Обнаружение вируса гепатита Е среди кроликов на территории Российской Федерации (Москва) Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Обнаружение вируса гепатита Е среди кроликов на территории

Российской Федерации (Москва)

О.В. Исаева1, А.М.Е. Мухаммед1, В.Г. Козлов2, Е.Ю. Малинникова1, К.К. Кюрегян1, М.И. Михайлов1

'ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, Москва 2ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН», Москва

Краткий обзор Цель. Определить существование инфекции, вызываемой вирусом гепатита Е (ВГЕ), у кроликов на территории Российской Федерации (РФ).

Результаты. При исследовании 29 образцов фекальных экстрактов кроликов в возрасте до 6-ти месяцев, содержащихся в виварии, РНК ВГЕ была выявлена в 13,8%. При проведении филогенетического анализа установлена циркуляция двух штаммов вируса среди обследованной группы животных.

Заключение. Исследования подтверждают существование на территории РФ (г. Москва) варианта вируса ГЕ, являющегося специфичными для данного вида животных (кроликов), отличного от вариантов вируса, характерных для людей и свиней. Ключевые слова: вирус гепатита Е, РНК вируса гепатита Е, кролики

Abstract Detection of hepatitis E virus in rabbits in Russian Federation (Moscow)

O.V. Isaeva1, A.M.E. Mohammed1, E.Yu. Malinnikova1, K.K. Kyuregyan1, M.I. Mikhailov1 FSBI "Chumakov Instiute of poliomyelitis and viral encephalitides" RAMS, Moscow FSUI "Enterprise on manufacture of bacterial and viral preparations of Chumakov Instiute of poliomyelitis and viral encephalitides RAMS", Moscow

Aim: To assess the prevalence of hepatitis E in a population of rabbits under 6 months old held in a vivarium and perform phylogenetic analysis of virus isolates.

Results: Among 29 samples of rabbit feces HEV RNA was found in 13,8%. Phylogenetic analysis showed circulation of two strains of the virus in this group of animals. Conclusions: Our studies prove the presence of a variant of hepatitis E virus in Russia (Moscow), which is specific for this species (rabbits) and different from virus variants found in humans and pigs. Phylogenetic analysis of the sequences of ORF2 region of HEV genome suggests its classification as a new genotype of the virus. Key words: hepatitis E virus; RNA HEV; rabbits

Вирус гепатита Е (ВГЕ) принадлежит к роду Нере\пгш, семейства Hepeviridae [1]. ВГЕ является этиологическим агентом острого гепатита. В развитых странах, находящихся в умеренном климатическом поясе, последние годы наблюдается спорадическая заболеваемость ГЕ, связанная не только с посещением гиперэндемичных территорий, но и с автохтонными случаями инфекции, вызванной 3 и 4 генотипами ВГЕ [2]. В настоящее время ГЕ в странах умеренного климата относят зоонозной инфекцией, источником которой являются преимущественно свиньи [3,4].

Открытия последних лет показали разнообразие циркулирующих вариантов вируса ГЕ. Были определены последовательности изоля-тов ВГЕ, выделенных от различных видов животных, таких как олени, мангусты, кролики и

крысы [5-8]. Анализ данных позволил авторам сделать предположение о существовании нового вида вируса ГЕ крыс [5], выделить вариант ВГЕ от дикого кабана в отдельный генотип [9]. С. гЬаос с соавторами описали выделенный в Китае от домашнего кролика вариант ВГЕ, также предполагая его принадлежность к новому генотипу вируса [8]. При изучении распространенности ВГЕ в популяции кроликов, содержащихся на фермах различных регионов мира (США, Китай, Франция) было показано, что кролики могут являться резервуаром вируса и вызывать инфекцию у человека. Анализ нук-леотидной последовательности полного генома вируса показал сходство с генотипами 1-4 ВГЕ на 72,2-78,2%. Авторами показано, что ВГЕ кролика эффективно размножается в человеческих клеточных линиях [10].

Таким образом, зоонозный путь передачи ВГЕ поднимает важную проблему общественного здравоохранения по безопасности пищевых продуктов и зоонозных рисков [4].

Ранее нами описаны филогенетические взаимоотношения вариантов вируса ГЕ, выделенных от свиней (как основного источника зо-онозной ВГЕ-инфекции) и людей, проживающих на различных территориях Российской Федерации (РФ), инфицированных ВГЕ [11]. Исследований, касающихся выявления ВГЕ среди кроликов, как источника возможного инфицирования людей, в РФ не проводилось.

Цель исследования: определить существование ВГЕ-инфекции среди популяции кроликов в возрасте до шести месяцев, содержащихся в виварии и провести филогенетический анализ выделенных изолятов.

Материалы и методы

Определяли наличие РНК ВГЕ в образцах фекалий, собранных от 29 кроликов в возрасте до 6-ти месяцев. Образцы были получены от каждого животного индивидуально. Кролики содержались в виварии ФГБУ «ИПВЭ им. М.П. Чумакова» РАМН (Москва).

Для выделения нуклеиновых кислот из образцов фекалий готовили 10-20% осветленный

Полученные продукты ПЦР, соответствующие ВГЕ, определяли в 1,5% агарозном геле в трисборатном буфере (TBE). Величина продукта амплификации для ВГЕ составляла 350 п.о. Для определения нуклеотидной последовательности анализируемых фрагментов вирусных геномов проводили прямое секвенирование ам-пликонов. Продукты ПЦР, размер которых соответствовал величине фрагмента-мишени, вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора OIAquick Gel Extraction kit (OI AGEN).

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента проводили на автоматическом секвенаторе СЕ08800 (Beckman Coulter). Секвенирование осуществляли с использовани-

фекальный экстракт. Для этого образцы проб фекалий объемом до 1,0 мл (по 0,4-1,0 г) отбирали стерильным шпателем и помещали в стерильный флакон. К образцу фекалий добавляли 4,0 мл физиологического раствора до образования 10-20% суспензии. Взвесь фекалий интенсивно встряхивали на вортексе до образования суспензии. Полученную суспензию осветляли путем центрифугирования в течение 20 минут при 3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отбирали в одноразовую пробирку.

Нуклеиновые кислоты выделяли из 50 мкл надосадочной жидкости (осветленных фекальных экстрактов) с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот (НПО «Литех») по протоколу производителя. Выявление РНК ВГЕ проводили во вложенной полимеразной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦ) с вырожденными праймерами к участку открытой рамки считывания 2 (ОРС 2) ВГЕ (табл. 1).

Первый раунд ПЦР проводили совмещено с ОТ, условия реакции были следующими: 42 °С — 1 час, затем 5 мин. — 94 °С (денатурация и инактивация фермента обратной транскрипта-зы), затем 35 циклов: 94 °С - 30 сек, 45 °С - 30 сек., 72 °С — 45 сек., финальная элонгация — 72 °С — 7 мин. Условия для второго раунда ПЦР были такими же.

ем набора GenomeLab™Methods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing ("Beckman Coulter", США), основанного на использовании флюоресцентных меток, связанных с ddNTP (Dye Terminators) согласно протоколу производителя. Секвенирование каждого ПЦР-фраг-мента проводили в двух направлениях — с прямым и обратным праймером. Полученные хроматограммы были собраны в готовые последовательности при помощи модуля Seqman 4.03 (пакет программ LASERGENE, DNASTAR, США).

Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов вирусных геномов выравнивали друг с другом и с соответствующими им участками полных и частичных геномных по-

Таблица 1. Олигонуклеотиды, применявшиеся для амплификации РНК ВГЕ

Последовательность Положение Направление Позиция в геноме ВГЕ*

5'-аау tat gem cag tac egg gttg -3' Внешний Прямой 5687-5708

5'-ccc tta tcc tgc tga gca ttctc -3' Внешний Обратный 6395-6414

5'- gty atg yty tgc ata cat gget -3' Внутренний Прямой 5972-5993

5'-age cga cga aat yaa ttc tgt с -3' Внутренний Обратный 6298-6319

* — нумерация нуклеотидных позиций приведена по штамму ВГЕ Burma (номер в базе данных GenBank М73218)

следовательностей анализируемых вирусов, доступными в GenBank на момент проведения исследования, с помощью программы MEGA версии 5.05.

Для выделенных от кроликов изолятов ВГЕ определяли нуклеотидную последовательность амплифицированного участка ОРС2 вирусного генома величиной 300 нуклеотидов.

Результаты и обсуждение

При исследовании 29 образцов фекальных экстрактов кроликов на наличие РНК ВГЕ были получены результаты, представленные в табли-

Для филогенетического анализа выявленных фрагментов генома ВГЕ в базе данных GenBank нами были отобраны референсные последовательности изолятов вируса ГЕ кроликов, полученных в Китае и Франции [10], а также большое число последовательностей ВГЕ от человека и свиней различных генотипов и субтипов, циркулирующих в разных регионах мира.

В анализ филогенетических взаимоотношений также включены выделенные на территории РФ и описанные нами ранее изоляты ВГЕ от людей, заболевших ГЕ (вспышка и спорадические случаи) и изоляты ВГЕ от свиней [11].

Результаты филогенетического анализа показали, что изоляты вируса ВГЕ кроликов (обозначены на рисунке 1 как Rabbit 13, 78, 79, 84) образуют единый кластер с изолятами, выделенными от кроликов в Китае. Эти изоляты имеют между собой степень сходства нуклео-тидной последовательности 86%. Данный кластер является самостоятельным, близким, но не относящимся к генотипу 3 ВГЕ, не группируется с изолятами, полученными от людей и свиней из регионов РФ (Белгородской, Владимир-

це 2. РНК ВГЕ была выявлена в 4-х образцах фекальных экстрактов. Такие данные свидетельствуют о достаточно широком распространении вируса в группе случайной выборки (13,8%) и сопоставимы с результатами, представленными Б. ЬЬотте с соавт. [10].

По данным авторов, процент выявления РНК ВГЕ в образцах сыворотки крови кроликов менялся от 7% до 16,5% среди популяции животных различных обследуемых групп США, Китая и Франции. Необходимо отметить, что процент выявления РНК из образца желчи составил 7%, а ткани печени кроликов — 23%.

ской, Архангельской, Калининградской, Саратовской, Свердловской областей, Хабаровского края), а также с референсными последовательностями различных субтипов ВГЕ, представленными в GenBank.

При сравнении изолятов Rabbit 13,78,79,84 с последовательностями кроличьих изолятов ВГЕ из Франции степень сходства составила всего 81%. По-видимому, такие данные можно объяснить тем, что французские изоляты выделены от диких кроликов, в отличие от изолятов, полученных от животных, содержащихся в условиях фермы или вивария в Китае. При проведении анализа изоляты, идентичные в пределах секвенированной области, принимали за один штамм. Из представленных данных видно, что среди обследованных кроликов, содержащихся в виварии, циркулирует два штамма вируса, имеющих совпадение в 85%, что можно объяснить особенностями относительно изолированного содержания животных. При сравнении изолятов Rabbit 13,78,79,84 с референсными последовательностями I, II, IV генотипов процент сходства составил 75%, 77% и 75%, соответственно.

Таблица 2. Определение РНК ВГЕ методом ОТ-ПЦР в об

зазцах фекалий кроликов

Дата сбора материала N образца РНК ВГЕ Дата сбора материала N образца РНК ВГЕ

12.03.2013 11 - 12.03.2013 82 -

12.03.2013 12 - 12.03.2013 83 -

12.03.2013 13 + 12.03.2013 84 +

12.03.2013 14 - 12.03.2013 85 -

12.03.2013 15 - 12.03.2013 86 -

12.03.2013 76 - 13.03.2013 87 -

12.03.2013 77 - 13.03.2013 88 -

12.03.2013 78 + 13.03.2013 89 -

12.03.2013 79 + 13.03.2013 90 -

12.03.2013 80 - 13.03.2013 -

£

hopfrn* OBI

-hepErus QB3

-hepErus ОВ2

HEV Bel 3 * — hepErua FSC1 HfcV Bel 1 5G06 Bel F3 5608 вн F3

-S607 Pel F3

-AB073911 3e

АВСЛМ231 3«

( hepfiu* SCI tOO1 hepErus SC2

-S9090el F2

-5374arch 2

-5320arch 1

¡C

• 41Я4лка1 2 loot- 43R2ekal 3 100 i 39C8>iad I- 3073vlad 10q | 4835» hab 1 14«m* 1 &107KaUn I

- 5151kalin2

- AV032757 3i

— AY323508 3f

- HEV Hoi 4

-5838 Bol F1

,00 . AF298187 H 3d

'AY 115488 S.3j

-AF455784 H3g

- 4502ear 2

-АВ10500Э S Зл

- HEV Bel 2

- АР0034Э0 II 3b

-4в77ваг.З

100 |-AF336298 3C

_

- AF338207 3c.

_| FJ998010 3i

100 I FJ990O12 31 - JQ013792 Rabbi I France

-JQ013791 Rabbit France

I Rabbit 78 Moscow

-^-j Rabbit 79 Moscow

I Rabbit 84 Moscow

-r J906895 Rabbit China

-Rabtxt 13 Moscow

-AB741229 Rabbit China

-F J9O88S0 Rabbit China

-GU937aOS Rabbit China

-00450072 China HEV type IV

-AB097811 Japan HEV type IV

-A Y594199 China HEV type IV

-M74606 HFV2 Moxir.o

-X98292 Indta hevG3/ type I

M73218 Burma H. E urua type I D10330 Bunna HEVNE8L type I AF051830 Nepal HEV TK15/92 type I XH9441 India HFV lypo I

M80681 Pakistan HEV typa I

1 . D11093 China HEV type I

p M94177 China HEV type I AjL U25547 China HEV type I

Рис. 1. Филогенетические взаимоотношения изолятов ВГЕ, выделенных от кроликов, а также людей и свиней. Жирным шрифтом обозначены изоля-ты ВГЕ, выделенные от кроликов (г. Москва) в РФ. Для обозначения региона выделения вируса использованы следующие обозначения: Архангельская область — arch, Владимирская область — vlad, Калининградская область — kalin, Саратовская область — sar, Свердловская область — ekat, Хабаровский край — khab, Белгородская область — Bel. Прототипные изоляты ВГЕ из GenBank приведены с указанием их номеров в базе данных. Анализ частичной нуклеотидной последовательности проводился в ОРС 2 РНК ВГЕ (300 нт., 5996-6295 нумерация по прототипному изоляту Burme — М73128). Филогенетическое дерево построено по алгоритму Neighbour-joining без коррекции (uncorrected distance) при помощи программы MEGA 5.05. Числа в узлах дерева — процент bootstrap-псевдорепли-катов, поддерживаемых данную группу (приведены только достоверные значения >70%). Длина ветвей отражает степень отличия нуклеотидной последовательности вирусов в соответствии с приведенной шкалой.

Таким образом, ВГЕ кроликов наиболее близок третьему генотипу ВГЕ, но, по-видимому, является самостоятельным генотипом вируса.

Данные о значении ВГЕ кроликов для инфекционной патологии человека пока ограничены, поскольку исследования в этом направлении только начинаются. Однако во Франции от заболевшего ГЕ человека выделен вариант вируса, оказавшийся сходным с ВГЕ кроликов, и отличный от изолятов, выделяемых на данной территории от свиней [10].

Таким образом, не исключается возможность передачи ВГЕ от кроликов человеку, аналогично хорошо документированной и доказанной передаче вируса от свиньи человеку.

Обнаружение ВГЕ кроликов трудно переоценить с точки зрения моделирования этой инфекции. Будучи восприимчивыми к заражению

ВГЕ, кролики могут служить альтернативной моделью животных для воспроизведения инфекции, при этом эти животные, в отличие от приматов и свиней, на которых ранее воспроизводили ВГЕ-инфекцию, просты в содержании в условиях вивария.

Заключение

ВГЕ-инфекция у кроликов на территории РФ существует. Анализ сходства нуклеотидных последовательностей в участке ОРС2 РНК ВГЕ кроликов, а также построение филогенетического дерева для данного участка генома ВГЕ с достоверным филогенетическим группированием с использованием бутстрэп-анализа (Bootstrap analysis) подтверждают существование на территории РФ (г. Москва) варианта ВГЕ, являющегося специфичными для данного вида

животных, и отличного от вариантов вируса, характерных для людей и свиней. Филогенетический анализ последовательностей участка генома ВГЕ ОРС2 изученных вариантов свидетельствует в пользу выделения ВГЕ кроликов в отдельный генотип вируса.

Необходимы дальнейшие исследования, для того чтобы оценить значение новых циркулирующих вариантов ВГЕ кроликов с точки зрения возможности передачи вируса человеку и другим животным.

Литература

[1] Emerson S.U., Anderson D., ArankaLLe V.A. Hepevirus. In: Virus Taxonomy, Vlllth Report of the ICTV / eds. Fauquet C.M., Mayo M.A., ManiLoff J., DesseLberger U., Ball L.A. - 2004., London: Elsevier /Academic Press. - P. 851-855.

[2] Purcell R.H., Emerson S.U. Hepatitis E: an emerging awareness of an old disease // J. Hepatol. -2008. - Vol. 48. - P. 494-503.

[3] Balayan M.S., Andjaparidze A.G., Savinskaya S.S., Ketiladze E.S., Braginsky D.M., Savinov A.P., PoLeschuk V. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via the fecal-oral route // Intervirology. - 1983. - Vol. 20. - P. 23-31.

[4] Meng XJ. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk // Vet. Microbiol. - 2010. - Vol. 140. - P. 256-265.

Исаева Ольга Владиславовна, к.б.н.

Руководитель отделения секвенирования

ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

им. М.П. Чумакова» РАМН

142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе эл. почта: isaeva.06@mail.ru

Мохаммед Ахмед Еладли

Аспирант

ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН

142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе

Козлов Виталий Григорьевич

Заведующий отделением диагностических препаратов ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова» РАМН 142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

Малинникова Елена Юрьевна, к.м.н.

Старший научный сотрудник отделения вирусных гепатитов ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН

142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе эл. почта: malinacgb@mail.ru

Кюрегян Карен Каренович, к.б.н.

Руководитель лаборатории этиологии, диагностики, эпидемиологии

и профилактики вирусных гепатитов

ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

им. М.П. Чумакова» РАМН

142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе эл. почта: karen-kvuregyan@vandex.ru

Михайлов Михаил Иванович, д.м.н., профессор, чл.-корр РАМН

Директор ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН

142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе эл. почта: гшс1шцс1]2 @уапс!ех.ги

[5] Johne R., Plenge-Bonig A., Hess М., Ulrich R.G., Reetz J., Schielke A. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR //J. Gen. Virol. -2009. - Vol. 91. - P. 750-758.

[6] Nakamura M., Takahashi K., Taira K., Taira M., Ohno A., Sa-kugawa H. Hepatitis E virus infection in wild mongooses of Okinawa, Japan: demonstration of anti-HEV antibodies and a full-genome nucleotide sequence // Hepatol. Res. - 2006. -Vol. 34. - P. 137-140.

[7] Reuter G., Fodor D., Forgach P., Katai A., Szucs G. Characterization and zoonotic potential of endemic hepatitis E virus (HEV) strains in humans and animals in Hungary// J. Clin. Virol. - 2009. - Vol. 44. - P. 277-281.

[8] Zhao C., Ma Z., Harrison T. J., Feng R., Zhang C., Oiao Z. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China // J. Med. Virol. - 2009. - Vol. 81. - P. 1371-1379.

[9] Takahashi M., Nishizawa Т., Sato H., Sato Y., Jirintai, Na-gashima S., Okamoto H. Analysis of the full-length genome of a hepatitis E virus isolate obtained from a wild boar in Japan that is classifiable into a novel genotype // J. Gen. Virol. - 2011. - Vol. 92. - P. 902-908.

[10] Lhomme S., Dubois M., Abravanel F., Top S., Bertagnoli S., Guerin J.L., Izopet J. Risk of zoonotic transmission of HEV from rabbits // J. Clin. Virol. - 2013 Mar 6. pii: S1386-6532(13)00047-4. doi: 10.1016/j.jcv.2013.02.006. [Epub ahead of print].

[11] Кюрегян K.K., Михайлов М.И. Молекулярно-биологические основы контроля вирусных гепатитов. - Москва: Издательство Икар, 2013. - 336 с.

Isaeva Olga Vladislavovna, PhD

Chief of sequencing department

FSBI "Chumakov Institute of Poliomyelitis

and Viral Encephalitides" RAMS

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskogo shosse e-mail: isaeva.06@mail.ru

Mohammed Ahmed Mohammed Eladly

FSBI "Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides" RAMS

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskogo shosse

Kozlov Vitaly Grygor'evich

Chief of diagnostic medicines department FSUI «Chumakov PIPVE» RAMS.

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskoe shosse

Malinnikova Elena Yurjevna, PhD

Lead researcher of department of viral hepatitis FSBI "Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides" RAMS

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskogo shosse e-mail: malinacgb@mail.ru

Kyuregyan Karen Karenovich , PhD

Head of laboratory of etiology, diagnostics, epidemiology and

prophylaxis of viral hepatitis

FSBI "Chumakov Institute of Poliomyelitis

and Viral Encephalitides" RAMS

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskogo shosse e-mail: karen-kvuregyan@vandex.ru

Prof. Mikhailov Mikhail Ivanovich, PhD member-correspondent of RAMS

Director of FSBI "Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides" RAMS

142782, Moscow, settlement Moskovskiy, community of the Institute of Poliomyelitis, 27 km Kievskogo shosse e-mail: michmich2@vandex.ru