CC BY
45
57984 93 Обнаружение ДНК бруцелл в абортированных плодах коров
с помощью ПЦР
А. Кортез1, Е. Скарцелли2, P.M. Соарес1, М.Б. Хейнеманн1, С.М. Сакамото1, М.Е. Геновез2, Ф. Феррейра1, Л.Дж. Рихтзенхейн1
1 Университет Сро Пауло (Бразилия)
2 Биологический институт Сро Пауло (Бразилия)
Ключевые слова: бруцеллез, диагностика, крупный рогатый скот
Сокращения: БР — буферный раствор; КОЕ — копоние-образующие единицы; ПЦР — полимеразная цепная реакция
Инфекция В. abortus может проявляться абортом и снижением молочной продуктивности [3]. У абортированных по этой причине плодов коров обнаруживают лишь неспецифические поражения и вариабельный по интенсивности автолиз [6]. Сложность постановки диагноза при бруцеллезном аборте [ 1 ] побудила нас изучить возможность применения с этой целью ПЦР с праймерами гена им-муногенного протеина р31 В. abortus [2].
От 61 абортированного плода коров отбирали пробы содержимого желудка и органов (печени, почек, селезенки и легких) плодов. В 11 случаях удалось взять только содержимое желудка, в 26 — пул упомянутых органов, в 24 — содержимое желудка и пул всех четырех органов.
Из полученного патологического материала сделали высевы на бруцеллезный агар (Difco Lab, США), содержавший 10 % стерильной дефибринированной крови барана с антибиотиками и без них. Посевы инкубировали 7 дней при 37 °С в атмосфере с 5 % С02 и в аэробных условиях [10]. Выросшие колонии исследовали посредством окрашивания по Граму и комплексом обычно проводимых для диагностики бруцеллеза биохимических тестов [4, 11].
Пробы органов массой 0,63...10,5 г измельчили с соблюдением стерильности и, смешав со стерилизованной ультрафильтрацией водой, получили 10 %-ю суспензию. Суспензии органов и содержимое желудка хранили при -20 °С вплоть до экстрагирования ДНК, осуществлявшейся 2 методами: термическим и ферментативным.
В первом случае к 200 мл гомогената органов или содержимого желудка добавляли 400 мл БР ТЕ (10 мМ трис-НС1,
1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Суспензию встряхивали 10 с и центрифугировали 5 мин при 13000 g. Осадок ресуспендировали в 400 мл стерилизованной ультрафильтрацией воды при постоянном перемешивании и кипятили в течение 15 мин.
Начальный этап (вплоть до центрифугирования) фер-
ментативного метода был таким же, как и при термическом экстрагировании. Осадок ресуспендировали в 300 мл лити-ческого БР, состоявшего из 15 мкл раствора протеиназы К
(10мг/мл, Gibco BRL, США), 30 мл 10%-го раствора доде-
цилсульфата натрия, 60 мл БР TNE 5-кратной концентрации
(50 мМ трис-НС1, 500 мМ NaCl, 125 мМ ЭДТА, рН 8,0) и
195 мл стерилизованной ультрафильтрацией воды. Суспензии выдерживали 2 ч при 56 "С.
Полученные обоими методами лизаты экстрагировали насыщенным фенолом и его смесью с хлороформом и изоа-
миловым спиртом (25 : 24 : 1) [13]. Осадок ресуспендирова-
ли в 30 мл БР ТЕ и хранили при -20 °С до амплификации ДНК.
Ферментативной амплификации подвергали смеси объемом 50 мл, содержавшие 15 мл воды, 2 мл раствора каждого из dNTP (1,25 ммоль), 5 мл 10-кратного ПЦР-реакционного БР (Gibco BRL, США), 5 мл растворов (10 пмоль/мл) каждого из праймеров (В4 и В5) [2], 1,5 мл (50 ммоль) раствора MgCl2, 0,5 мл раствора (5 Ед/мл) 1ацДНК-полимеразы (Gibco BRL, США) и 10 мл экстракта ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере РТС-200 DNA Engine (MJ Research Inc, США) [2]. В качестве контролей использовали стерилизованную ультрафильтрацией воду (негативный контроль), а также содержимое желудка и пулы органов плодов, специально контаминированные штаммом 1119-3 В. abortus в титре 2,8 х 109 КОЕ/мл [11.
Амплифицированные продукты (10 мл) исследовали с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле, который окрашивали раствором этидиума бромида (0,5 мг/мл). Пробы считали позитивными, если в них обнаруживали специфический фрагмент (223 нуклеотидные пары) генома бруцелл [2].
Положительную реакцию в ПЦР дали 7 проб, из которых изолировали В. abortus, и 4 из 54 проб, признанных в бактериологическом исследовании негативными. Несовпадение показаний этих диагностических тестов могло быть связано с контаминацией патологического материала другими микроорганизмами, наличием в части из них погибших бруцелл или перекрестной контаминацией ими проб при проведении ПЦР (хотя предпринимались все меры для ее избежания |7]). Другие исследователи также отмечали расхождение показаний ПЦР и бактериологического метода диагностики бруцеллеза [5, 8, 9]. Тем не менее в нашем опыте уровень совпадения показаний этих тестов, рассчитанный по каппа-индексу [12], был удовлетворительным (К = 0,73).
О пороге чувствительности ПЦР судили по результатам тестирования свободных от бруцелл проб содержимого желудка и пула органов плодов, контаминированных штаммом 1119-3 В. abortus в титре 2...2х105 КОЕ/мл. При исследовании экстрактов ДНК, полученных ферментативным методом, порог чувствительности ПЦР был ниже (2 КОЕ/мл), чем при экстрагировании ДНК кипячением (20 КОЕ/мл). Б. Кетинкайя и соавт. [5| сообщали о том, что порог чувствительности ПЦР при тестировании содержимого желудка абортированных плодов овец составляет 200 бактерий/мл. Эти авторы пользовались другими способом определения титра бактерий (шкалой МакФар-ланда), набором праймеров и условиями амплификации ДНК. Несмотря на меньшую чувствительность, экстрагирование кипячением имеет преимущества (быстроту выполнения, более низкую стоимость) по сравнению с ферментативным методом.
Поскольку негативные результаты бактериологического исследования не исключают наличия бруцеллезной инфекции, а уровень совпадений показаний ПЦР и результатов изоляции возбудителя на питательных средах в нашем опыте
РВЖ СХЖ №4-2006
был удовлетворительным (К = 0,73), то можно рекомендовать применение ПЦР в качестве дополнительного метода диагностики бруцеллеза при абортах коров.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Alton G.G., Jones L.M., Angus R.D.,Verger J.М. Techniques for the brucellosis laboratory. INRA, Paris, 1988, 190.
2. Baily G.G., Krahn J.B., Drasar B.S., Soker N.G. Detection of Brucella melite-nsis and Brucella abortusby DNA amplification. J Trap Med Hyg, 1992, 95, 271—275.
3. Canant J.C.Jr. Diagnosis of the cause of bovine abortion. Mod Vet Prac, 1985, 66, 107—109.
4. Carter G.R.. Chengappa M.M. Essentials of veterinary bacteriology and mycology. 4th Edn, Lea & Febiger, Philadelphia. 1991. 284.
5. Cetinkaya В., OngorH., Muz A. et al. Detection of Brucella species DNA in the stomach content of aborted sheep foetuses by PCR. Vet Rec, 1999,144, 239—240.
6. Dennis S.M. Infectious bovine abortion: a practioner's approach to diagnosis. Vet Med Small Anim Clin. 1980, 75, 459-^166.
7. Dieffenbach C.W., Dragon E.A., DvekslerG.S. Setting up a PCR laboratory. In : PCR primer: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press, NY, 1995.
8. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M. Detection of Brucellaby polymerase chain reaction in bovine fetal and maternal tissues. J Vet Invest, 1992, 4, 79—83.
9. Gallien P., Dom C„ Alban G. et al. Detection of Brucella species in organs of
naturally infected cattle by polymerase chain reaction. Vet Rec, 1998,142, 512—514.
10. Genovez M.E., Scarcelli E„ Rojas S. et al. Isolamentos bacterianos de fetos abortados bovinos examinados no Instituto Biolygico de Sro Paulo, no pemodo de 1985 a 1992. Braz J Vet Res Anim Sei, 1993. 30, 107—112.
11. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H. et al. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9th Edn, Williams & Wilkins, Baltimore, 1994.
12. Landis J.R., Koch G.G. The measure of observer agreement for categorical data. Biometrics, 1977, 33, 159—174.
13. Sambrook J., Fritsch E.F., ManiatisT. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Edn., Cold Spring Harbor Lab Press, NY, 1989, 957.
SUMMARY
A. Cortez, E. Scarcelli, R.M. Soares, M.B. Heinemann, S.M. Sakamoto, M.E. Genovez, F. Ferreira, L.J. Richtze-nhain. Detection of Brucella DNA from aborted bovine foetuses by polymerase chain reaction. Aust Vet J, 2001, 79, 7, 500—501.
Considering that negative results in bacte-riological culture are no guarantee the absence of Brucella infection and that the estimated concordance between PCR and microbiological culture techniques was good, PCR may be an additional tool for the direct diagnosis of brucellosis from aborted bovine foetuses.
уцк619:616.98:615.371 Вакцины ПрОТив бруцеллеза: прошлое, настоящее и будущее
М.П. Альбертян, А.И. Федоров, М.И. Искандаров, Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (г. Москва)
Ключевые слова: бруцеллез, вакцины, профилактика
Сокращения: Бр — бруцеллы; ВПБ — вакцина(ы) против бруцеллеза; КРС — крупный рогатый скот
Введение
За 100 с лишним лет, прошедших с открытия Бр, установили, что с вызываемой ими болезнью можно бороться двумя путями: созданием у восприимчивых животных с помощью вакцин иммунитета и посредством разрыва эпизоотической цепи инфекции за счет ликвидации источника заражения, который выявляют при проведении диагностических исследований. Выбраковку серопозитивных к Бр животных использовали для ликвидации инфекции в ряде развитых стран Европы и Америки. Такой метод борьбы с бруцеллезом эффективен только при высокой культуре животноводства. В регионах со слабым зоотехническим учетом поголовья общественного сектора, особенно на отгонных пастбищах, при интенсивной миграции животных между стадами практически невозможно наладить систему выявления инфицированных Бр животных. Часто уже через 2...3 дня после взятия крови для лабораторных исследований не удается найти животных, признанных серопозитивными. В этих условиях основным средством борьбы с бруцеллезом становится вакцинация.
Заражение животных 25...30 инфицирующими дозами Бр легко прорывает иммунитет, создаваемый даже самыми имму-ногенными вакцинами. Инфицированное животное при аборте и родах вместе с плодными водами выделяет в окружающую среду миллионы Бр, способных прорвать поствакцинальный иммунитет. Поэтому можно говорить лишь об относительном иммунитете животных, подвергшихся вакцинации.
Роль специфических антител в защите животных от Бр не ясна. Титр специфических агглютинирующих и комплемент-
связывающих антител при бруцеллезе не коррелирует с устойчивостью животных к заражению. Однако появление сывороточных агглютининов после вакцинации затрудняет дифференциацию больных и привитых животных.
Типы вакцин
Наибольшее распространение для иммунизации животных против бруцеллеза получили живые аттенуированные и инактивированные вакцины. Помимо цельноклеточных ВПБ разрабатываются препараты на основе антигенов, выделенных из Бр, рекомбинантные и ДНК-вакцины. Чтобы оценить преимущества и недостатки различных типов ВПБ, попытаемся представить себе идеальную вакцину против этой опасной болезни. Она должна:
• обеспечивать защиту, по меньшей мере, 70% привитых животных;
• быть безопасной в эпизоотическом и эпидемиологическом аспектах (отсутствие реверсии вакцинного штамма в исходные формы, обладающие повышенной вирулентностью, утрата способности вызывать аборт, передаваться другим животным и персистировать в организме привитых животных);
• не индуцировать образования агглютинирующих антител, что позволяет отличать привитых и инфицированных животных;
• не вызывать сенсибилизацию при ревакцинациях;
• не давать побочные эффекты (аборт, воспаление в месте введения и т.д.);
• быть технологичной для массового производства.
Живые ВПБ
Первые варианты живых ВПБ появились в1897 г. Их готовили из вирулентных штаммов Бр. 20-летний опыт применения таких препаратов в ряде стран (Германии, Великобритании, Голландии, Дании, США и Франции) показал, что они способствуют распространению инфекции [301.
