Определение видовой принадлежности штаммов бруцелл из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" с помощью амплификационных и рестрикционных технологий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Пробл. особо опасных инф. 2016; 4:69-74. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-69-74

УДК 616.98:579.841.93

н.А.осина, ЖАЖасьян, и.АЖасьян, о.Ю.ляшова, А.В.осин

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ ИЗ ФОНДА ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ «МИКРОБ» С ПОМОЩЬЮ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ И РЕСТРИКЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,

Российская Федерация

цель работы. Определение таксономического положения штаммов Brucella spp. с использованием комплекса амплификационных и рестрикционных методов. материалы и методы. Проведено уточнение видовой принадлежности 17 типовых и 48 природных штаммов из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с использованием амплификационного («Ген Brucella - идентификация - РГФ», AMOS-DEL, Bruce-Ladder, Suis-Ladder) и рестрикционного анализа omp25, omp2a, omp2b локусов с помощью ферментов AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV). результаты и выводы. В ходе проведенной молекулярной идентификации у 50 штаммов бруцелл подтверждено таксономическое положение, указанное в паспорте штамма, у 12 культур уточнена видовая принадлежность. Для трех штаммов бруцелл установлены новые профили амплификации и рестрикции, что указывает на необходимость продолжения исследований. Полученные результаты в полной мере подтверждают перспективность применения комплексного подхода с использованием нескольких амплификационных систем и препаратов и рестрикционного анализа для определения видовой принадлежности штаммов к виду и биовару возбудителя бруцеллеза.

Ключевые слова: бруцеллы, идентификация, таксономическое положение, амплификационные системы, рестрикционный анализ.

Корреспондирующий автор: Наталия Александровна Осина, e-mail: rusrapi@microbe.ru.

N.A.Osina, Zh.A.Kas'yan, I.A.Kas'yan, O.Yu.Lyashova, A.V.Osin

Determination of Specific Appurtenance of Brucella Strains Stored in the State Collection of Pathogenic Bacteria "Microbe", Using Amplification and Restriction Techniques

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation

Objective of the study is to identify species appurtenance of Brucella spp. strains, using a complex of restriction and amplification techniques. Materials and methods. Carried out has been revision and clarification of species appurtenance of 17 reference and 48 natural strains, stored in the biobank of the State collection at the RusRAPI "Microbe", using amplification ("Gen Brucella - identification - RGF", AMOS-DEL, Bruce-Ladder, Suis-Ladder) and restriction analyses of omp25, omp2a, omp2b loci, applying AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV) ferments. Results and conclusions. Performed molecular identification has confirmed the stated in the profile taxonomic status of 50 Brucella strains, while for 12 isolates species appurtenance has been rectified. New profiles of amplification and restriction have been established for three cultures, which outlines the necessity to continue further investigations. The results obtained fully substantiate the prospects of the complex approach, which implies several amplification systems and preparations, as well as restriction analysis for determination of species and biovar of brucellosis agent strains.

Key words: Brucella, identification, taxonomic status, amplification systems, restriction analysis.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Natalya A. Osina, e-mail: rusrapi@microbe.ru.

Citation: Osina N.A., Kas'yan Zh.A., Kas'yan I.A., Lyashova O.Yu., Osin A.V. Determination of Specific Appurtenance of Brucella Strains Stored in the State Collection of Pathogenic Bacteria "Microbe", Using Amplification and Restriction Techniques. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 4:69-74. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-69-74

Бруцеллез является особо опасным и социально значимым инфекционным заболеванием, которое обуславливает высокий уровень инвалидизации больных, а также наносит значительный экономический ущерб. На сегодняшний день известно 11 видов бруцелл. В Российской Федерации зарегистрирована циркуляция 6 видов, из которых в заражении человека и животных основную роль играют виды B. abortus и B. melitensis. Идентификация возбудителя бруцеллеза до сих пор остается серьезной проблемой лабораторной диагностики.

Определение видовой принадлежности бруцелл с использованием традиционной схемы предусма-

тривает изучение роста штаммов в атмосфере с избыточным содержанием углекислоты и на средах, содержащих фуксин и тионин, образования сероводорода и наличия дезаминазной активности, агглю-тинабельности моноспецифическими (А-, М-, R-) сыворотками, чувствительности к бруцеллезным бактериофагам Тб (Тбилиси), Wb (Weybridge), Fi (Firenze), Bk2 (Berkley). Выполнение таких исследований трудоемко, продолжительно и не позволяет дифференцировать все основные виды бруцелл. Часть штаммов возбудителя бруцеллеза, находящаяся в фонде Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» была полу-

чена в 1923-1966 гг., когда определение их видовой принадлежности зачастую основывалось на источнике выделения патогена. В связи с этим представляет интерес исследование штаммов Brucella spp. с помощью современных методов лабораторной диагностики. В настоящее время все более широкое применение получают молекулярно-генетические методы исследования, такие как ПЦР и ее модификации.

За последние годы зарубежными и отечественными авторами накоплен положительный опыт по применению полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации Brucella spp. Одним из первых способов, разработанных с этой целью, являлась система AMOS, предложенная Bricker и соавт. в 1994 г., и позволяющая определять В. abortus 1, 2-го и 4-го биоваров, В. melitensis всех биоваров, В. suis 1-го биовара [2]. Позднее эта система была модифицирована (AMOS-DEL), что позволило дополнительно идентифицировать штаммы B. abortus 3, 5, 6-го и 9-го биоваров [4]. Однако, несмотря на то, что данный подход получил широкое применение, с его помощью невозможно определить ряд видов и био-варов бруцелл.

Одной из референтных методик по определению видовой принадлежности бруцелл в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения животных является Bruce-Ladder [5]. Предложенный способ обеспечивает идентификацию видов B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae, B. ceti/B. pinnipedialis, а также дифференциацию ряда вакцинных штаммов: B. abortus S19, B. abortus RB51, B. melitensis Rev1. Однако с помощью данной методики не представлялось возможным точное определение таксонов B. canis и B. suis, вследствие близких амплификаци-онных профилей, наблюдающихся у ряда штаммов этих видов. Позднее, практически от той же группы авторов, была предложена система Suis-Ladder, обеспечивающая идентификацию всех биоваров B. suis, а также видов B. canis и B. microti [6].

ранее нами был разработан и зарегистрирован набор реагентов «Ген Brucella - идентификация -РГФ», позволяющий дифференцировать виды или группы видов бруцелл: B. abortus/B. ovis; B. melitensis; B. suis/B. canis; B. neotomae методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, эффективность которого подтверждена при выявлении и ускоренной идентификации бруцелл в материале от животных [1].

A.Cloeckaert et al. [3] показана возможность определения некоторых видов и биоваров бруцелл на основании рестрикции генов omp25, omp2a, omp2b.

Несмотря на очевидную перспективность применения молекулярно-генетических методов для идентификации бруцелл, все обозначенные выше приемы и тест-системы не позволяют в полной мере дифференцировать виды B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae с учетом их биоварной принадлежности. Одним из способов в ре-

шении данного вопроса может быть использование представленных подходов в совокупности.

Целью исследования было определение таксономического положения штаммов Brucella spp. из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» с использованием комплекса ам-плификационных и рестрикционных

Материалы и методы

Всего в исследовании использовано 17 типовых и 48 природных штаммов.

Культуры выращивали на эритрит-агаре (НИИ им. Мечникова, Москва), рН 7,2, при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. Из выросших культур готовили суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10 МЕ)), что соответствовало 1,6109 м.к./мл для возбудителя бруцеллеза. Для обеззараживания проб к ним добавляли мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01 %), прогревали при 56 °с в течение 30 мин, с последующим смешиванием 100 мкл полученной суспензии с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДНК, и инкубированием 15 мин при температуре (65±1) °С. Выделение ДНК осуществляли с помощью наборов «АмплиПраймДНК-сорб В» («ООО ИнтерЛабСервис», Россия) и «PureLink™ Mini» (Invitrogen, США). Работу проводили в соответствии с инструкциями к препаратам.

Постановку ПЦР с системой AMOS-DEL осуществляли в соответствии с рекомендациями авторов [4] с некоторыми модификациями. Реакционная смесь содержала праймеры PBa, PBm, PBo, Del 569 концентрации 6 пМоль, праймер PIS711 - 25 пМоль, ионов Mg2+ - 1,5 мМоль, дНТФ - 0,2 мМоль, фермента SynTaq-ДНК полимеразы (ЗАО «Синтол») - 2 ед. Концентрация ДНК препаратов бруцелл была не менее 1 нг/мкл. Программа амплификации включала прогревание при: 95 °C - 10 мин; 30 циклов: 94 °C -30 с, 60 °C - 30 с, 72 °C - 2 мин; 72 °C - 5 мин.

Анализ с системой Bruce-Ladder проводили в соответствии с рекомендациями авторов [5]. Реакционная смесь содержала праймеры в концентрации бпМоль каждого, ионов Mg2+ - 3 мМоль, дНТФ - 0,2 мМоль, фермента SynTaq-ДНК полимеразы (ЗАО «Синтол») - 2 ед. Концентрация ДНК препаратов бруцелл была не менее 10 нг/мкл. Программа амплификации включала прогревание при: 95 °C - 5 мин; 25 циклов: 95 °C - 30 с, 64 °C -45 с, 72 °C - 3 мин; 72 °C - 10 мин.

Для определения биоваров B. suis использовали систему Suis-Ladder [6]. Реакционная смесь содержала праймеры в концентрации 6 пМоль каждого, ионов Mg2+ - 2 мМоль, дНТФ - 0,2 мМоль, фермента SynTaq-ДНК полимеразы (ЗАО «Синтол») - 1 ед. Концентрация ДНК препаратов бруцелл была не ме-

нее 1 нг/мкл. Программа амплификации включала прогревание при: 95 °C - 7 мин; 30 циклов: 95 °C -35 с, 63 °C - 45 с, 72 °C - 60 с.; 72 °C - 6 мин.

Проведение реакции с набором реагентов «ген Brucella - идентификация - РГФ» осуществляли в соответствии с инструкцией к препарату.

Постановку ПЦР с гибридизационно-флуорес-центным учетом результатов осуществляли на приборе RotorGeneQ («Qiagen», Германия), а с электрофоретической детекцией - на амплифи-каторе Mastercycler Nexus (Eppendorf, Германия). Электрофорез проводили в 2 % агарозном геле, в случае учета результатов, с системами Bruce-Laddem Suis-Laddem в 3 % агарозном геле NuSieve™ 3:1 (Lonza) при рестрикционном анализе. В качестве маркера молекулярных масс использовали GeneRuler Express DNA Ladder (Fermentas).

Рестрикцию проводили с использованием эндо-нуклеаз для ускоренного гидролиза ДНК: FastDigest AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV). Работу осуществляли в соответствии с инструкциями к препаратам.

Результаты и обсуждения

В основе системы AMOS-DEL лежит определение расположения в геноме патогена последовательности IS711 элемента. При ее использовании у культур, относящихся к B. abortus 1, 2-го и 4-го биоваров наблюдается образование ампликона размером 498 п.н., к B. abortus 3b 5, 6, 9-го биоваров -1700 п.н., к B. melitensis - 731 п.н, к B. ovis - 976 п.н., к B. suis 1-го биовара - 268 п.н. [4].

Система Bruce-Ladder направлена на амплификацию фрагментов генов wboA, bp26, omp31, eryC, участка нуклеотидной последовательности рибосо-мального белка rpsL гена, транскрипционного регулятора CRP, гена ABC Transporter в разной степени встречающихся у видов бруцелл. При выполнении анализа с помощью данного подхода для штаммов B. abortus характерно образование ампликонов размером 1682/794/587/450/152 п.н., B. melitensis 1682/1071/794/587/450/152 п.н., B. suis - 1682/1071/ 794/587/450/272/152 п.н., B. canis -1682/1071/587/4 50/272/152 п.н., B. ovis - 1071/794/587/450/152 п.н., B. neotomae - 1682/1071/578/450/272 п.н. [5].

Определение биоваров B. suis при использовании метода Suis-Ladder также основано на наличии амплификации фрагментов различного размера: B. suis биовар 1 - 774/425/197 п.н., B. suis биовар 2 -774/551/278 п.н., B. suis биовар 3 - 774/299/197 п.н., B. suis биовар 4 - 774/614/197 п.н., B. suis биовар 5 -774/614/278/197 п.н. [6]. С системой Suis-Ladder также возможна идентификация представителей вида B. canis по образованию ампликонов размером 614 и 197 п.н., вида B. microti - 774 и 197 п.н.

Для проведения рестрикционного анализа нами были взяты ферменты, оказавшиеся, по данным A.Cloeckaert et al. [3], наиболее информативными для видовой дифференциации штаммов бруцелл EcoRV,

EcoRI, AluI. Для штаммов B. ovis характерен уникальный профиль рестрикции фрагмента локусов omp25 с помощью фермента EcoRV, omp2a и omp2b - AluI. Культуры B. neotomae имеют специфичный только для них профиль рестрикции фрагмента гена omp2a ферментом AluI, B. abortus 1, 2, 4-го биоваров - гена omp2a ферментами EcoRI и AluI. Фрагмент локуса omp25 у штаммов B. melitensis не подвергается гидролизу рестриктазой EcoRV.

Для оценки эффективности выбранных ам-плификационных и рестрикционных подходов при идентификации штаммов бруцелл на первом этапе нашей работы были исследованы типовые штаммы B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis и B. neotomae с учетом биоварной принадлежности. Поскольку в коллекции не было типового штамма B. ovis, для анализа выбрано несколько природных штаммов данного вида.

практически все проанализированные штаммы показали результаты, характерные для своего вида и биовара, что в полной мере подтверждает их таксономическое положение, указанное в паспорте (табл. 1).

Однако при исследовании культуры B. abortus 292 не подтверждена ее принадлежность к 4-му биовару данного вида. На это указывают полученные профили рестрикции фрагмента гена omp2a ферментами EcoRI и AluI и данные анализа с системой AMOS-DEL. Штамм B. abortus 63/75 7 биовара, который ранее не был изучен с помощью способа AMOS-DEL [4], имел амплификационный профиль, характерный для B. abortus 3b, 5, 6, 9-го биоваров. Помимо этого, культура B. ovis 2000 идентифицирована как B. abortus 3b, 5, 6, 9-го биоваров. Принадлежность к виду B. abortus подтверждают результаты всех использованных амплификационных и рестрикци-онных технологий. В то же время таксономическое положение взятых для исследования культур B. ovis 25-90 и И-107 не вызывает сомнения. При изучении штаммов B. suis 1330, Thomsen, 686, 40, 513 с помощью системы Suis-ladder в полной мере подтверждена их биоварная принадлежность: 1, 2, 3, 4-й и 5-й биовар соответственно.

основываясь на полученных результатах, мы продолжили исследования на 48 природных штаммах бруцелл из фонда коллекции, выделенных в 1932-2014 гг. из различных источников. Результаты анализа представлены в табл. 2.

из 10 исследованных штаммов B. abortus, по данным всех использованных подходов, 6 изолятов (A-81, С-442, 1271,164-70, И-199, 1552) идентифицированы как B. abortus 3b, 5 6-го и 9-го биоваров, и один (339) как B. melitensis.

У штамма B. abortus 290 в ПЦР с системой AMOS-DEL наблюдалось образование двух фрагментов 1700 и 498 п.н., характерных разных био-варов B. abortus 3b, 5, 6, 9-го и 1, 2, 4-го биоваров соответственно. в профиле амплификации с системой Bruce-Ladder у культуры B. abortus 3143-П от-

Таблица 1

результаты идентификации типовых штаммов разных видов бруцелл с использованием амплификационных систем

и рестрикционного анализа

Название штамма, таксономическое положение в соответствии с паспортом Результаты исследования Результаты идентификации на основании проведенного анализа

Амплификационные системы Рестрикция

Набор реагентов «Brucella- идентификация - РГФ» AMOS-Del- Bruce-ladder Suis-Ladder EcoRV/ omp25 EcoRI/ omp2a AluI/ omp2a AluI/ omp2b

B. abortus 544 ATCC 23448 1 bv B. abortus / B. ovis B. abortus (1, 2, 4 bv) B. abortus н/и P1 P1 P1 P1 B. abortus (1, 2, 4 bv)

B. abortus Tulya ATCC 23450 3 bv B. abortus B-3196 ATCC 23452 5 bv B. abortus 870 ATCC 23453 6 bv B. abortus C-68 ATCC 23455 9 bv B. abortus / B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. abortus 292 ATCC 23451 4 bv B. abortus / B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. abortus 63/75 ATCC 23454 7 bv B. abortus / B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. melitensis 16M ATCC 23456 1 bv B. melitensis 63/9 ATCC 234579 2 bv B. melitensis 706 ATCC 234593 3 bv B. melitensis B. melitensis B. melitensis н/и NR P2 P2 P1 B. melitensis

B. suis 1330 ATCC 23444 1 bv B. suis / B. canis B. suis 1 bv B. suis 1 bv P1 P2 P2 P1 B. suis 1 bv

B. suis Thomsen ATCC 23445 2 bv B. suis / B. canis NEG B. suis 2 bv P1 P2 P2 P1 B. suis 2 bv

B. suis 686 ATCC 23446 3 bv B. suis / B. canis NEG B. suis 3 bv P1 P2 P2 P1 B. suis 3 bv

B. suis 40 ATCC 23447 4 bv B. suis / B. canis NEG B. suis 4 bv P1 P2 P2 P1 B. suis 4 bv

B. suis 513 BCCN R21 5 bv B. suis / B. canis NEG B. suis 5 bv P1 P2 P2 P1 B. suis 5 bv

B. canis RM 6/66 ATCC 23365 B. suis / B. canis NEG B. canis B. canis P1 P2 P2 P1 B. canis

B. neotomae 5k33 ATCC 23459 B. neotomae NEG B. neotomae н/и P1 P2 P4 P1 B. neotomae

B. ovis 2000 B. abortus / B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. ovis 25-90, И-107 B. abortus / B. ovis B. ovis B. ovis н/и P2 P2 P3 P2 B. ovis

сутствовал фрагмент размером 1682 п.н., который должен амплифицироваться у представителей данного вида. Несмотря на атипичные результаты по одному из использованных методов, по совокупности результатов данные штаммы все же относятся к виду B. abortus, но имеют некоторые генетические перестройки.

Особый интерес представляют результаты идентификации штамма B. abortus C-549, выделенного от мышевидных грызунов в Австралии в 1980 г. При исследовании с помощью набора реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ» получен новый профиль амплификации (BRA0541+, BR0262 BMEII0711), который не соответствовал ни одному из характерных для видов или групп видов бруцелл B. abortus/B. ovis (BRA0541+, BR0262BMEII0711+); B. melitensis (BRA0541, BR0262BMEII0711+); B. suis/B. canis (BRA0541+, BR0262+, BMEII0711+); B. neotomae (BRA0541+, BR0262+, BMEII0711). Другая картина амплификации наблюдалась и при использовании системы Bruce-Ladder - отсутствовал фрагмент размером 1682 п.н. Помимо этого, для данного штамма характерны уникальные профили рестрикции участков генов omp2a и omp2b ферментом AluI (рисунок), тогда как результаты рестрик-

ции omp25, omp2a локусов рестриктазами EcoRV и EcoRI, соответственно, идентичны таковым для ряда видов бруцелл. Все это указывает на то, что штамм B. abortus C-549 относится к роду Brucella spp., но определить его видовую принадлежность не представляется возможным. Очевидна необходимость дальнейшего изучения данного изолята, в том числе с использованием полногеномного секвенирования.

Полученные нами результаты согласуются и дополняют данные R.T.Tiller et al. [7], которые установили, что штаммы возбудителя бруцеллеза, выделенные от грызунов в 1980-е годы на территории Австралии, отличаются по ряду фенотипических и генетических признаков от известных видов бруцелл. Филогенетический анализ, проведенный авторами на основании нуклеотидной последовательности генов 16S рДНК, recA, rpoB и 15 VNTR-локусов, показал, что эти культуры имели схожесть со штаммом B. in-opinata BO1, атипичным изолятом Brucella BO2, но образовывали отдельную самостоятельную ветку.

Из 14 исследованных изолятов B. melitensis для 11 (И-328, М-117, М-97, С563-С570) подтверждена их принадлежность к виду, указанному в паспорте. в то же время штамм B. melitensis 286 идентифицирован как B. suis, B. melitensis C-482 как B. abortus,

Таблица 2

результаты идентификации природных штаммов бруцелл с использованием амплификационных систем

и рестрикционного анализа

Название штамма, таксономическое положение в соответствии с паспортом Результаты исследования Результаты идентификации на основании проведенного анализа

Амплификационные системы Рестрикция

Набор реагентов «Brucella- идентификация - РГФ» AMOS-Del- Bruce-ladder Suis-Ladder EcoRV/ omp25 EcoRI/ omp2a AluI/ omp2a AluI/ omp2b

B. abortus A-81, С-442, 1271, 164-70, И-199, 1552 B. abortus / B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. abortus 290 B. abortus /B. ovis н/иден B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus

B. abortus 3143-П B. abortus /B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) H/ugeH н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus

B. abortus C-549 н/иден NEG H/ugeH н/и P1 P2 P P Brucella spp.

B. abortus 339 B. melitensis B. melitensis B. melitensis н/и NR P2 P2 P1 B. melitensis

B. melitensis И-328, M-117, M-97, C563-C570 B. melitensis B. melitensis B. melitensis н/и NR P2 P2 P1 B. melitensis

B. melitensis 286 B. suis /B. canis B. suis 1 bv B. suis P1 P2 P2 P1 B. suis 1 bv

B. melitensis C-482 B. abortus /B. ovis B. abortus (1, 2, 4 bv) B. abortus н/и P1 P1 P1 P1 B. abortus (1, 2, 4 bv)

B. melitensis M-114 B. abortus /B. ovis B. ovis B. ovis н/и P2 P2 P3 P2 B. ovis

B. suis 31, 61, 6, И-100 B. suis /B. canis B. suis 1bv B. suis bv1 P1 P2 P2 P1 B. suis 1 bv

B. suis И-99 B. suis /B. canis NEG B. suis bv2 P1 P2 P2 P1 B. suis 2 bv

B. suis 214/23 B. suis /B. canis NEG B. suis bv4 P1 P2 P2 P1 B. suis 4 bv

B. suis C-445 B. suis /B. canis NEG B. suis bv5 P1 P2 P2 P1 B. suis 5 bv

B. suis C-450, C-451 B. suis /B. canis NEG B. suis н/иден P1 P2 P2 P1 B. suis

B. ovis 440, 25-90, И-107 B. abortus /B. ovis B. ovis B. ovis н/и P2 P2 P3 P2 B. ovis

B. ovis 64/1, 390-90, 10/2, 83-89, 2000 B. abortus/B. ovis B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv) B. abortus н/и P1 P2 P2 P1 B. abortus (3b, 5, 6, 9 bv)

B. ovis 830 B. melitensis B. melitensis B. melitensis н/и NR P2 P2 P1 B. melitensis

B. ovis 712 B. suis /B. canis NEG B. suis bv5 P1 P2 P2 P1 B. suis 5 bv

B. canis 666, 1066 B. suis /B. canis NEG B. canis B. canis P1 P2 P2 P1 B. canis

B. canis H-966 B. suis /B. canis NEG B. suis bv4 P1 P2 P2 P1 B. suis 4 bv

B. neotomae 65/168, 66/2 B. neotomae NEG B. neotomae н/и P1 P2 P4 P1 B. neotomae

Примечания: н/иден - идентификация бруцелл не возможна, н/и - не исследуется, NEG - отсутствие амплификации, NR- нет рестрикции.

B. melitensis M-114 как B. ovis.

Таксономическое положение девяти изученных штаммов B. suis, определенное с помощью амплификационных и рестрикционных технологий, полностью совпало с паспортными данными. Особый интерес представляют результаты анализа культур B. suis C-450 и С-451, выделенных от лесных мышей в 1990 г., с помощью системы Suis-Ladder. У этих штаммов профиль амплификации составил 774/488/278/197 п.н., и он не соответствовал ни одному из указанных I.Lorpez-Goni et al. [6]. Наиболее близким профилем к полученному обладали штаммы B. suis 5-го биовара: 774/614/278/197 п.н. Авторами в

качестве ДНК-мишени для дифференциации биова-ров B. suis предложено использовать участок Bruce 11, содержащий вариабельные тандемные повторы (VNTR). Поэтому в ПЦР у биоваров наблюдается образование ампликонов разного размера: биовар 1425 п.н. (6 повторов), биовар 2 - 551 п.н. (8 повторов), биовар 3 - 299 п.н. (4 повтора), биовар 4 и 5 -614 п.н. (9 повторов). У изученных штаммов B. suis C-450 и С-451 выявлена амплификация 7 повторов (488 п.н.). Полученные результаты указывают на необходимость расширения спектра изученных штаммов данного вида с похожим источником выделения для решения вопроса о дополнении схемы интерпре-

Результаты рестрикции omp2b (A) и omp2a (Б) ферментом AluI у штаммов бруцелл:

1 - B. abortus C-549; 2 - B. abortus 3143-П; 5 -B. abortus 1552; 4 - B. canis 1066; 5 - B. canis H-966; 6 - B. canis 6/66; 7 - B. ovis 440; 8 - B. ovis 712; 9 -B. neotomae 65/168; 10 - B. neotomae 66/2

тации результатов системы Suis-Ladder.

Из 10 штаммов B. ovis на основании проведенного анализа только три (440, 25-90, И-107) принадлежали данному виду, пять (64/1, 390-90, 10/2, 83-89, 2000) идентифицированы как B. abortus, один штамм (830) как B. melitensis и одна культура (712) - B. suis 5-го биовара. Результаты исследования, полученные с использованием разных амплификационных систем и рестрикционного анализа фрагментов omp25, omp2a и omp2b генов с помощью ферментов EcoRV и AluI, полностью совпадали.

При изучении трех штаммов B. canis для двух из них (666, 1066) подтверждено таксономические положении в соответствии с паспортными данными, тогда как последний (Н-966) являлся B. suis 4-го биовара. Оба штамма B. neotomae 65/168, 66/2 принадлежали к виду, указанному в паспорте.

Таким образом, применение комплекса ампли-фикационных методов и тест-систем («Ген Brucella -идентификация - РГФ» или аналог, AMOS-DEL, Bruce-Ladder, Suis-Ladder) и рестрикционного анализа omp25, omp2a, omp2b локусов с помощью ферментов AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV) является эффективным подходом для определения видовой и, в ряде случаев, биоварной принадлежности бруцелл. Полученные результаты указывают на перспективность продолжения работы по уточнению видовой принадлежности штаммов, хранящихся в фонде Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», а также на целесообразность совершенствования способов определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза с помощью по-лимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени.

конфликт интересов. Aвторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

ШИШК ЛИТEРAТУРЫ

1. Касьян ЖА., Осина H.A., Касьян ИА., Шарова И.Н., Казакова E.C. Aнробация нового генодиагностического нренара-та при исследовании проб биологического материала на наличие возбудителя бруцеллеза. ЗНИСО. 2016; 4(277):48.

2. Bricker B.J., Halling S.M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4 Brucella melitensis, Brucella ovis and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiology. 1994; 32:2660-6.

3. Cloeckaert A, Verger J-M, Grayon M., Grepinet O. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36kDa outer-membrane proteins of Brucella. Microbiology.

1995; 141:2111-21.

4. Ica T., Aydin F., Gümüssoy K.S., Perjin D., Sümerkan A.B., Ocak F., Abay S., Dogan H.O., Findik A., Qiftci A. Conventional and molecular biotyping of Brucella strains isolated from cattle, sheep and human. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 2012; 59:259-64.

5. Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckeart A., Ferreira A.C., Carloso R., Correa de Sa, M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46:3484-7. DOI: 10.1128/ JCM.00837-08.

6. Lorpez-Goni I., Garcira-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzmar n-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154:152-5. DOI: 10.1016/j. vetmic.2011.06.035.

7. Tiller R.V., Gee J.E., Frace M.A., Taylor T.K., Setubal J.C., Hoffmaster A.R., De B.K. Characterization of novel Brucella strains originating from wild native rodent species in North Queensland, Australia. Appl. Enviroment. Microbiol 2010; 76:5837-45. DOI: 10.1128/AEM.00620-10.

References

1. Kas'yan Zh.A., Osina N.A., Kas'yan I.A., Sharova I.N., Kazakova

E.S. [Validation of new gene-diagnostic preparation in tests of biological material samples for the presence of brucellosis agent]. Zdor. Naselen. Sreda Obit. 2016; 4(277): 48.

2. Bricker B.J., Halling S.M. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4 Brucella melitensis, Brucella ovis and Brucella suis bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiology. 1994; 32:2660-6.

3. Cloeckaert A, Verger J.-M, Grayon M., Grepinet O. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36kDa outermembrane proteins of Brucella. Microbiology. 1995; 141:2111-21.

4. Ica T., Aydin F., Gümüssoy K.S., Perjin D., Sümerkan A.B., Ocak

F., Abay S., Dogan H.O., Findik A., Ciftci A. Conventional and molecular biotyping of Brucella strains isolated from cattle, sheep and human. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 2012; 59:259-64.

5. Lopez-Goni I., Garcia-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Munoz P.M., Blasco J.M., Jacques I., Grayon M., Cloeckeart A., Ferreira A.C., Carloso R., Correa de Sa, M.I., Walravens K., Albert D., Garin-Bastuji B. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species including the vaccine strains. J. Clin. Microbiol. 2008; 46:3484-7. DOI: 10.1128/JCM.00837-08.

6. Lorpez-Goni I., Garcira-Yoldi D., Martin C.M., Miguel M.J., Barquero-Calvo E., Guzmar n-Verri C., Albert D., Garin-Bastuji B. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis. Vet. Microbiol. 2011; 154:152-5. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035.

7. Tiller R.V., Gee J.E., Frace M.A., Taylor T.K., Setubal J.C., Hoffmaster A.R., De B.K. Characterization of novel Brucella strains originating from wild native rodent species in North Queensland, Australia. Appl. Enviroment. Microbiol. 2010; 76:5837-45. DOI: 10.1128/AEM.00620-10.

Authors:

Osina N.A., Kas'yan Zh.A., Kas'yan I.A., Lyashova O.Yu., Osin A.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru

об авторах:

Осина Н.А., Касьян Ж.А., Касьян И.А., Ляшова О.Ю., Осин А.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005,Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Поступила 29.07.16.