CC BY
35
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2016 БИОЛОГИЯ Вып. 4
ЭКОЛОГИЯ
УДК 613.954:502.3+616.097
О. В. Долгиха'ь, А. В. Кривцов', К. Г. Старкова3, О. А. Бубнова3, Е. А. Отавина3, И. Н. АликиназЬ, Н. В. БезрученкоаЬ, М. А. Гусельниковь
а ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, Пермь, Россия ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВНЕШНЕСРЕДОВЫХ ФАКТОРОВ НА ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ
Проведена разработка технологий, принципов и методических подходов идентификации генетических маркеров ранних нарушений иммунного статуса населения в условиях хронической экспозиции техногенными факторами. Выполнена ДНК-детекция методами ПЦР и секвенирования полиморфных вариантов регуляторных и экзонных областей 37 генов. Предложены подходы к проведению генетического тестирования вероятности развития иммунных нарушений, заключающихся в идентификации следующих групп полиморфизмов: вариантных генов ферментов 1 и 2 фазы детоксикации; генов белков, участвующих в патогенезе техногенных нарушений в органах-мишенях и в обменных процессах; геноти-пирование предрасположенности к онкопролиферативным состояниям; определение иммуногенетиче-ских маркеров. Выявлены SNP (single nucleotide polymorphism) -особенности у детей в условиях экспозиции стронцием и нитратами, которые характеризовались избыточной распространенностью вариантных аллелей генов цитохрома р450, эндотелиального фактора роста (VEGF) и копропорфириногенок-сидазы (СРОХ). Использование современных биомедицинских технологий для типирования вариантных генов позволяет установить кандидатные полиморфизмы, реализующиеся в конкретных экологических условиях.
Ключевые слова: секвенирование; полиморфизм генов; стронций.
0. V. Dolgikh3 \ А. V. Krivtsov3, К. G. Starkova3, О. A. Bubnova3, Е. A. Otavina3,
1. N. Alikina3 \ N. V. Bezruchenko3 \ М. A. Guselnikovb
а FSC for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russian Federation b Perm State University, Perm, Russian Federation
TECHNOLOGIES OF IMMUNOGENETIC STUDIES FOR EVALUATION OF THE ENVIRONMENTAL FACTORS INFLUENCING THE PUBLIC HEALTH
The aim of this study is to develop the technologies, principles and methodological approaches for identification of the genetic markers of early disturbances in immune status of the population in conditions of chronic exposure to man-made factors. The DNA detection by PCR assay and sequencing of the polymorphic variants of the regulatory and exon regions of 37 genes, including, CYP 1A1, MTHFR, APO-E, CPOX, VEGF, NO-synthase, MMP, FAS, FOXp3, TNFalfa, HLA DR, p53 , BRCA1, etc. were executed. The offered methodical approaches include the identification of the following groups of polymorphism: enzymes of variant genes of the 1 st and 2nd detoxification phase; genes of proteins involved both in metabolic processes and in pathogenesis of the target organs' diseases (matrix metal loproteinase gene, endothelial growth factor gene) induced by technogenic factors; genotyping of the predisposition to cancer proliferative status; detection of the immunogenetic markers. The SNP-peculiarities in children living in the conditions of exposure to strontium and nitrates have been identified. They were characterized by the excessive incidence of the variant alleles of cytochrome p450 genes, endothelial growth factor (VEGF) and coproporphyrinogen oxidase (CPOX). The modern biomedical technologies for the typing of the variant gene allow identifying the candidate polymorphisms capable to occur in specific environmental conditions.
Key words: sequencing; gene polymorphism; strontium.
В условиях антропогенно измененной экологической ситуации и хронического воздействия техногенных факторов на человека возникают адаптационные
нарушения, ассоциированные прежде всего с иммунной системой, которые при соответствующей генетической детерминации уже в детском возрасте реали-
© Долгих О. В., Кривцов А В., Старкова К. Г., Бубнова О. А, Отавина Е. А, Ашкина И. Н., Безрученко Н. В., Гусельников М. А, 2016
368
зуются в ранние донозологические нарушения состояния здоровья [Krzystyniak et al., 1995; Fromigue, Hay, Barbara, 2009; Hurtel-Lemaire et al., 2009; Los et al., 2009; Caverzasio, Thouverey, 2011; Yang et al., 2011; Yurchenko, Shlapatska, Sidorenko, 2012; Венгеровский, Хлусов, Нечаев, 2014].
Для решения задач ранней диагностики и повышения эффективности профилактики развития процессов дезадаптации в условиях техногенной экспозиции актуальным является использование наукоемких современных биомедицинских технологий для идентификации генетических и иммунологических нарушений здоровья населения [Dol-gikh et al., 2011; Зайцева, Устинова, Аминова, 2011; Долгих, Кривцов, Харахорина, 2012; Долгих и др., 2014; Зайцева и др., 2014].
Целью настоящих исследований являлась разработка технологий, принципов и методических подходов идентификации генетических маркеров ранних нарушений иммунного статуса населения в условиях хронической экспозиции техногенными факторами.
Материалы и методы исследования
ДНК-детекция включала исследования полиморфных вариантов изучаемых генов с использованием методики ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию и детекцию осуществляли с помощью термоциклера CFX96, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе. Обработку полученных результатов проводили с помощью аллельной дискриминации. Данная методология позволяет различать гомозиготную замену от гетерозиготы и нормальной гомозиготы.
Проведена диагностика SNP на уровне ДНК ре-гуляторных и экзонных областей 37 генов, в том числе, ген цитохрома Р450 (CYP1A1), ген мети-лентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), ген апо-липопротеина Е (АРОЕ), ген копропорфириноген оксидазы (СРОХ), ген васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), ген эндотелиальной синта-зы оксида азота (eNOS), ген матриксной металло-протеиназы 9 (ММР9), цитокиновый рецептор, запускающий апоптоз (FAS), транскрипционный фактор РЗ (FOXP3), ген фактора некроза опухоли альфа (TNFa), главный комплекс гистосовмести-мости (HLA-DRA), ген супрессор опухолевого роста Р53 (ТР53), гены рака груди 1 и 2 (BRCA1, BRCA2) и др.
При выполнении генетического диагностического обследования проведено секвенирование ДНК 6 детей в возрасте от 7 до 9 лет, постоянно проживающих в эндемичной зоне, характеризующейся повышенным содержанием стронция и нитратов в питьевой воде. Метод секвенирования позволил одновременно генотипировать ДНК по
всем изучаемым генам. Библиотека зондов была подготовлена заранее по 27 интересующим нас генам и включала в себе около 2 млн олигонуклео-тидных зондов, комплементарных интересующим нас областям. Исследование включало расшифровку значимых полиморфизмов экзонов и регуля-торных областей.
Проведено изучение полиморфизма гена цитохрома Р450 (CYP1A2), генов интерлейкина (IL17F, IL17D, IL17C, IL17B), толл-подобного гомологичного гена (TLR4), обратной транскриптазы тело-меразы (TERT), FAS, FOXP3, ТР53, главного комплекса гистосовместимости (HLA-DRB1), MTHFR, глутатиона s-трансферазы альфа (GSTA), гена сульфотрансферазы (SULT1A1), глюкокортикоид-ного рецептора (NR3C1), VEGF, цинк - металло-пептидазы (ZMPSTE), гена рецептора эстрогенов (ESR1), гена рецептора дофамина (ANKK1).
Технология выполнения секвенирования включала в себя несколько этапов: выделение ДНК человека из биологического материала (кровь), создание библиотеки ДНК; этапы амплификации библиотеки ДНК и гибридизованной ДНК; проведение эмульсионной ПЦР; постановка секвенирования на приборе GS Junior (Швейцария).
Дизайн исследований включал в себя анализ следующих сочетаний предметов и объектов воздействия техногенных факторов: а) контингент риска, характеризующийся наличием экспозиции стронцием и нитратами, сопоставляемый с контингентом сравнения, проживающим в условиях минимальной экологической нагрузки; б) различные стратификационные уровни выборки - индивидуальный, популяционный, система «родители-дети»; в) биологические уровни анализа - клеточный уровень, молекулярный уровень.
Результаты и их обсуждение
Предложены методические подходы к проведению генетического тестирования вероятности развития иммунопатологии, заключающиеся в идентификации следующих групп полиморфизмов: вариантных генов ферментов 1- и 2-й фазы детокси-кации (CYP1A1, GSTA); генов белков, участвующих в патогенезе техногенных нарушений в органах-мишенях (ММР9, VEGF) и обменных процессах; генотипирование предрасположенности к он-копролиферативным состояниям; определение иммуногенетических маркеров. Максимальное число полиморфно измененных участков генов выявлено в группе генов детоксикации, причем наибольший полиморфизм свойственен SULT1A1 и MTHFR, а наиболее консервативными из этой функциональной системы оказались SOD и СРОХ. Менее полиморфно изменены гены систем иммунной и нервной регуляции. При этом наибольшему полиморфизму из этой системы подвержен HLA-DRB1,
что объяснимо с позиций регуляции иммунного ответа, многие же гены иммунного ответа и онко-генеза достаточно консервативны (табл. 1).
В структуре мутаций максимальной полиморф-ностью обладали гены детоксикации - 37.5% из всей выборки генов, второй ранг занимали гены
обмена 27.5%, замены в генах иммунорегуляции и соматических генах выражены в меньшей степени. Анализ общего количества точечных замен позволил определить среднее количество мутаций на одного человека по 25 кандидатным генам, которое составило 210 замен.
Таблица 1
Пример оформления таблицы и заголовка к ней для того же объекта К2804
1 С±1 1 п 2 п 3 п 4 п 5 п 6 п
MTHFR 13 13 13 14 23 23
CLCN6 0 1 0 0 1 1
ZMPSTE24 4 3 3 4 1 4
СРОХ 1 8 7 8 8 10
TERT 9 5 14 3 6 5
IL 17В 0 2 0 2 1 1
PPARD 4 6 4 5 5 1
VEGFa 2 4 3 2 8 5
IL17F 0 0 0 0 0 1
GSTA4 11 12 9 15 11 15
SOD 4 0 6 2 0 6
HLA-DRB1 45 19 6 0 15 10
NOS3 19 14 12 14 12 14
TLR4 0 1 1 1 2 2
АСТА2 1 1 1 2 0 0
FAS 0 4 8 5 7 9
SIRT3 9 12 8 12 8 1
SULT1A1 41 33 37 10 39 37
Примечание. CLCN6 -ген хлоридный канал 6, АСТА2 - ген актинин альфа2.
Методология секвенирования позволила количественно оценить генетическое закрепление точечных замен в системе «мать-ребенок». В случае постоянной экспозиции мутагеном не наблюдалась элиминация однонуклеотидных замен у потомства, либо выявлялось увеличение количества вариантных участков следующих генов: ген транскрипционного фактора РЗ, ген супрессор опухолевого роста, ген белка главного комплекса гистосовмести-мости, ген эндотелиального фактора роста, ген ин-терлейкина 17С (IL17C), ген сульфтрансферазы, ген теломеразы, ген белка сиртуина (SIRT), ген пролифератора пероксисом (PPARD), ген метилен-тетрагидрофолатредуктазы.
Тогда как условия, соотносимые с референтным уровнем мутагена в среде, характеризовались фиксацией у потомства материнских генетических вариаций только по генам IL17C, белка сиртуина и метилентетрагидрофолатредуктазы, а также цито-кинового рецептора, запускающего апоптоз - FAS. Причем общее число нуклеотидных замен по анализируемым генам у неэкспонированного ребенка было в 2 раза ниже экспонированного мутагеном.
Установлены негативные ассоциации полиморфизма генов детоксикации (CYP1A1, СРОХ) характеризующиеся повышенной в 2 раза над
группой контроля распространенностью гетерозиготного варианта гена СУР 1А1. а также минорного гомозиготного варианта гена СРОХ, при отсутствии патологического аллельного варианта СС в группе контроля (табл. 2).
Таблица 2
Особенности генетического полиморфизма у детей, экспонированных стронцием и нитратами (встречаемость генотипов,%)
Ген Генотип Группа наблюдения Группа сравнения
GG 49 62
VEGF GC 42 32
GG 9 6
GG 87 94
CYP1A1 GA 13 6
АА 0 0
АА 74 69
СРОХ CA 23 31
СС 3 0
Для полиморфизма генов пролиферации эндотелия характерно преобладание как минорной гомозиготы (в 1.5 раза), так и гетерозиготного генотипа (в 1.3 раза) по сравнению с теми же показателями в группе контроля. Выявленные изменения
иммунных показателей у обследованных детей развиваются на фоне негативной генетической вариабельности, связанной с приоритетными генами иммунной регуляции и детоксикации.
Заключение
Использование современных биомедицинских технологий для типирования вариантных генов позволяет установить кандидатные полиморфизмы, реализующиеся в конкретных экологических условиях.
Библиографический список
Венгеровский А.И., Хлусов И.А., Нечаев К.А. Молекулярные механизмы действия бисфосфона-тов и стронция ранелата // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т. 77 (9). С. 43-46.
Долгих О.В. и др. Иммунная система и ее генетические ассоциации у детей при комбинированном внешнесредовом воздействии // Вестник КазНМУ. 2014. № 3(1). С. 60-63. Долгих О.В. и др. Особенности иммунной и генетической дезадаптации у детей в условиях избыточной гаптенной нагрузки // Российский иммунологический журнал. 2014. № 8(17). С. 299-302.
Долгих О.В., Кривцов А.В., Харахорина Р.А. Иммунные и ДНК-маркеры воздействия техногенной нагрузки // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2012. № 4. С. 240-241.
Зайцева Н.В. и др. Особенности иммунной регуляции у детей в условиях комбинированного внешнесредового воздействия металлов и органических соединений // Академический журнал Западной Сибири. 2014. Т. 10, № 2. С. 107-108. Зайцева Н.В., Устинова О.Ю., Аминова А.И. Гигиенические аспекты нарушения здоровья детей при воздействии химических факторов среды обитания. Пермь: Кн. формат, 2011. 489 с. Caverzasio J., Thouverey С. Activation of FGF receptors is a new mechanism by which strontium rane-late induces osteoblastic cell growth // Cell. Physiol. Biochem. 2011. Vol. 27, № 3-4. P. 243-250.
Dolgikh O. et al. Molecular markers of apoptosis in industrial workers // In vivo: international Journal of Experimental and Clinical Pathophysiology and Drub Research. 2011. Vol. 25, № 3. P. 523-524 Fromigue O., Hay E., Barbara A. Calcium sensing receptor-dependent and receptor-independent activation of osteoblast replication and survival by strontium ranelate // JCMM. 2009. Vol. 13 (8B). P. 2189-2199. Hurtel-Lemaire A.S. et al. The calcium-sensing recep-
tor is involved in strontium ranelate-induced osteoclast apoptosis. New insights into the associated signaling pathways // JBC. 2009. Vol. 284. P. 575-584.
Krzystyniak K et. al. Approaches to the evaluation of chemical-induced immunotoxicity // Environ Health Perspect. 1995. Vol. 103, suppl 9. P. 17.
Los M. et al. Switching Akt: From survival signaling to deadly response // BioEssays. 2009. Vol. 31 (5). P. 492-495.
Yang F. et al. Strontium enhances osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and in vivo bone formation by activating Wnt/catenin signaling// Stem cells. 2011. doi: 10.1002/stem.646.
Yurchenko M., Shlapatska L.M., Sidorenko S.P. The multilevel regulation of CD95 signaling outcome //Exp. oncol. 2012. Vol. 34 (3). P. 200-2011.
References
Vengerovskiy A.I., Khlusov I.A., Nechaev K.A. [Molecular action mechanisms of bisphosphonates and strontium ranelate]. Eksperimentalnaja i kliniceskaja farmakologija. No. 77 (9) (2014): pp. 43-46. (In Russ.).
Dolgikh O.V., Zaitseva N.V., Krivtsov A.V., Gorshkova K.G., Lanin D.V., Bubnova O.A. [The immune system and its genetic associations in children under combined environmental influence]. Vestnik KazNMU. No. 3(1) (2014): pp. 60-63. (In Russ.).
Dolgikh O.V., Zaitseva N.V., Luzhetskiy K.P., Andreeva E.E. [Peculiarities of immune and genetic disadapta-tion in children under excess haptenic load]. Rossiy-skij immunologiceskij zurnal. No. 8(17) (2014): pp. 299-302. (In Russ.).
Dolgikh O.V., Krivtsov A.V., Kharakhorina RA. [Immune and DNA-markers of the influence of man-caused load]. Vestnik Ura'lskoj meditcinskoj akade-miceskoj nauki. No. 4 (2012): pp. 240-241. (In Russ.).
Zaitseva N.V., Dolgikh O.V., Gorshkova K.G., Predeina RA., Lanin D.V. [Peculiarities of the immune regulation in children under combined environmental influence of metals and organic compounds]. Akademi-ceskij zurnal Zapadnoj Sibiri. V. 10 No. 2 (2014): pp. 107-108. (In Russ.).
Zaitseva N.V., Ustinova O.Yu., Aminova A.I. Gigien-iceskie aspekty narusenija zdorovija detej pri vozde-istvii chimiceskich faktorov sredy obitanija [Hygienic aspects of children's health disorders under the influence of environmental chemical factors]. Perm, Kniznyj format Publ., 2011. 489 p. (In Russ.).
Caverzasio J., Thouverey C. Activation of FGF receptors is a new mechanism by which strontium ranelate induces osteoblastic cell growth. Cellular Physiology and Biochemistry. No. 27 (3-4) (2011): pp. 243-250.
Dolgikh O., Zaitseva N, Dianova D., Krivtsov A. Molecular markers of apoptosis in industrial workers. In
vivo: international Journal of Experimental and Clinical Pathophysiology and Drug Research. V. 25 No. 3 (2011): pp. 523-524. Fromigue O., Hay E., Barbara A. Calcium sensing receptor-dependent and receptor-independent activation of osteoblast replication and survival by strontium rane-late. Journal of Cellular and Molecular Medicine. No. 13 (8B) (2009): pp. 2189-2199. Hurtel-Lemaire A.S., Mentaverri R., Caudrillier A., Cournarie F., Wattel A., Kamel S., Terwilliger E.F., Brown E.M., Brazier M. The calcium-sensing receptor is involved in strontium ranelate-induced osteoclast apoptosis. New insights into the associated signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. No. 284 (2009): pp. 575-584. Krzystyniak K. et. al. Approaches to the evaluation of
Об авторах
Долгих Олег Владимирович, доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН» 614045, Пермь, ул. Монастырская, 82; [email protected]; (342)2363930
профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Кривцов Александр Владимирович, кандидат
медицинских наук, заведующий лабораторией
иммуногенетики
ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН»
614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82;
[email protected]; (342)2363930
Старкова Ксения Геннадьевна, кандидат
биологических наук, заведующий лабораторией
иммунологии и аллергологии
ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН»
614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82;
[email protected]; (342)2363930
Бубнова Ольга Алексеевна, младший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики, аспирант
ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН»
614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82
Отавина Елена Алексеевна, младший научный
сотрудник лаборатории иммунологии и
аллергологии, аспирант
ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН»
614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82
chemical-induced immunotoxicity. Environ Health Perspect. No. 103, suppl. 9 (1995): p. 17. Los M., Maddika S., Erb В., SchulzeOsthoff К. Switching Akt: From survival signaling to deadly response. BioEssays. No. 31 (5) (2009): pp. 492-495. Yang F., Yang D., Tu J., Zheng Q., Cai L., Wang L. Strontium enhances osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and in vivo bone formation by activating Wnt/catenin signaling. Stem cells. (2011): doi: 10.1002/stem.646. Yurchenko M., Shlapatska L.M., Sidorenko S.P. The multilevel regulation of CD95 signaling outcome. Experimental oncology. No. 34 (3) (2012): pp. 200-2011.
Поступила в редакцию 10.10.2016
About the authors
Dolgikh Oleg Vladimirovich, Doctor of Medicine, head of the Department of Immunobiological Diagnostic Methods
FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045; [email protected]; (342)2363930
Professor of the department of Human Ecology and Life Safety
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Krivtsov Aleksandr Vladimirovich, Candidate of Medicine, Head of the department of immunogenetics
FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045; [email protected]; (342)2363930
Starkova Kseniya Genadievna, Candidate of Biology, Head of the department of immunology and allergology
FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045; [email protected]; (342)2363930
Bubnova Olga Alekseevna, junior researcher laboratory of immunogenetics, postgraduate FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045
Otavina Elena Alekseevna, junior researcher laboratory of immunology and allergology, postgraduate
FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045
Аликина Инга Николаевна, лаборант-исследователь лаборатории иммуногенетики ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН» 614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82
магистрант биологического факультета ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Безрученко Надежда Владимировна, лаборант-
исследователь лаборатории иммунологии и
аллергологии
ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН»
614045, г. Пермь, ул. Монастырская, 82
магистрант биологического факультета ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Гусельников Максим Анатольевич, магистрант биологического факультета ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Alikina Inga Nikolaevna, laboratory researcher of the department of immunogenetics FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045
graduated student of biological faculty Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Bezruchenko Nadejda Vladimirovna, laboratory researcher of the department of immunology and allergology
FBSI "Federal Scientific Center for Medical and Preventive health Risk Management Technologies". 82, Monastyrskaya str., Perm, Russia, 614045
graduated student of biological faculty Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Guselnikov Maksim Anatolievich, graduated student of biological faculty Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
