CC BY-ND
22
40
ЗНиСО
лпрель IM (277)
УДК 616.98.579.841.93
АПРОБАЦИЯ НОВОГО ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ПРОБ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА НАЛИЧИЕ
ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА
Ж.А. Касьян, Н.А. Осина, И.А. Касьян, И.Н. Шарова, Е.С. Казакова
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"»
Роспотребнадзора, г. Саратов, Россия
Установлена эффективность применения набора реагентов «Ген Вгисе11а-идентификация-РГФ» для выявления и дифференциации видов бруцелл в пробах биологического материала от крупного и мелкого рогатого скота. Показана перспективность использования комплекса генодиагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителя бруцеллеза. Ключевые слова: ДНК, ПЦР, бруцеллы, идентификация видов.
Zh.A. Kasian, N.A. Osina, I.A. Kasian, I.N. Sharova, E.S. Kazakova □ VALIDATION OF NOVEL GENE-DIAGNOSTIC PREPARATION IN THE COURSE OF BIOLOGICAL MATERIAL TESTING ON THE PRESENCE OF BRU-CELLOSIS AGENT □ Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of Rospotrebnadzor, Saratov, Russia.
Determined is the effectiveness of application of a reagent panel «Gene Brucella-Identi-fication-Real Time PCR with Hybridization Fluorescent Registration of Results (HFR)» for the detec-tion and differentiation of Brucella species in biological material samples, obtained from bovine cattle and small ruminants. Demonstrated are the usage prospects for the complex of gene-diagnostic preparations in identification and indication of brucellosis agent. Key words: DNA, PCR, Brucella, identification of species.
Бруцеллез является особо опасной зооан-тропонозной инфекционной болезнью, распространенной во многих странах мира: Африке. Центральной и Южной Америке, некоторых странах Азии и Европы и наносящей вред здоровью людей и значительный экономический ущерб животноводству. В 2012 г. на территории Российской Федерации было зарегистрировано 465 случаев заболеваний людей с впервые выявленным бруцеллезом, 2013 г. - 341, в 2014 г. - 368 случаев. Большая часть больных бруцеллезом (93,4 %) сосредоточена в субъектах Северо-Кавказского, Южного и Сибирского федеральных округов [4]. Основным источником и резервуаром инфекции служит крупный и мелкий рогатый скот. Заражение людей наиболее часто происходит при употреблении в пищу непастеризованных молочных продуктов, а также при попадании возбудителя через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Поэтому с целью профилактики бруцеллеза людей необходим постоянный мониторинг этой болезни среди сельскохозяйственных животных на эндемичных территориях.
Одним из перспективных подходов для выявления и ускоренной идентификации бруцелл является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет выявлять возбудителя бруцеллеза в пробах клинического материала, биологическом материале от животных, из объектов окружающей среды, продовольственном сырье и пищевых продуктах. На сегодняшний день разработаны и внедрены в практику наборы реагентов «ГенБру» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора) и «АмплиСенс Brucella spp.-FL» (ООО ИнтерЛабСервис), которые обеспечивают выявление патогена в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды. Однако оба препарата используются для выявления бруцелл без определения их видовой
принадлежности. Идентификация видов бруцелл в соответствии с действующими нормативными правовыми документами включает в себя определение следующих параметров: отношение к избыточному содержанию углекислоты в атмосфере воздуха; продукция сероводорода; способность редуцировать основные красители (фуксин и тио-нин); агглютинация моноспецифическими сыворотками anti-abortus и anti-melitensis; лизис бруцеллезным диагностическим бактериофагом Тб [1]. Выполнение таких исследований трудоемко и продолжительно. Поэтому остается актуальной разработка способов детекции и видовой идеен-тификации бруцелл в клиническом материале.
Ранее нами был разработан и зарегистрирован набор реагентов «Ген Brucella-идентифика-ция-РГФ», который позволяет определить принадлежность бруцелл к видам B. abortus/B. ovis, B. melitensis, B. suis/B. canis, B. neotomae методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени на основании выявления видоспецифичных генетических локусов. Препарат предназначен для исследования культур патогена. В то же время представляет интерес получение данных об эффективности данного набора реагентов при исследовании клинического материала от человека и биологического материала от животных, а также изучение возможности проведения комплексного исследования с использованием всего спектра зарегистрированных препаратов для молекулярной диагностики бруцеллеза.
Цель работы - оценка эффективности использования набора реагентов «Ген Brucella-идентификация-РГФ» при исследовании биологического материала от животных.
Материалы и методы исследований. Материал для исследования был доставлен из хозяйств, расположенных на неблагополучных по бруцеллезу территориях районов Саратовской
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
49
^зс области. Всего была исследована 101 проба биологического материала от мелкого и крупен ного рогатого скота, серопозитивного на бру-еэ целлез: суспензии печени, селезенки, легких, лимфатических узлов, маток с плодами, околоплодная жидкость.
Подготовку проб проводили согласно МУ ^ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенно-сти» [2]. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора «ДНК-Сорб В» (ИЛС, Москва). Постановку ПЦР проводили с использованием наборов реагентов «ГенБру» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»), «АмплиСенс Brucella spp.-FL» (ООО ИнтерЛабСервис), «Ген Brucella—идентифика-ция-РГФ» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») в соответствии с инструкциями по применению. Амплификацию осуществляли с применением термоциклеров Терцик МС-2 (ДНК-технология, Россия), RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия). Дополнительно для дифференцирования B. abortus использовали праймеры и олиго-нуклеотидный зонд формата TaqMan, комплементарные фрагменту гена BRA0420, последовательность которого отсутствует у штаммов данного вида. Для проведения исследований готовили реакционную смесь, содержащую праймеры в количестве не менее 8 пМоль, зонд — 4 пМоль, ионы Mg2+ — 2,5 мМоль, дНТФ — 0,2 мМоль. Амплификацию осуществляли по той же программе, что и при использовании набора реагентов «Ген Brucella—идентификация—РГФ».
Одновременно с ПЦР все пробы были исследованы бактериологическим методом, а часть из них дополнительно серологическим и биологическим методами.
Результаты исследований. На первом этапе работы все пробы были исследованы с помощью наборов реагентов «ГенБру» и «АмплиСенс Brucella spp.-FL», направленных на детекцию ДНК Brucella spp. на основании выявления родоспецифичных генов bcsp3l и wboA. Из 101 изученной пробы ДНК возбудителя бруцеллеза обнаружена в 38 образцах: 14 суспензий лимфатических узлов, 6 суспензий маток, 6 проб околоплодной жидкости, 8 суспензий печени, 4 суспензии селезенки (табл.). В наибольшем проценте случаев бруцеллы выявлены в околоплодной жидкости — 85,7. Удельный вес обнаружения ДНК патогена в образцах печени, лимфатических узлов, матки, селезенки колебался от 44,4 до 28,6 %.
При исследовании положительных по наличию ДНК бруцелл образцов с помощью набора реагентов «Ген Brucella—идентификация—РГФ» в 86,8 % случаев (33 пробы) зарегистрирована специфическая амплификация, характерная для штаммов B. abortus/B. ovis. В ходе дальнейшего исследования этих проб в ПЦР с праймерами и зондом на основе гена BRA0420 во всех случаях был получен отрицательный результат, что указывает на наличие в исследуемых пробах ДНК B. abortus, поскольку у штаммов данного вида обозначенный генетический локус отсутствует. Отсутствие амплификации с препаратом «Ген Brucella—идентификация—РГФ» при исследовании 5 образцов (1 суспензия печени, 3 суспензии селезенки, 1 суспензия матки), в которых при использовании предыдущих наборов была обнаружена ДНК бруцелл, возможно связано с тем, что в данных пробах концентрация возбудителя была ниже диагностической и аналити4ческой чувствительности тест-системы — 1 х 104 м.к./мл.
Таблица. Результаты исследования биологического материала на наличие возбудителя бруцеллеза методом ПЦР и бактериологическим методом
Материал для исследования Кол-во исследованных проб Положительные результаты исследования с использованием наборов реагентов, абс. Положительные результаты при использовании бактериологического метода
«ГенБру» «АмплиСенсВга cella spp.-FL» «Ген Brucella— идентификация— РГФ» праймеры и зонд к BRA0420
Эмбрион 1 0 0 0 0 0
Легкие 2 0 0 0 0 0
Сердце 2 0 0 0 0 0
Печень 18 8 8 7/ B. abortus/B. ovis* 7/ B. abortus 3/ B. abortus
Селезенка 14 4 4 1/ B. abortus/B. ovis 1/ B. abortus 2/ B. abortus
Лимфатические узлы 39 14 14 14/ B. abortus/B. ovis 14/ B. abortus 4/ B. abortus
Матка 18 6 6 5/ B. abortus/B. ovis 5/ B. abortus 1/ B. abortus
Околоплодная жидкость 7 6 6 6/ B. abortus/B. ovis 6/ B. abortus 4/ B. abortus
Итого 101 38 38 33/ B. abortus/B. ovis 33/ B. abortus 14/ B. abortus
* Через дробь указана видовая принадлежность бруцелл
50
ЗНиСО
•Ш, №4 (277)
При исследовании с помощью препарата «Ген Brucella-идентификация-РГФ» проб, в которых ДНК бруцелл не была выявлена, во всех случаях получен отрицательный результат, что свидетельствует о специфичности использованного набора реагентов.
Одновременно все пробы биоматериала были исследованы бактериологическим методом, а часть проб дополнительно биологическим методом путем заражения биопробных животных (белые мыши) в соответствии с действующими методическими указаниями [3]. Из 101 исследуемой пробы культура возбудителя бруцеллеза была выделена в 14 случаях (14 %): 4 суспензии лимфатических узлов, 1 суспензия матки, 3 суспензии печени, 2 суспензии селезенки, 4 пробы околоплодной жидкости. Процент выделения патогена из разного материала колебался от 57,1 при анализе проб околоплодной жидкости до 5,5 - при анализе проб суспензий матки.
С помощью ряда дифференциальных тестов - отношение к росту в присутствии CO2, продукция сероводорода, устойчивость к фуксину и тионину, агглютинация монорецепторными сыворотками anti-abortus и anti-melitensis — подтверждена принадлежность выделенных культур к виду B. bortus.
Полученные результаты по эффективности использования молекулярно-генетических методов для выявления и определения видовой принадлежности бруцелл в пробах клинического и биологического материалов в полной мере согласуются с данными зарубежных исследователей [5, 7]. При исследовании 25 проб сывороток крови от крупного и мелкого рогатого скота с клиническими проявлениями бруцеллеза в Египте с помощью ПЦР выявили наличие во всех пробах ДНК Brucella spp., из которых в 24 возбудитель бруцеллеза идентифицирован как B. abortus, а в 1 - как B. melitensis (G. Wareth et al., 2015). Авторы для проведения анализа использовали праймеры и зонды на основе ро-доспецифичного гена bcsp31 и локуса, содержащего IS711 и имеющего отличия у B. abortus и B. melitensis, предложенные Probert W.S. et al. [6]. При бактериологическом исследовании выделить культуру возбудителя ни в одном случае не удалось. Помимо этого, в Иране проведено исследование 180 сывороток крови от пациентов с подозрением на бруцеллез, из которых в 128 выявлено наличие ДНК Brucella spp. (M. Garshasbi et al., 2014). Из них в 115 пробах бруцеллы относились к виду B. abortus, в 8 - к виду B. melitensis. Для анализа авторы также, как и в работе G. Wareth et al., применяли праймеры на основе фрагментов гена bcsp31 и локуса, содержащего IS711 и отличающегося у видов бруцелл.
Однако использованный авторами подход имеет некоторые ограничения, поскольку у ряда видов и биоваров бруцелл (B. suis 2-5 биова-ры, B. canis, B. neotomae) амплификация вариабельных участков с IS711 может отсутствовать [8]. M. Weiner et al., 2009 получили отри- +
цательный результат в ПЦР с праймерами на ^с вариабельный участок IS711 при исследовании ^^ проб суспензий лимфатических узлов диких кабанов, в которых ранее была выявлена ДНК сэ бруцелл. При бактериологическом анализе из ^ данных проб авторам удалось выделить куль- ^j} туры B. suis 2-го биовара. Кроме того, эффек- ^ тивность такого подхода была изучена только при исследовании проб сывороток крови человека и животных, тогда как данные по анализу других видов клинического и биологического материала отсутствуют.
Вывод. Таким образом, нами установлена эффективность применения набора реагентов «Ген Brucella—идентификация-РГФ» для выявления и идентификации бруцелл в пробах биологического материала от животных. Установлена перспективность использования комплекса генодиагностических препаратов, направленных на выявление родо- и видоспецифич-ных локусов, при проведении мониторинга на эндемичных по бруцеллезу территориях с целью быстрого выявления ДНК бруцелл и определения их видовой принадлежности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под ред. академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Ку-тырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. М.: ЗАО «Шико», 2013. 555 с.
2. Методические указания по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: МУ 1.3.2569-09. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 51 с.
3. Методические указания по порядку организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: МУ 4.2.3010-12. Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013. 67 с.
4. Эпизоотическая ситуация в РФ. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://fsvps.ru/fsvps/ iac/rf/reports.html (дата обращения 20.12.2015).
5. Garshasbi M. et al. Molecular detection of Brucella species in patients suspicious of Brucellosis from Zanjan, Iran / M. Garshasbi, A. Ramazani [et al.] // J. Microbiol. 2014. 45(2).533-8.
6. Probert W.S. et al. Real-Time Multiplex PCR Assay for Detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis / William S. Probert, N. Kimmi Schrader [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2004. 42(3). Р. 1290-1293.
7. Wareth G. et al. Detection of Brucella abortus DNA in aborted goats and sheep in Egypt by real-time PCR / G. Wareth, F.Melzer [et al.] // BMC Res. Notes. 2015. 8. 212.
8. Weiner M. et al. Identification of brucella DNA in lymph tissue from deer (Cervus elaphus) and wild boars (Sus scrofa) by the use of bcsp31 PCR and AMOS-PCR / M. Weiner, W. Iwaniak, K. Szulowski // Bull Vet Inst Pulawy. 2009. 53. Р. 609-612.
Контактная информация:
Касьян Жанетта Андреевна, тел. : +7 (8452) 51-52-11, +7 (937) 223-33-31, e-mail: kas.ja2na@rambler.ru, rusrapi@microbe.ru Contact information: Kasian Zhanetta,
phone: +7 (8452) 51-52-11, +7 (937) 223-33-31,
e-mail: kas.ja2na@rambler.ru, rusrapi@microbe.ru + -
