CC BY
188
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК: 579.841.93:579.25].083.1:577.21.08
Ю. К. Кулаков, Л. Е. Цирельсон, М. М. Желудков
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ БРУЦЕЛЛ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ СОБАК И ОЛЕНЕЙ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ
ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва
Цель работы — сравнительная молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и оленей в России, с использованием современных методов типирования. Изоляты от собак (n = 19) и оленей (n = 2) были изучены методом ПЦР с праймерами на видо- и биоварспецифические дифференцирующие мишени бруцелл и MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) с 12 парами праймеров на известные вариабельные локусы генома бруцелл. В ПЦР на дифференцирующие генетические мишени изоляты от собак были охарактеризованы как B. canis, а оленьи изоляты — как B. suis биовар 4. Метод MLVA-типирования изолятов показал 5 идентичных и 7 вариабельных локусов. Дендрограмма на основе данных MLVA-12-типирования объединила все изоляты в генетически родственный кластер вместе с референтными штаммами B. canis RM6/66 и B. suis 1330, Tomsen, 686, 40 биовары 1—4. Было выявлено 17 MLVA-генотипов у изолятов с индексом вариабельности Hunter and Gaston discriminatory index (HGDI) = 0,9842. Молекулярно-генетическая характеристика географически удаленных друг от друга российских изолятов B. canis и B. suis подтверждает существующее положение о близком генетическом родстве этих видов бруцелл. Вместе с тем методом ML VA показаны генетическое разнообразие этих изолятов и привязанность родственных генотипов к географическому региону первичного выделения. Для совершенствования системы эпидемиологического надзора за бруцеллезом в России необходимо проводить MLVA-типирование изолятов, выделяемых от собак и оленей, представляющих эпидемическую опасность для человека.
Ключевые слова: бруцеллез, изоляты, Brucella canis, B. suis, идентификация, ПЦР, MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis)
Бруцеллез — особо опасная зоонозная инфекция, которую вызывают бактерии рода Brucella, способные передаваться от животных к человеку, нанося большой экономический ущерб [1—4].
В последние годы бруцеллез собак, вызываемый видом Brucella canis, приобретает важное эпизоотическое и эпидемиологическое значение в мире [2, 21, 27, 29, 30, 35]. Бруцеллез собак встречается даже в тех странах (Япония, Норвегия, Великобритания, Германия, Чехословакия и др.), где не регистрируют бруцеллез у других видов животных [2, 27, 30,]. Изо-ляты этого потенциально патогенного для человека вида бруцелл выделяют в разных регионах России от больных собак с 1994 г. [2, 5, 6, 9]. До настоящего времени российские изоляты не характеризовались с помощью современных молекулярно-генетических методов [2, 5, 6], а эпидемиологическая значимость бруцеллеза собак не изучена [2].
Бруцеллез северных оленей вызывается высокопатогенным для человека видом B. suis биовар 4, распространенным в полярных районах Аляски, Канады и Сибири [4, 15, 35]. Бруцеллез у домашних и диких северных оленей широко распространен в Восточной Сибири (Ямало-Ненецкий, Таймырский и Эвенкийский автономные округа), на Дальнем Востоке (Чукотка и Камчатка) и является тормозящим фактором дальнейшего развития оленеводства [4, 35].
В последние десятилетия эпизоотическая и эпидемическая обстановка по бруцеллезу в России ухудшилась в связи с сокращением объемов серологических
и бактериологических исследований среди животных и людей, ослаблением ветеринарно-санитарного контроля и образованием новых частных хозяйств [2, 3]. Система противоэпидемических мероприятий по контролю и борьбе с бруцеллезом включает выявление источника инфекции, выделение чистой культуры с проведением как видовой идентификации возбудителя, так и штаммовой дифференциации. Изоляты различных видов бруцелл, выделяемые в регионах России, характеризуют в основном фенотипически-ми методами, не позволяющими выявлять их внутривидовые особенности и связывать с территориями эпидемиологического неблагополучия по бруцеллезу [2—4]. Решение этой проблемы видится в использовании современных методов молекулярно-генетиче-ского типирования изолятов бруцелл. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделяемых от различных природных хозяев, позволяет получать новые данные о генетическом родстве и разнообразии разных видов бруцелл, систематизировать возбудителей бруцеллеза в каталоги, сравнивать с существующими международными базами данных, что в итоге приводит к совершенствованию системы эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией в нашей стране [7, 8].
При полном секвенировании ряда геномов патогенных видов бруцелл выявлены уникальные видо-специфические инсерции и делеции в геномах каждого вида [16, 33], что позволяет использовать их в качестве мишеней в ПЦР для идентификации видов и биоваров бруцелл [7, 8]. Для дифференциации изоля-тов внутри одного вида и выявления их родственных связей успешно применяют метод MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) [14]. Метод основан на сравнительном анализе локусных вариабельных тандемных повторов возбудителя в ПЦР с использованием праймеров, ограничивающих вариабельные локусы 1-й и 2-й хромосом бруцелл [10, 14, 23, 28, 34]. Метод MLVA отражает генетический полиморфизм у штаммов бруцелл одного вида, связанный с разным числом копий повторов в локусах. Преимущества этого метода перед существующими методами SNP (single nucleotide polymorphism) и MLST (multiple loci sequence typing) при типировании изоля-тов патогенных видов бруцелл заключаются в низкой стоимости анализа и высокой разрешающей способности [7, 10, 14, 17, 19—26, 31, 32, 34]. MLVA широко используется в странах Европейского континента [10, 23, 24, 32, 34], Северной и Южной Америки [14, 26, 28], Азии [7, 8, 19—21, 31, 32] для молекулярного ти-пирования изолятов бруцелл разных видов, а также для дифференциации вакцинных штаммов B. abortus 82 и 75/79-AB от полевых изолятов [22]. Этот метод позволяет производить дифференциацию возбудителя бруцеллеза на уровне штаммовых различий, что дает возможность устанавливать источник инфекции,
изучать пути передачи, резервуары и ареалы конкретных изолятов бруцелл.
Цель данного исследования — сравнительная мо-лекулярно-генетическая характеристика изолятов бруцелл, выделенных от собак и северных оленей на различных территориях России.
Материалы и методы
Штаммы бруцелл. В работе использовали 21 изолят бруцелл (табл. 1), выделенные в России в 1994—2008 гг., из коллекции лаборатории бруцеллеза ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. Изоляты были получены в течение 1998—2010 гг. из Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (СПбГАВМ ), ФГУ Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ), Москва и Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных (ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН), Омск. Для сравнительного анализа параллельно использовали 11 референтных штаммов B. melitensis 16M, 63/9, Ether биовар 1—3, B. abortus 544 биовар 1, B. suis 1330, Tomsen, 686, 40, 513 биовар 1-5 — все в S форме и B. canis RM6/66, B.ovis 63/290 R-форма. Штаммы и изоляты бруцелл культивировали на чашках с 1,5% триптозным агаром фирмы "Difco" (США). Изо-ляты изучали традиционными фенотипическими методами идентификации бруцелл [6, 11], а также методом фаготипирования с использованием видоспецифических вирулентных бруцеллезных фагов Tb, Wb, Bk, Fi, M51, S-708, JP32A3 [11].
Выделение ДНК. Бактериальную массу каждого изолята и референтных штаммов собирали с чашек триптозного агара на кончик петли и выделяли ДНК по методике R. Boom и соавт. [13] с использованием сорбента на основе двуокиси кремния (silicon dioxide).
Метод ПЦР. В работе использовали праймеры, синтезированные в ЗАО "Синтол" (Россия), на родо- и видоспецифические дифференцирующие мишени генов белков бруцелл: иммуно-
тобулинсвязывающего белка EIBE (BruAb1_1825), белков неизвестной функции (BRA0378 и BruAb1_0266), рекомбиназы (BMEI1661), наружного белка транспортера (BruAb2_0168) и глюкозофосфаттрансферазного белка (BMEII0827) [7, 8]. Реакционная смесь содержала 25 мкл следующего состава: 67 мМ трис-НС1 рН 8,6, 2,5 мМ MgCl2, 16,6 мМ (NH4)2SO4 , 0,2 мМ каждого из дНТФ, по 6 пмоль каждого праймера, 1,5 ед. Tag-полимеразы ("Силекс", Россия) и 1—10 нг ДНК каждого изолята. В качестве положительного контроля использовали по 10 нг ДНК-референтных штаммов бруцелл. Амплификацию проводили на термоциклере МС-2 Терцик производства "ДНК-Технология", Россия, в режиме: 94°С — 90 с, 1 цикл,; 94°С — 20 с, 54°С — 40 с, 72°С — 40 с, 35 циклов и 72°С — 5 мин.
MLVA. Праймеры, фланкирующие 12 известных вариабельных локусов BRU1322, BRU211, BRU73, BRU588, BRU1543, BRU1250, BRU548, BRU339 [23] и VNTR26, VNTR24, VNTR12B, VNTR5A [34], были также синтезированы в ЗАО "Синтол" (Россия). Праймеры к определенным локусам использовались в 5 мультиплексных ПЦР [7, 8]. Мультиплекс 1 включал праймеры для 3 локусов BRU211_63 п. н. (название локуса_ размер тандемного повтора), VNTR24_40 п. н. и BRU588_8 п. н.; мультиплекс 2 — 3 локуса BRU73_15 п. н., VNTR26_18 п. н. и VNTR5A_8 п. н.; мультиплекс 3 — 2 локуса BRU1543_8 п. н. и BRU1250_8 п. н.; мультиплекс 4 — 2 локуса BRU548_8 п. н. и BRU339_8 п. н.; мультиплекс 5 — 2 локуса BRU1322_134 п. н. и VNTR12B_8 п. н. Амплификацию выполняли в том же тер-моциклере и составе реакционной смеси в следующем режиме: 94°С — 5 мин, 1 цикл, 94°С — 30 с, 60°С — 30 с, 72°С — 60 с, 30 циклов и 72°С — 5 мин.
Ампликон в количестве 3—5 мкл вносили в ячейку 4% ага-розного геля на трис-ацетатном буфере и проводили электрофорез при напряжении 8 В/см, в течение 2 ч. Для визуализации гель окрашивали раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой и фотографировали. Размеры ампликонов переводили в числовой формат тандемных повторов
Таблица 1
Изоляты бруцелл, изученные в работе
№ изолята Хозяин (или порода собаки) Год выделения
839 Лабрадор 2006
832 Беспородная собака 1998
831 " " 1998
830 " " 1998
828 Мастино 1998
827 Беспородная собака 1998
824 " " 1998
К-01 Стаффордширдский терьер 1994
838 Кавказская овчарка 2006
837 " " 2006
77 Лабрадор 2008
885 Кавказская овчарка 2008
886 Ка де Бо 2008
849 Доберман-пинчер 1997
850 Лайка 1997
851 Немецкая овчарка 1999
852 Стаффордширский терьер 1999
853 Чау-чау 2000
854 Русская борзая 2002
3796 Северный олень, важенка 2004
3797 Северный олень, бык 2004
Регион
Источник поступления
Санкт-Петербург
СПбГАВМ, Санкт-Петербург
Волгоградская область Москва
Санкт-Петербург Москва
Омск
ВГНКИ, Москва
ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН, Омск
Ямало-Ненецкий автономный округ, Тазовский район
каждого локуса у всех изолятов путем сравнения с ДНК маркером O'Gene Ruler 100 п. н. фирмы "Fermentas" (Литва) и ампликонами контрольных референтных штаммов с известным количеством тандемных повторов в каждом локусе.
Кластерный анализ проводили на построенной по данным MLVA-12 дендрограмме с использованием программного обеспечения SAS JMP версии 8.
Анализ MLVA генотипов в числовом формате выполняли на сайте The Microorganisms Tandem Repeats Database (http://minisatellites.u-psud.fr) с использованием on-line инструментов и международных баз данных о генотипах изолятов Brucella.
Генетическое разнообразие
рассчитывали с помощью индекса разнообразия (Hunter and Gaston discriminatory index -HGDI) [18] для каждого из 12 локусов в отдельности и для всех локусов с использованием on-line калькулятора на сайте http://insilico.ehu. es/mini_tools/ discriminatory_power [12]. HGDI обозначает вероятность различий по генотипу (от 0 до 1) двух произвольных изолятов из анализируемого количества. Разрешающая способность метода прямо пропорциональна значению HGDI и максимальна при 1.
Результаты и обсуждение Фаготипирование и генетическая идентификация изолятов бруцелл до уровня вида и биовара
Изоляты от собак были резистентны к лизису при использовании вирулентных бруцеллезных фагов, что соответствовало профилю, характерному для вида B. canis. Изоляты от оленей лизировались специфическими фагами Wb, Bk, Fi, M51, S-708, но проявляли устойчивость к лизису специфическими фагами для вида B. abortus Tb и JP32A3 и имели профиль лизиса бруцеллезными фагами, соответствующий референтному штамму B. suis 40 биовар 4.
Результаты анализа ПЦР на родовые, видовые и биоварные специфические дифференцирующие генетические мишени бруцелл представлены в табл. 2. Все изоляты бруцелл имели положительный результат в ПЦР с праймерами на родовую мишень гена BruAb1_1825 и мишень BMEI10827, отсутствующую только у референтного штамма B. abortus 544 биовар 1, и общую специфическую мишень BRA0378 для видов B. canis и B. suis биовар 1—4.
Таблица 2
Результаты ПЦР изолятов и референтных штаммов бруцелл на дифференцирующие мишени
h30jist Brucella Видовые и биоварные дифференцирующие мишени генов белков бруцелл
BruAb1_1825 BRA0378 BMEI1661 BruAb2 0168 BruAb1_0266 BMEII0827
839 + + - - - +
832 + + - - - +
831 + + - - - +
830 + + - - - +
828 + + - - - +
827 + + - - - +
824 + + - - - +
K-01 + + - - - +
838 + + - - - +
837 + + - - - +
77 + + - - - +
885 + + - - - +
886 + + - - - +
849 + + - - - +
850 + + - - - +
851 + + - - - +
852 + + - - - +
853 + + - - - +
854 + + - - - +
3796 + + - - - +
3797 + + - - - +
Референтные штаммы
B. melitensis 16M ÔHOBap 1 + - + - + +
B. melitensis 63/9 ÔHOBap 2 + - - - + +
B. melitensis Ether ÔHOBap 3 + - + - + +
B. abortus 544 ÔHOBap 1 + - - + + -
B. .suis 1330 ôho-Bap 1 + + - - - +
B. suis Tomsen ÔHOBap 2 + + + - + +
B. suis 686 ôho-Bap 3 + + + - - +
B. suis 40 ôho-Bap 4 + + - - - +
B. suis 513 ôho-Bap 5 + - + - - +
B. canis RM6/66 + + - - - +
B.ovis 63/290 + - + - - +
Отрицательный результат наблюдали для всех изолятов в ПЦР на видовые мишени для видов B. melitensis и B. abortus — BruAb1_0266, B. melitensis биовар 1, 3 и B. suis биовар 2, 3, 5 — BMEI1661 и на видовую мишень B. abortus —BruAb2_0168, что исключало принадлежность изолятов к этим видам и
биоварам. Дифференциация между близкородственными видами B. canis и B. suis биовар 4 достигалась за счет разного размера ампликона в ПЦР на родовую мишень гена BruAb1_1825.
Таким образом, результаты фаго- и генотипиро-вания в ПЦР с видовыми и биоварными праймерами соответствовали данным традиционной фенотипиче-ской идентификации, свидетельствующим и о том, что 19 изолятов от собак относятся к виду B. canis и 2 изолята от оленей — к B. suis биовар 4.
Молекулярно-генетическая характеристика изолятов B. canis и B. suis методом MLVA-12
Для дифференциации изолятов внутри вида и подтверждения их генетического родства мы использовали метод MLVA. 12 локусов, содержащих тандемные повторы от 8 до 134 п. н., были амплифицированы в ПЦР с матриц ДНК 21 изолята B. canis, B. suis биовар 4 и 11 контрольных референтных штаммов бруцелл. В табл. 3 представлены индексы вариабельности HGDI для каждого локуса, генетический полиморфизм у изо-лятов B. canis, B. suis биовар 4 был связан с 7 локуса-ми, содержащими короткие тандемные повторы 8 п. н. (BRU1543, HGDI = 0,83; BRU1250, HGDI = 0,7787; BRU588, HGDI = 0,8696; BRU548, HGDI = 0,7549; BRU339, HGDI = 0,7866; VNTR12B, HGDI = 0,8617; VNTR5A, HGDI = 0,7984). В целом схема MLVA-типирования показала высокую разрешающую способность метода с индексом вариабельности HGDI = 0,9842 для 7 вариабельных локусов, при этом наибольшая вариабельность была связана с локусом BRU588, для которого HGDI = 0,8696. Методом MLVA также была выявлена у всех изолятов B. canis и B. suis биовар 4 идентичность 5 локусов (BRU1322, BRU211, VNTR24, VNTR26, BRU73; HGDI = 0), которые обусловливали генетическое родство анализируемых изолятов.
Размеры ампликонов были переведены в числовой формат копий тандемных повторов для каждого локу-са и на основе этих данных была построена дендро-грамма кластерного анализа, представленная на рисунке. В верхней части дендрограммы в удалении от
Таблица 3
Генетическое разнообразие изолятов B. canis (n = 19) и B. suis (n = 2) по данным MLVA-12 по количеству генотипов, числу копий тандемных повторов в локусе и индексу вариабельности (HGDI) для каждого локуса
Локус Количество геноти- Число копий тандем- HGDI
пов для локуса ных повторов в локусе
BRU1543 — (Bruce 04) 7 12, 11, 10, 9, 8, 7, 4 0,83
BRU1322 — (Bruce 06) 1 2 0
BRU1250 — (Bruce 07) 7 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14 0,7787
BRU588 - - (Bruce 09) 9 18, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 7 0,8696
BRU211 - - (Bruce 11) 1 9 0
BRU73 — (Bruce 12) 1 11 0
BRU548 - (Bruce 16) 5 3, 4, 5, 6, 10 0,7549
BRU339 - - (Bruce 18) 6 8, 7, 6, 5, 4, 3 0,7866
VNTR24 1 3 0
VNTR26 1 2 0
VNTR5A 7 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5 0,7984
VNTR12B 9 22, 20, 18, 14, 12, 11, 10, 8, 6 0,8617
изучаемых изолятов расположились контрольные референтные штаммы бруцелл B. melitensis 16M, 63/9, Ether биовар 1—3, B. abortus 544 биовар 1, B. neoto-mae 5K33, B. ovis 63/290 и представитель биовара 5 B. suis 513. Обособленное положение биовара 5 B. suis от других биоваров этого вида бруцелл согласуется с данными современной таксономии бруцелл [33].
Филогенетический анализ показал, что все изо-ляты B. canis и B. suis биовар 4 образуют 17 генотипов, которые вместе с референтными штаммами B. canis RM6/66 и B. suis 1330, Tomsen, 686, 40 биовар 1—4 объединяются в 6 близкородственных кластеров, соединенных на основании генетического родства в общий кластер.
Идентичными по MLVA-генотипу оказались изо-ляты B. suis 3796 и 3797, выделенные в одном оленеводческом хозяйстве Тазовского района в Ямало-Ненецком автономном округе из пантов быка и важенки, что подтверждает циркуляцию как минимум одного вирулентного штамма в очаге инфекции этого хозяйства. Это может указывать на эпизоотическое неблагополучие данного района, поскольку носителями вирулентного штамма был не только бык-производитель, но и не приносившая потомства важенка. Эти изоля-ты вместе с референтным штаммом B. suis 40 биовар 4 вошли в родственный кластер, к которому примыкал кластер из 4 изолятов B. canis 827, 831, 832, 828, выделенных в 1998 г. в Санкт-Петербурге от разных собак.
Следующий кластер составили референтный штамм B. suis 686 биовар 3 вместе с изолятами B. ca-nis 824, 830 и 839 из Санкт-Петербурга, между которыми расположились омские изоляты 850 и 854.
Референтные штаммы B. suis 1330 биовар 1 и B. ca-nis RM6/66 оказались по соседству в одном кластере, несмотря на такие принципиальные фенотипические различия, как специфичность в отношении хозяев (свиньи для B. suis биовар 1 и собаки для B. canis) и различные S- и R-формы. Результаты анализа последовательно секвенированных генов показали, что B. canis в отличие от B. suis имеет 2 неполных гена wbkF fUndecaprenyl-glycosyltransferase) и wbkD (epimerase/dehydTatase) из 19 синтетических генов, формирующих S-форму ЛПС [33]. B. canis находится в R-форме в связи с повреждением как минимум одного из этих генов.
Единственное исключение составили изоляты B. canis К-01 и 77 из Волгоградской области и Caнкт-Петербурга, расположившиеся вместе при разном географическом происхождении. Как видно на дендрограм-ме, между этими изолятами степень генетического родства меньше в сравнении с изо-лятами из одного географического региона.
В нижней части дендрограммы образован кластер из изолятов B. canis 838 и 837, 885 и 886, выделенных в Москве от разных собак, но из одного питомника, что подтверждает циркуляцию конкретного штамма в очаге инфекции.
В самой нижней части дендрограммы расположился кластер из изолятов B. canis 849, 851, 852 и 853, выделенных в Омске от разных собак у частных хозяев.
4 <
5 <
6
Таким образом, изоляты из близкородственных кластеров были связаны с географическим регионом их выделения. При этом ряд изолятов, выделенных от разных собак в Москве (838 и 837, 885 и 886), Санкт-Петербурге (831 и 832) и Омске (852 и 853), оказались даже идентичными по MLVA-генотипу. На основании генетического родства и расположения изолятов на дендрограмме можно сделать предположение о разном характере эпи-зоотий собачьего бруцеллеза в Омске, Москве и Санкт-Петербурге.
Молекулярные методы типирования и диагностики необходимо использовать для эффективного эпидемиологического контроля за бруцеллезной инфекцией в России и постоянного мониторинга циркуляции возбудителя бруцеллеза в популяциях естественных хозяев 3 на различных территориях России. Известное близкое генетическое родство видов B. canis и B. suis [16, 33] показано и на примере изученных нами российских изолятов B. canis и B. suis биовар 4. Сравнение наших результатов с международными базами данных MLVA-генотипов [25] продемонстрировало, что российские изо-ляты отличаются от изолятов собак и оленей, выделенных в других странах [20, 21, 23, 34], но имеют генетическое родство за счет идентичных локусов BRU1322, BRU211, BRU73.
MLVA-генотипы у анализируемых изоля-тов бруцелл ассоциировались также с регионом их первичного выделения, что позволяет решать задачи молекулярной эпидемиологии, связанные с мониторингом бруцеллезной инфекции, выявлением путей передачи и резервуаров конкретных изолятов бруцелл и определением с большой степенью достоверности источника инфекции при вспышке заболевания [4, 7, 10, 14, 17, 19—26].
Таким образом, генетическая характеристика российских изолятов B. canis и B. suis показала как их генетическое родство, так и определенные различия. Эти данные позволяют сделать заключение об их родственном происхождении и привязать MLVA-генотипы к определенным территориям циркуляции возбудителя. Дальнейшее широкое применение метода MLVA-типирования изолятов бруцелл, выделяемых на территории России, может способствовать качественному улучшению системы эпидемиологического надзора за бруцеллезом.
Авторы выражают глубокую благодарность за любезное предоставление изолятов бруцелл зав. отделом ВГНКИ, (Москва), О. Д. Склярову, зав. лаб. СПбГАВМ Санкт-Петербург, В. А. Гришиной, зав. лаб. диагностики бруцеллеза ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН (Омск), Л. В. Дегтяренко, зав. отделом экологии Л. Н. Гордиленко и П. К. Аракеляну
Сведения об авторах
Кулаков Юрий Константинович — вед. науч. сотр. лаб. бруцеллеза, канд. мед. наук ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва; е-mail: ykulakov@mail.ru;
B.suis 513 В. melitensis 63/9 В. ovis 63/290 В. melitensis 16М В. melitensis Ether В. abortus 544 В. neotomae 5КЗЗ В. suis 3796 В .suis 3797
B. suis 40
C.-Петербург В. canis 827 С.-Петербург В. canis 831 С.-Петербург В. canis 832 С.-Петербург В. canis 828
B. suis 686
C.-Петербург В. canis 839 Омск В. canis 850
Омск В. canis 854 С.-Петербург В. canis 824 С.-Петербург В. canis 830
B. suis 1330
США В. canis RM/66 Волгоград В. canis К-01
C.-Петербург В. canis 77 В. suis Thomsen Москва В. canis 838 Москва В. canis 837 Москва В. canis 885 Москва В. canis 886 Омск В. canis 849 Омск В. canis 851 Омск В. canis 852 Омск В. canis 853
3
0г
Генетическое родство
*-х-*хххххх-х
хххх-хххххххх*
1000/()........—-
Кластерный анализ на основе данных MLVA-12 изолятов B. canis (n = 19),
B. suis 3796, 3797 и 11 референтных штаммов бруцелл разных видов и биоваров (B. melitensis 16м, 63/9, Ether биовар 1—3, B. abortus 544 биовар 1 , B. suis 1330, B. suis Tomsen, B. suis 686, B. suis 40, B. suis 513 биовар 1—5, B. canis RM6/66 и B. ovis 63/290).
Слева обозначено географическое происхождение изолятов B. canis и фигурными скобками объединены родственные кластеры 1—6.
Цирельсон Людмила Екимовна — вед. науч. сотр. лаб. бруцеллеза, д-р мед. наук; е-шаП: ltsirelson@mail.ru;
Желудков Михаил Михайлович — рук. лаб. бруцеллеза, д-р мед. наук; е-таП: mmzhel.gamaleya@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вершилова П. А. // Бруцеллез. — М.: Медицина, 1972.
2. Желудков М. М. Бруцеллез в России: современная эпидемиология и лабораторная диагностика: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — М., 2009.
3. Желудков М. М., Цирельсон Л. Е., Кулаков Ю. К. и др. // Эпиде-миол. и вакцинопрофилактика. — 2009. — № 6. — С. 23—28.
4. Калиновский А. И. Бруцеллез в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. — Иркутск, 2006.
5. Кулаков Ю. К., Желудков М. М., Драновская Е. А. и др. // Молекул. генетика. — 1997— № 3. — С. 15—17.
6. КулаковЮ. К., ЖелудковМ. М., Толмачева Т. А. и др. // Молекул. генетика. — 2000.— № 4. — С. 7—12.
7. Кулаков Ю. К., Е^епеЬаШаг 3., Цирельсон Л. Е. и др. // Журн. микробиол. — 2010. — № 3. — С. 17 -22.
8. КулаковЮ. К., Е^епеЬаа1аг3., Желудков М.М. и др. // Молекул. генетика. — 2011. — № 2. — С. 8—12.
9. Шумилов К. В., Калмыков В. В., МихайловаЮ. П. и др. // Ветеринария. — 1996. — № 5. — C. 55—59.
10. Al Dahouk S., Le Fleche P., Nockler K. et al. // J. Microbiol. Meth. —2007. — Vol. 69. — P. 137—145.
11. Alton G. G., Jones L. M., Angus R. D. et al. // Techniques for the brucellosis laboratory. — Paris, 1988. — Р. 54—58.
12. Bikandi J., San Millan R., Rementeria A. et al. // Bioinformatics. — 2004. —Vol. 20. — P. 798—799.
13. Boom R., Sol C. J., Salmans M. M. et al. // J. Clin. Microbiol. — 1990. — Vol. 28. — P. 495—503.
14. BrickerB. J., EwaltD. R. // Bio. Med. Centr. Microbiol. — 2005. — Vol. 5. — P. 37.
15. ForbesL. B. // Can. Vet. J. — 1991. — Vol. 32, N 11. — P. 686—688.
16. Halling S. M., Peterson-Burch B. D., Bricker B. J. et al. // J. Bacte-riol. —2005. — Vol. 187. — P. 2715—2726.
17. Her M., Kang S. I., Kim J. W. et al. // J. Microbiol. Biotechnol. —2010. — Vol. 20. — P. 1750—1755.
18. Hunter P. R., Gaston M. A. // J. Clin. Microbiol. — 1988. — Vol. 26. — P. 2465—2466.
19. Jiang H., Mao L. L., Zhao H. Y. et al. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. — 2010. — Vol. 104, N 12. — P. 796—800.
20. Jiang H., Mao L. L, Zhao H.Y. et al. // Vet. Microbiol. — 2012. — Vol. 154, N 3—4. — P. 419—421.
21. Kang S. I., Heo E. J., Cho D. et al. // J. Vet. Med. Sci. — 2011. — Vol. 73, N 6. — P. 779—786.
22. Kulakov Y. K., Zheludkov M. M., Sclyarov O. D. // Vaccine. — 2010. — Vol. 28 (suppl 5). — P. 41—45.
23. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M. et al. // Bio. Med. Centr. Micro-biol. — 2006. — Vol. 6. — P. 9.
24. MaquartM., Le Fleche P., Foster G. et al. // Bio. Med. Centr. Microbiol. — 2009. — Vol. 9. — P. 145.
25. Microorganisms tandem repeats database. http://minisatellites.u-psud.fr.
26. Nockler K., Maves R., Cepeda D. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol.47, N 10. — P. 3147—3155.
27. Nomura A , Imaoka K., Imanishi H. et al. // Emerg. Infect. Dis. —2010.—Vol. 16, N 7. — P. 1183—1185.
28. ReesR.K., GravesM., CatonN. et al. // J. Microbiol. Meth. —2009. — Vol.78, N 1. — P. 66—70.
29. Sayan M., Erdenlig S., Stack J. et al. // Jpn. J. Infect. Dis. — 2011. — Vol. 64, N 6. — P. 516—519.
30. Strom Holst B., Lofqvist K., Ernholm L. et al. // Acta Vet. Scand. — 2012. — Vol. 54, N 1. — P. 18.
31. Tiller R. V., De B. K., Boshra M. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol.47, N 7. — P.2226—2231.
32. Valdezate S., Navarro A., Villalon P. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2010. — Vol.48, N 8. — P. 2734—2740.
33. Wattam A. R., Williams K. P., Snyder E. E. et al. // J. Bacteriol. — 2009. — Vol. 191. — P. 3569—3579.
34. Whatmore A. M., Shankster S. J., Perrett L. L. et al. // J. Clin. Microbiol. — 2006. — Vol. 44. — P. 1982—1993.
35. ZheludkovM. M., TsirelsonL. E. // Biol. Bull. — 2010. — Vol. 37, N 7. — P. 709—715.
Поступила 24.05.12
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF CANINE AND RANGIFERINE BRUCELLA ISOLATES FROM DIFFERENT REGIONS OF RUSSIA
Y. K. Kulakov, L. E. Tsirelson, M. M. Zheludkov
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow, Russia Goal. Comparative molecular-genetic characterization of Brucella isolates from dogs and reindeers in Russia by molecular-genetic typing methods.
Materials and methods. 19 canine and 2 rangiferine Brucella isolates were studied by molecular typing methods based on PCR for differential species and biovar specific molecular targets and MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) using primers to 12 known variable loci.
Results. Using PCR for differential molecular targets, canine Brucella isolates were characterized as B. canis and rangiferine isolates as B. suis biovar 4. MLVA revealed 5 identical and 7 variable MLVA loci. Using the dendrogram, all the isolates on the data of 12 loci were classified into the close related cluster. On the other hand, high discrimination power of MLVA with a resulting Hunter and Gaston discriminatory index (HGDI) of 0.9842 was shown to reveal genetic diversity for the isolates of 17 MLVA genotypes. Conclusion. B. canis and B. suis isolates from different geographical regions in Russia were genetically close related, thereby confirming known genetic relationship between these species. Related MLVA genotypes of isolates were connected to certain regions of preliminary isolation in Russia. To improve the system of brucellosis surveillance in Russia MLVA typing of more canine and rangiferine Brucella isolates having epidemiological danger for humans is required to be studied. Key words: Brucellosis, isolates, Brucella canis, Brucella suis, identification, PCR, MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis)
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.98:578.823.91
Е. В. Жираковская1, Р. Х. Аксакова2, М. Г. Горбунова3, А. Ю. Тикунов1, А. М. Курильщиков1,
С. Н. Соколов2, С. В. Нетесов2, Н. В. Тикунова1
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ИЗОЛЯТОВ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А, ВЫЯВЛЕННЫХ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ В 2007—2011 ГГ.
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; 2Новосибирский государственный университет; 'Управление Роспотребнадзора по Омской области, Омск
Проведен генетический анализ изолятов ротавируса группы А, выявленных в фекалиях детей, госпитализированных в стационары Новосибирска и Омска в течение 4 эпидемических сезонов: 2007, 2007/08, 2009/10, 2010/11. Методом мультиплексной ПЦР генотипировано 1416 изолятов ротавируса группы А. Показано, что в 2007—2011 гг. в Западной Сибири социркулиро-вали изоляты широко распространенных генотипов 01Р[8], 04Р[8], 02Р[4], 03Р[8]. В единичных случаях определены генотипы 09Р[8], 02Р[8], 03Р[9] и 04Р[6]. В 2008 г. в Омске, а в 2009 г. в Новосибирске произошла замена доминирующего генотипа 01Р[8] генотипом 04Р[8]. Встречаемость и спектр циркулировавших генотипов различались и изменялись каждый эпидемический сезон в обоих городах. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 3 фрагментов генома, кодирующих белки УР4 (УР8*), УР7 и УР6, показал, что боль-
шинство новосибирских и омских изолятов кластеризовались вместе и демонстрировали высокую степень гомологии с изо-лятами, выявленными в других регионах Евразии. Кроме того, впервые в Новосибирске обнаружены 14 изолятов ротавируса (генотипов 09, 01 и 04), относящихся к редкой сублинии Р[8]Ь (0Р354-Ике) гена, кодирующего белок УР4, а в Омске — единственный изолят 0т8к08-381/09Р[8]Ь. Результаты, полученные в этом исследовании, указывают на необходимость длительного мониторинга изолятов ротавируса, циркулирующих на территории Западной Сибири, что важно при выборе ротавирусной вакцины для иммунизации детей раннего возраста, совершенствования диагностических наборов для этой инфекции, а также для понимания эпидемиологии и эволюции ротавирусов группы А. Ключевые слова: ротавирусы группы А, УР4, УРб, УР7, дети, генотипирование, филогенетический анализ
