и аддитивной моделями.

Заключение. По результатам проведенного исследования у работающих во вредных производственных условиях горнорудной промышленности установлены существенные сдвиги иммунологических показателей, которые проявились в разнонаправленном изменении содержания сывороточных иммуноглобулинов, снижении фагоцитарной активности, активации медиаторов межклеточной цитокиновой регуляции. Проанализированы особенности полиморфизма 29 генов, вариантные аллели которых могут принимать участие в формировании производственно обусловленной патологии и представляют собой маркеры чувствительности риска ее возникновения. Результаты генетического анализа выявили неблагоприятные геномные нарушения в генах по отношению к группе сравнения за счет преимущественной распространенности мутантного гомозиготного генотипа. Подобрана ассоциация генов, характеризующаяся достоверно измененным по отношению к группе сравнения полиморфизмом (ген супероксиддисмутазы SOD2, ген рецептора дофамина ANKK1, ген сульфтран-саминазы SULT1A1, ген метилентетрагидрофолатре-дуктазы MTHFR, ген эндотелиального фактора роста VEGF, ген фактора некроза опухоли TNFальфа), а также кодируемые ими цитокины (фактор некроза опухоли и эндотелиальный фактор роста), которые в условиях комбинированного воздействия вредных производственных факторов (пыль сильвинита, шум) горнорудной промышленности могут служить адекватным комплексом маркеров чувствительности и эффекта развития производственно обусловленной патологии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (см. REFERENCES пп. 5-10)

1. Долгих О.В., Предеина Р. А., Дианова Д.Г. // Анализ риска здоровью. — 2014. — № 1. — С. 73-81.

2. Долгих О.В., Кривцов А.В., Гугович А.М. и др. // Мед. труда. — 2012. — № 12. — С. 30-33.

3. Зайцева Н.В., Долгих О.В., Дианова Д.Г. // Пермский медицинский журнал. — 2011. — № 5. — Т. 28. — С. 70-74.

4. Измеров Н.Ф. // Мед. труда. — 2006. — № 3. — С. 1-5.

REFERENCES

1. Dolgikh OV., Predeina R.A., Dianova D.G. // Analiz riska zdorov'yu. — 2014. — 1: Р. 73-81 (in Russian).

2. Dolgikh OV., Krivtsov A.V., Gugovich A.M. [et al.] // Industrial medicine. — 2012. — 12. — Р. 30-33 (in Russian).

3. Zaytseva N.V., Dolgikh OV., Dianova D.G. // Permskiy meditsinskiy zhurnal. — 2011. — 5. — Vol 28. — Р. 70-74 (in Russian).

4. Izmerov N.F. // Industrial medicine. — 2006. — 3. — Р. 1-5 (in Russian).

5. Dolgikh OV., Kharakhorina R.A., Dianova D.G., Gugovich A.M. // Proceedings of the 3rd International Academic Conference «Applied and Fundamental Studies». — 2013. — С. 149-152.

6. Falchetti R. [et. al.] // Life Sci. — 2001. — Vol. 70, № 1.

— Р. 81-96.

7. Gleichmann [et. al.] // Arch. Toxicology. — 1989. — № 63. — P. 257-273.

8. Gervasi P.G., Longo V., Naldi F. [et al.] // Biochem Pharmacol.

— 1991. — Vol. 41. — P. 177-184.

9. Krzystyniak K. [et. al.] // Environ Health Perspect. — 1995.

— Vol. 103, suppl 9. — P. 17-22.

10. Stiller-Winkler R [et. al.] // J Clin Epidemiol. — 1996. — Vol. 49 (5). — P. 527-534.

Поступила 17.10.2014

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Долгих Олег Владимирович,

зав. отд. иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», проф. каф. экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», д-р мед. наук, проф. E-mail: oleg@fcrisk.ru. Зайцева Нина Владимировна,

директор ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», д-р мед. наук, акад. РАН, проф. E-mail: root@fcrisk.ru. Кривцов Александр Владимирович,

зав. лаб. иммуногенетики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», канд. мед. наук. E-mail: krivtsov@fcrisk.ru.

Горшкова Ксения Геннадьевна,

науч. сотр. отд. иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», канд. мед. наук. Е-шаД: oleg@fcrisk.ru.

Ланин Дмитрий Владимирович,

ст. науч. сотр. отд. иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», доцент кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет», канд. мед. наук. Е-шаД: oleg@fcrisk.ru.

Бубнова Ольга Алексеевна,

мл. науч. сотр. отд. иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», студентка

магистратуры биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета. Е-шаД: oleg@fcrisk.ru.

Дианова Дина Гумеровна,

ст. науч. сотр. лаб. клеточных методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», канд. мед. наук. Е-шаД: dianovadina@rambler. ш.

Лыхина Татьяна Станиславовна,

зав. лаб. иммунологии и аллергологии ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения». Е-mail: oleg@fcrisk.ru.

Вдовина Надежда Алексеевна,

мл. науч. сотр. отдела иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения». Е-mail: oleg@fcrisk.ru.

УДК 613.64: 616.717-057

М.А. Землянова^2

ОЦЕНКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО И ГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА У РАБОТНИЦ КРАСИЛЬНО-ОТДЕЛОЧНЫХ ПРОИЗВОДСТВ ПОДГОТОВКИ ТКАНЕЙ

ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения»

82, ул. Монастырская, г. Пермь 614045, Россия 2 ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 15, ул. Букирева, Пермь 614990, Россия

В работе представлены данные об окислительной активности на уровне ДНК клетки, цитогенетических эффектах, содержании половых гормонов при воздействии вредных химических веществ у работниц красильно-отделоч-ных производств подготовки тканей. Показано, что у работниц профессий отбельщица, аппаратчица мерсеризации и аппретирования, заготовщица химических растворов и красок, оператор промывочного оборудования, имеется наиболее высокое содержание в крови марганца, свинца, толуола и ксилола относительно показателей в группе сравнения (в 1,5-1,8 раза), обусловленное воздействием вредных факторов производственного процесса. Установлены значимые различия между группами экспонированных и неэкспонированных работниц по показателям, характеризующим развитие негативных эффектов: повышение активности образования продуктов окисления ДНК клетки (по повышению уровня 8-OHdG в моче), повышение распространенности и видов полиморфизма хромосом, характеризующего генетическую нестабильность соматических клеток; дисбаланс половых гормонов (по повышению уровня пролактина и снижению ФСГ в сыворотке крови). Следствием данных процессов является нарушение функциональной активности органов малого таза, обусловливающее увеличение распространенности гормонза-висимой гинекологической патологии у работниц данного производства и отдаленных последствий у потомства.

Ключевые слова: химические факторы, цитогенетический статус, половые гормоны, окислительный стресс, кра-сильно-отделочное производство тканей.

M.A.Zemlianova1,2. Evaluating cytogenetic and hormonal state in female workers of dyeboard industry of fabric preparation

1Federal Research Center of Medical and preventive technologies of risk management to public health

82, Monastyrskaya St., Perm 614045, Russia

2FSBEIHPE «Perm State National Research University»

15, Bukireva St., 614990 Perm, Russia