CC BY
49
УДК 543.544.4:547.455.637
ОБОСНОВАНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ФУКОЗОСОДЕРЖАЩЕГО КОНЦЕНТРАНТА В КАЧЕСТВЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДОБАВКИ
© Нифталиев С.И., Дурицын Е.П., Кораблин Р.В., Ковырялова Е.А.
Кафедра неорганической химии и химической технологии Воронежского государственного университета инженерных технологий, Воронеж;
кафедра фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко, Воронеж
E-mail: [email protected]
Изучена возможность направленного синтеза фукозосодержащей углеводной композиции из вторичного лактозосодержащего сырья. Предложена биохимическая технология трансформации галактозы в фукозу с использованием физиологически безопасных реактивов. Проведён токсикологический анализ композита, подтверждающий безопасность фукозосодержащей добавки. Исследовано влияние фукозы на бифидостимулирующую активность. Обоснована перспективность применения фукозосодержащих углеводных концентратов в качестве добавки к продуктам функционального назначения.
Ключевые слова: лактозосодержащее сырье, фукоза, токсикологический анализ, бифидогенная активность.
SUBSTANTIATIONS OF SAFE APPLICATION OF FUCOSE-CONTAINING CONCENTRATE AS A FUNCTIONAL DIETARY SUPPLEMENT Niftaliev S.I., Duritsyn E.P., Korablin R. V., Kovyryalova E.A.
Department of Non-organic Chemistry & Chemical Technology of the Voronezh State University of Engineering Technologies , Voronezh;
Department of Pharmaceutical Chemistry & Pharmaceutical Technology of the N.N. Burdenko Voronezh State Medical Academy, Voronezh The possibility of the direct synthesis of fucose-containing composition from the secondary raw materials has been investigated. The biochemical technology of transforming fucose from galactose with the use of safe reagents has been suggested. The toxicological analysis of fucose-contaning composition has been performed. The bifidogenic activity of fucose has been established. The opportunity of using fucose-contaning carbon concentrates as a functional dietary supplement has been substantiated.
Keywords: lactose-contaning raw materials, fucose, toxicological analysis, bifidogenic activity.
В связи с растущим объемом производства вторичного лактозосодержащего сырья актуальной проблемой является полное и рациональное использование всех ресурсов на принципах безотходной технологии, поиск наиболее экономически целесообразных пищевых и сырьевых источников при разработке рациональных схем для синтеза минорных углеводов с функциональными свойствами. К одному из перспективных научных направлений химической технологии относится трансформация лактозы вторичного молочного сырья в её дериваты. Особое внимание уделяется минорному углеводу фукозе, обладающему пре-биотическим и иммунотропным действием. Большой интерес представляют химические и биохимические методы получения фукозы для применения их в качестве биологически активных добавок в диабетическом, энтеральном и функциональном питании. В настоящее время иностранные компании-производители сахаров применяют дорогостоящие сырьевые источники для получения фукозы. В России не существует подобных аналогов для получения минорных угле-176
водов. Нами предлагается внедрение инновационной биохимической технологии синтеза фуко-зосодержащих композитов, обладающих бифидо-стимулирующей активностью и безопасностью для организма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В организме человека фукоза проявляет множество физиологически значимых функций. Она может входить в состав гликопротеинов (коллаген и эластин), иммуноглобулинов, многих ферментов и гормонов. Определяющее значение в специфическом узнавании и последующей адгезии сперматозоида и яйцеклетки человека играют остатки L-фукозы на поверхности прозрачной оболочки ооцита [1]. Фукоза принимает непосредственное участие при сборке функционально важных молекул, например, иммуноглобулина на поверхности аппарата Гольджи (углевод доставляется к цепи иммуноглобулина, тем самым вызывая его секрецию и прохождение через мем-
брану клетки), играет роль терминального сахара [2].
Пребиотический эффект фукозы обеспечивается избирательной стимуляцией роста, увеличением метаболической активности и стабильностью одной или нескольких групп бактерий толстого кишечника, в том числе бифидобактерий. Деятельность кишечной микрофлоры обеспечивает превращение фукозы в активированную форму по следующей схеме:
Глюкозо-6-фосфат > Фруктозо-6-фосфат > Маннозо-6-фосфат > Манноза-1фосфат > Гуано-зиндифосфатманноза > Гуанозиндифосфатфукоза (ГДФ-Фук).
Такая активированная форма гуанозиндифос-фатфукоза (ГДФ-Фук) осуществляет завершение стадии построения цепи иммунных биополимеров ИФР-у (интерферонов), тем самым принимает непосредственное участие в формировании иммунной толерантности и подавлении аллергических реакций [3].
Недостаток фукозы может корректироваться пищевыми добавками. Так как в свободном виде она практически не встречается, поэтому остро встаёт актуальность проблемы поиска способов синтеза углеводных композиций, содержащих фукозу из природных комплексных соединений.
Химическая трансформация макрокомпонентов в функциональные производные всегда была актуальной задачей. Существуют разнообразные методы химического синтеза фукозы. Поиск целесообразных и экономически-выгодных методов показал, что оптимальный вариант для постадий-ного синтеза фукозы - это трансформация галактозы различных сырьевых источников. Первый способ предусматривает трёхстадийный процесс трансформации галактозы в первичный спирт фу-цитол, с последующим окислением первичной спиртовой группы до альдегидной диоксидом марганца. При этом получается фуко-альдолактон. Восстанавливают альдолактон в альдозу действием амальгамы натрия, что приводит к получению фукозы [ 4]. Вторая методика предусматривает использование на одной из стадий синтеза никелевого катализатора, что в итоге усложняет условия проведения синтеза [5].
Цель нашей работы - изучение биохимической трансформации D-галактозы в L- и D-формы фукозы, выделение фукозосодержащих композиций с применением физиологически безопасных технологий.
Санитарно-гигиеническая и токсикологическая экспертиза разрабатываемого углеводного концентрата даёт возможность оценить степень физиологической безопасности фукозосодержа-щего углеводного концентрата. Проведение мик-
робиологического анализа позволяет определить бифидогенный эффект фукозы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследований по получению функциональных углеводов из вторичного молочного сырья предложен инновационный химикотехнологический метод, включающий ультрафильтрацию, обратный осмос и биохимическую трансформацию лактозы в минорный углевод фу-козу с применением реактивов, безопасных в нут-рицевтическом отношении.
Одним из первых этапов является подготовка вторичного лактозосодержащего сырья. Необходимым условием является получение ультрафильтрата с последующим обратноосмотическим концентрированием. Содержание сухих веществ в углеводном концентрате достигает 22%, основным компонентом которых является лактоза -16,8%. Ферментативный гидролиз лактозы осуществляли под действием Р-галактозидазы Lac-tozym 6500 L HP-G при рН 6,2, что соответствует рекомендуемому интервалу (6-7 ед.рН) в инструкции по применению ферментного препарата, дозировка составляет 2400-2700 LAU/дмЗ (LAU-Lactase Activity Units). Степень гидролиза лактозы определяли c применением криоскопического метода, заключающегося в определении концентрации истинно растворимых веществ в растворе по его температуре замерзания. Для анализа использовали криоскоп Testo 735-2. Полученную в результате гидролиза лактозы галактозу модифицировали в фукозу.
Для синтеза фукозы D-галактозу, полученную в результате ферментативного гидролиза лактозы, подвергали взаимодействию с тозилгидразидом в этиловом спирте, с образованием комплекса то-зилгидразон^-галактоза, который восстанавливали в присутствии натрий боргидрида до первичного спирта фуцитола. Выпавший осадок то-зилгидразида отфильтровывали. Фуцитол подвергали ферментативному превращению флавинаде-ниндинуклеотидом (ФАД) с получением фукозы. Схема получения фукозы приведена на рис.
По результатам количественного анализа углеводного комплекса установлено, что выход фу-козы составляет 80% от количества D-галактозы.
Свежеприготовленный лабораторный образец фукозосодержащего концентрата в количестве 200 мл подвергали токсикологическому анализу на белых крысах по методикам исследований МУ-2163-80, МУ-4230-86. Данные приведены в табл. 1.
сно
I
н-с-он
і
но-с -н
!
но—С —н
1
н-с-он
(
С “ОН Н,
ЭО^—N-N4;
-НіО
НС=Ы-|)-«Ц~}-СН,
Н-С-ОН
НО-С-Н
1
НО-С-Н )
Н-С-ОН
і
с -он №
галактоза
тозилгидразид
и?="-н-5Ч~Усн’
п пи V—г
н-с-он
I
но-с-н
НО-С-Н
I
н-с-он
С-он
а
НгО
този.тгилразил-О- галактозы
н-
’С-он
I
но-с-н
НО-С-Н
Н-І-0Н
с-он н.
Н.М
+ НаВО>
тозилгидразнд-О- галактозы натрий боргидрид фуцнтол тозилгидразид
метаоорат
катрк.ч
СМ I 3 Н-С-ОН I
НО-С-Н
)
НО-С—Н
Н-С-ОН
I
с-он н,
ФАД
2Н
сно
I
но-с-н
н-с-он
[
н-с-он
I
но-с-н
сн.
фуцитол
фукс за
Рис. Схема получения фукозы.
Токсикологические исследования фукозосодержащей композиции
Таблица 1
№ п/п Определяемые показатели Результаты исследований Величина допустимого уровня Единицы измерения
1 Среднесмертельная доза при вве-
1 дении в желудок, ЛД-50 (белые крысы) Более 10000 Более 5000 мг/кг
По результатам экспертизы можно сделать вывод, что представленный образец по проверенным показателям безопасности согласно ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» может быть отнесён к IV (четвертому) классу опасности. Фуко-зосодержащий углеводный комплекс, полученный по разработанной методике, относится к малоопасным композициям и обладает низкой степенью вредного воздействия на организм.
Микробиологический анализ, подтверждающий бифидогенную активность фукозосодержа-щего углеводного комплекса, проводили методом предельных разведений и посевов в стандартную кукурузно-гидролизатную среду ГМК-1 по методике ГОСТ 10-444-11. Объектом исследования были культуры бифидобактерий - В.Ы1Мит. Они были восстановлены 40 мл микробиологически чистой воды на 1 упаковку бифидумбактерина (1 упаковка -5 х 108) и инкубированы в термоста-
Таблица 2
Бифидогенная активность фукозосодержащего концентрата
Содержание фукозосодержаще-го концентрата в образце № разведения/ Количество пробирок Количество колоний в 1 см3
5% 8/2 110,0 х1010
9/2
10/2
10% 9/2 70,0 х 1011
10/2
11/1
15% 9/2 110,0 х 1011
10/2
11/2
те в течение 24 часов при температуре 37°С.
Для культивирования использовалось для каждого образца восстановленное пастеризованное обезжиренное 1% молоко, 0,1 мл бифидобактерий и фукозосодержащий концентрат в количестве 5%, 10% и 15%. Производили два параллельных опыта посева образцов 15 разведений. Инкубирование в термостате при 37оС осуществлялось в течение 4 часов.
При сравнении активности роста бифидобактерий установлено, что микроорганизмы растут в фукозосодержащем комплексе быстрее, чем в исходном образце, который служил контролем.
Приведённые данные показывают, что оптимальное внесение в образец 15 мас. % фукозосо-держащего концентрата обеспечит высокую би-фидогенную активность (табл. 2).
Бифидогенный эффект, обусловленный введением в образцы разработанного фукозосодер-жащего композита, открывает перспективы для разработки новых видов питательных сред и продуктов функционального назначения.
В ходе исследования были проанализированы данные по физиологической роли фукозы, рассмотрены варианты и методики синтеза фукозо-содержащих композиций. Разработана технологическая схема биохимической трансформации галактозы в минорный углевод фукозу с использованием физиологически безопасных реактивов.
Проведена санитарно-гигиеническая и токсикологическая экспертиза полученного фукозосо-держащего углеводного комплекса, подтверждена физиологическая безопасность разработанной методики. Установлено, что фукозосодержащая углеводная композиция обладает высокой бифи-догенной активностью и может быть рекомендована в качестве пребиотической добавки к продуктам функционального назначения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lutjen P., Witt M., Hoy J. A role for fucose in human spermatozoa zona pellucid recognition // Clin. Reprod. Fertil. - 1986. - Vol. 4, N2. - P. 185-186.
2. Kunizhev S.M., Denisova E. V. Diffusion and effect of minor monosacharides (rewiev) // Chem.Sience. -2004. - P. 92-100.
3. Vanhooren P.T. L-fucose: occurrence, physiological role, chemical, enzymatic and microbial synthesis // I. Chem. Technol. Biotechnol. - 1999. - N574. - P. 479497
4. Bush A., Martin-Pastor M. Structure and conformation of complex carbohydrates of glicoproteins, gly-colipids, and bacterial polisaccharides C // An. Rev. Biophys. Biomol.Struct. - 1999. - Vol. 28. - P. 269293.
5. Method for producing L-fuculose and method for pro-dusing L-fucose: pat. 7,575,910 B2 Ш:[текст] / Shu-nichi Suzuki, Kawasaki (JP); Kunnihiko Watanabe, Kawasaki (JP). - Appl. No.: 11/532,618; Filed: sept.18, 2006.
ПРАВИЛА ДЛЯ АВТОРОВ
1. В журнале "Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье" печатаются ранее не опубликованные работы в области экспериментальной биологии и медицины, клинической медицины, общественного здоровья и фармации. Публикации могут быть представлены в виде оригинальных исследований, научнометодологических статей, обзоров литературы, дискуссионных статей, лекций, кратких сообщений, отчётов о конгрессах, съездах, симпозиумах и конференциях. Направляемые оригинальные работы должны давать полное представление о методах исследования, собранном материале и его статистической обработке. Не принимаются к печати статьи, выполненные с нарушением Правил и норм гуманного обращения с объектами исследования.
2. Статья должна сопровождаться официальным направлением от учреждения, в котором выполнена работа, и иметь визу руководителя на первом экземпляре. К статье прилагаются сведения об авторах: фамилия, имя, отчество полностью, ученая степень и должность.
3. Статья представляется в формате Microsoft Word с использованием шрифта Times News Roman. Размер шрифта - 14, межстрочный интервал - полуторный (не более 30 строк на странице), поля - 2 см, отступ в абзаце - 1,25 см. Разбивка на страницы, использование пронумерованных списков и альбомного расположения страниц не допускается. Использование макросов, стилей и надписей в колонтитулах страницы не допускается. Работы, выполненные с нарушением указанных требований, редакцией не рассматриваются.
4. В начале статьи указывается УДК. Заглавие должно точно отражать содержание статьи. Под заглавием помещаются инициалы и фамилии авторов, затем указывается полное название учреждения и его подразделения, в котором выполнена работа. Статья должна содержать следующие разделы: введение с четкой формулировкой цели исследования, материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение с заключением или выводами, список литературы. На отдельных страницах представляются рефераты на русском и английском языках (от 500 до 1000 знаков), таблицы, рисунки и подписи к рисункам. В реферате указываются название статьи, авторы, основные методы и результаты исследования, ключевые слова (до 7).
5. Объём статей с результатами оригинальных исследований не должен превышать (включая таблицы, список литературы, подписи к рисункам и резюме) 15 страниц, обзоров, лекций и проблемных статей - до 20 страниц, кратких сообщений - до 5 страниц, отчетов и рецензий - до 4 страниц. Рукописи большего размера, представленные без согласования с редакцией, возвращаются авторам.
6. Число рисунков к статьям не должно превышать 5, к кратким сообщениям - 2. Данные рисунков не должны повторять материалы таблиц. К каждому графику прилагаются цифры для его построения. Микрофотографии предоставляются чёрно-белыми в форматах jpg или tiff. На обороте только второго экземпляра рисунков карандашом указываются номер рисунка, фамилия автора и название статьи, словом обозначается верх рисунка. Подписи к рисункам печатаются после текста статьи. В них должны быть сделаны общая подпись и объяснения всех кривых, букв, цифр и прочих сокращений. В подписях к микрофотографиям необходимо указывать увеличение и метод окраски или импрегнации. Использование автофигур для формирования элементов изображения запрещено.
7. Таблицы должны содержать обобщенные и статистически обработанные материалы исследования, иметь номер и заголовок. В таблицах все графы должны иметь заголовки, цифры и единицы измерения соответствовать тексту, сокращения слов не допускаются. Повторять одни и те же данные в тексте, на рисунках и в таблицах не следует.
8. В статье сокращение слов допускается только с первоначальным указанием полного названия или в соответствии с перечнем, принятым Комитетом стандартов. Единицы измерения даются в соответствии с Международной системой единиц СИ. Фамилии иностранных авторов приводятся в оригинальной транскрипции. Химические и математические формулы должны быть тщательно выверены. Греческие буквы подчеркиваются красным цветом, латинские - синим.
9. Список литературы приводится в виде полного библиографического описания работ в алфавитном порядке (сначала русского, а затем латинского алфавита). Число ссылок не должно превышать 30, для обзорных статей - 100, для кратких сообщений - 10. В тексте в квадратных скобках дается ссылка на порядковый номер работы в списке литературы. Не допускаются ссылки на
материалы конференций, диссертации, авторефераты диссертаций, неопубликованные работы.
10. В редакцию направляются 2 распечатанных экземпляра рукописи и электронный вариант (на дисках CD-R, CD-RW, DVD-R, DVD-RW). Электронный и печатный варианты должны быть полностью идентичны по содержанию и оформлению. Рефераты на русском и английском языках, рисунки и подписи к рисункам должны быть расположены в отдельных файлах.
11. В первом экземпляре статья должна быть подписана всеми авторами. В конце статьи указываются полностью фамилия, имя, отчество, служебный и домашний адрес, телефон, факс, E-mail автора, осуществляющего связь с редакцией. Ставя подпись под статьей, автор тем самым передает права на издание и переводы своей статьи редакции, гарантирует оригинальность статьи и соблюдение международных и российских правовых норм при экспериментальных, доклинических и клинических исследованиях. Поступление статьи в редакцию подтверждает полное согласие автора с правилами журнала.
12. Статьи, не соответствующие указанным правилам, редакцией не рассматриваются. Если в статье в процессе подготовки к печати обнаруживаются смысловые или технические дефекты, она может быть возвращена автору для исправления. В случае возврата статьи на переработку ее предварительное рецензирование не означает, что статья принята к печати. После получения нового текста вместе с первоначальным экземпляром и ответом на все замечания рецензента работа вновь рассматривается редколлегией. Датой поступления статьи считается день получения редакцией окончательного текста. Все публикации в журнале являются бесплатными.
Адрес редакции: 305041, Курск, ул. К. Маркса, 3, редакция журнала "Курский научнопрактический вестник "Человек и его здоровье". Тел. (4712)58-81-29. Факс (4712)56-73-99. E-mail: kursk-vestnik@mail. ru Для сотрудников КГМУ: кафедра патофизиологии, к. 336, профессору И.И. Бобынцеву, к.м.н. М.Е. Долгинцеву. Тел. 58-81-48.
