CC BY
13
УДК 616.981.42
А.Н.Малахаева1, Л.В.Саяпина1, И.С.Барулина1, И.В.Касина1, А.С.Абдрашитова1, Н.А.Осина2, И.Н.Шарова2, С.Б.Яцышина3, Н.В.Майоров2, Л.В.Зайцева2, Н.П.Миронова2
ОЦЕНКА НОВОГО НАБОРА РЕАГЕНТОВ «АМПЛИСЕНС® BRUCELLA SPP.-FL»
С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
1 Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича, Москва;
2Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Москва
В ФГУН «ЦНИИЭ» и ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработан набор реагентов для выявления ДНК бактерий Brucella spp. в биологическом материале и культурах микроорганизмов методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. В медицинских испытаниях в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича изучена диагностическая ценность набора реагентов «АмплиСенс® Brucella spp.-FL», который выпускается в двух вариантах в зависимости от способа учета результатов (FRT - в режиме «реального времени» и FEP - по «конечной точке»). На основании полученных результатов установлена высокая диагностическая ценность набора реагентов «АмплиСенс® Brucella spp. -FL». Набор зарегистрирован в качестве изделия медицинского назначения.
Ключевые слова: бруцеллез, Brucella spp., ПЦР, гибридизационно-флуоресцентный учет результатов, специфическая активность, специфичность, воспроизводимость.
A.N.MalakhaevaS L.V.Sayapina1, LS.Barulina1, I.V.Kasina1, A.S.Abdrashitova1, N.A.Osina2, LN.Sharova2, S.B.Yatsyshina3, N.V.Mayorov2, L.V.Zaytseva2, N.P.Mironova2
Assessment of the New Set of Reagents “AmpliSens ® BRUCELLA SPP.-FL” with Hybridization-Fluorescent Detection
'L.A.Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations, Moscow; 2Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov;3Central Research Institute of Epidemiology, Moscow
At CRIE, Moscow and RRAPI “Microbe” designed is the set of reagents for detection of Brucella spp. DNA in biological materials and cultures of microorganisms by means of PCR with hybridization-fluorescent registration of the results. This reagent set, “AmpliSens ® Brrucella spp.-FL”, is supplied in two modifications versus the mechanism of the results registration (FRT - real time and FEP - end-point). High diagnostic value of the reagent set is determined in medical trials at L.A. Tarasevich Institute. The set is registered as medical device.
Key words: brucellosis, Brucella spp., PCR, hybridization-fluorescent registration of the results, specific activity, specificity, reproducibility.
До настоящего времени бруцеллез остается одним из зоонозов, причиняющих значительный экономический и социальный ущерб [3]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), заболевания бруцеллезом регистрируются среди населения 73 стран мира [4]. В Европе более всего бруцеллезом поражено население стран Средиземноморья, однако ряд стран полностью свободен от этой инфекции (Дания и др.). В России наиболее неблагополучны в отношении бруцеллеза среди людей являются регионы с развитым овцеводством (Тыва, Северный Кавказ и Южное Поволжье) [1]. В мире также отмечается неравномерность распространения бруцеллеза как среди животных, так и среди людей. Высока заболеваемость в странах Америки, Латинской Америки, в Казахстане. Средней Азии. В начале 90-х годов прошлого столетия произошло ухудшение эпизоотической ситуации по бруцеллезу, связанное с крупными закупками овцепоголовья без соблюдения карантинных мероприятий в хозяйствах, неблагополучных по бруцеллезу. В последние годы заболеваемость бру-
целлезом не снижается, что является следствием ослабления внимания к этой проблеме.
Человек заражается бруцеллезом в основном от мелкого и крупного рогатого скота, свиней, редко - от северных оленей. В 60 % случаев источником заболевания людей бруцеллезом служит мелкий рогатый скот, вследствие облигатной патогенности для человека В. melitensis. В системе эпидемиологического надзора за бруцеллезом основная роль отводится лабораторной диагностике. В соответствии с Методическими указаниями (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» при исследовании биологического материала, продуктов питания и объектов внешней среды на зараженность возбудителем бруцеллеза используют бактериологический анализ и комплекс серологических реакций, основанных на выявлении специфических антител (реакции агглютинации Хеддлсона и Райта, Кумбса, связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ). Бактериологический метод лабораторной диагностики бруцеллеза считается самым достовер-
ДИАГНОСТИКА
ным, однако он требует длительного времени.
В настоящее время для индикации бруцеллеза используется «Тест-система для выявления ДНК Brucella spp. методом ПЦР (ГенБру)», производства РосНИПЧИ «Микроб», основанная на амплификации фрагмента гена, кодирующего белок внешней мембраны бруцелл 31 кДа. Для учета результатов предусмотрено использование метода электрофореза в агарозном геле. При практическом использовании тест-системы выявлен ряд таких недостатков, как трудоемкость и длительность проведения анализа из-за двустадийности постановки ПЦР, отсутствие системы внутреннего контроля, что способствует возможности появления ложноотрицательных результатов.
В связи с вышеизложенным, специалисты ФГУН ЦНИИ эпидемиологии и ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработали набор реагентов для выявления ДНК бактерий Brucella spp. в биологическом материале и культурах микроорганизмов методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, в основе которого лежит амплификация фрагмента wbo A гена бруцелл с регистрацией реакции по накоплению в пробирке флуоресцентного сигнала. С целью предотвращения получения ложноотрицательных результатов в тест-систему введен внутренний контрольный образец (ВКО), амплификация которого осуществляется одновременно с исследуемыми пробами. Использование такого контроля обеспечивает возможность учета эффективности проведения всех этапов ПЦР-анализа: выделение ДНК, постановка ПЦР, учет результатов, что в значительной степени повышает точность генодиагностических исследований.
Набор «АмплиСенс® Brucella spp. -FL» выпускается в двух вариантах: первый - «ПЦР -комплект» вариант FRT, предназначенный для ПЦР-ампли-фикации ДНК микроорганизмов рода Brucella spp. с детекцией в режиме «реального времени», второй - «ПЦР-комплект» вариант FEP, используемый для ПЦР-амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella spp. с детекцией по «конечной точке». Для выделения ДНК используется набор реагентов «ДНК-сорб-B» вариант 50. ПЦР-анализ в режиме «реального времени» осуществляли в амплифика-торе с системой детекции флуоресцентного сигнала «Rotor-Gene 3000». Для проведения ПЦР-анализа с детекцией результатов по «конечной точке» использовали амплификатор «Терцик» и флуоресцентный ПЦР -детектор «АЛА».
Материалом для исследования служили чистые культуры 42 штаммов B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis, B. neotomae, B. rangiferi, Y. рestis, Y еntero-colitica, Y рseudotuberculosis, F. tularensis, а также биологический материал от человека (кровь, сыворотка крови) и животных (плазма, молоко, паренхиматозные органы и лимфоузлы), искусственно инфицированный B. melitensis, B. abortus и B. suis в концентрациях 1-103 и 1-104 м.к./мл. Обеззараживание проб проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Препаратом сравнения служила коммерческая тест-система для выявления ДНК Brucella spp. методом ПЦР (ГенБру) (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб») в период срока годности, прошедшая контроль в специализированной лаборатории ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Испытания проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента. Испытуемые пробы для ПЦР были зашифрованы сотрудниками, не принимающими участия в постановке ПЦР и учете результатов.
В ходе проведенных испытаний с помощью набора реагентов с детекцией результатов в режиме «реального времени» (вариант FRT) чистые культуры Brucellaspp. выявлены вконцентрациях 1Т02 м.к./мл -53,8 %, 1103 м.к./мл - 9б,2 %, 1104м.к./мл - 100 % случаев. Использование набора с детекцией результатов по «конечной точке» (вариант FEP) позволило выявить Brucella spp. в концентрациях Ы02 м.к./мл -б1,5 %, 1103 м.к./мл - 9б,2 %, 1104 м.к./мл - 100 %. С помощью тест-системы (ГенБру) процент проб, содержащих Brucella spp. в чистых культурах, к числу исследованных штаммов составил 31 - в концентрации Ы02 м.к./мл, 85 - в концентрации 1-103 м.к./мл и 100 - в концентрации 1-104 м.к./мл.
В биологическом материале, содержащем
B. melitensis, B. abortus и B. suis в концентрации 1-103 м.к./мл, с помощью наборов реагентов «АмплиСенс® Brucella spp. -FL» вариантов FRT и FEP выявлено 9б,5 и 97,4 % проб соответственно, с помощью тест-системы (ГенБру) - 93,5 %.
Для обоих вариантов набора «АмплиСенс® Brucella spp.-FL» и тест-системы (ГенБру) установлена 100 % выявляемость проб биологического материала, содержащих бруцеллы в концентрации 1-104 м.к./мл.
Специфичность набора «АмплиСенс® Brucella spp.-FL» и тест-системы (ГенБру) составила 100 %. Гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1-107 м.к./мл не выявлены ни в одной пробе.
Воспроизводимость (совпадение результатов исследования положительных и отрицательных проб при 10-кратном повторении) наборов реагентов «АмплиСенс® Brucella spp. -FL» и тест-системы (ГенБру) равнялась 100 %.
Преимущество набора реагентов «АмплиСенс® Brucella spp.-FL» перед коммерческой тест-системой заключается в снижении риска перекрестной контаминации ампликонами за счет наличия в системе внутреннего контроля, что позволяет сократить возможность регистрации ложноположительных реакций; сокращении времени проведения анализа за счет отсутствия двустадийности ПЦР и этапа постановки электрофореза в агарозном геле. По показателям специфической активности и специфичности оба
Сводные данные о результатах испытания наборов диагностических для выявления ДНК бактерий Brucella spp. методом ПЦР
Показатели АмплиСенс® Brucella-FL ПЦР «ГенБру», Бактериология
Вариант FRT, % Вариант FEP, % % (высев 100 м.к.)
Чувствительность (% ± m) выявленных положительных проб к числу инфицированных Brucella spp. чистых культур, взятых на исследование
102 м.к./мл 53,8
103 м.к./мл 96,2
104 м.к./мл 100
(% ± m) выявленных положительных проб к числу инфицированных Brucella spp. биологического материала, взятых на исследование
103 м.к./мл 97,4
104 м.к./мл 100
Специфичность (% ± m) выявленных гетерологичных микроорганизмов 0
к числу исследованных чистых культур и биологического материала
61,5
9б,2
100
9б,5
100
0
31
85
100
93,5
100
0
бб,5
7б,5
б2
препарата оказались равноценными. Общие данные о диагностической ценности набора «АмплиСенс® Brucella spp.-FL» представлены в таблице.
По результатам проведенных медицинских приемочных испытаний было рекомендовано для контроля активности и специфичности внести в технические условия тест-штаммы B. abortus,
B. melitensis, B. suis, Y. enterocolitica и F. tularensis. В соответствии со схемой проведения исследования биологического материала и объектов окружающей среды в Инструкции по применению включены разделы «Меры предосторожности», «Взятие и хранение материала на исследование», «Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа», «Предварительная обработка материала».
На основании полученных данных набор реагентов «АмплиСенс® Brucella spp.-FL» рекомендован к государственной регистрации в Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения. Получено Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/04212 от 25.03.2009 г.
Таким образом, разработка принципиально новых и усовершенствование существующих методов лабораторной диагностики бруцеллеза дает возможность поднять диагностику данного заболевания на более высокий уровень. Использование молекулярногенетических подходов и сочетание их с традиционными лабораторными методами позволит быстро и качественно проводить диагностику заболевания у людей и животных, в максимально короткие сроки выявлять патогенные агенты. Это значительно повысит эффективность лечения, обеспечит своевременное проведение необходимых противоэпидемических мероприятий.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Гульченко Л.П., Федоров Ю.М. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике. Журн. микробиол., эпидемиол и иммунобиол. 1999; 4:14-7.
2. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сб. санитарных и ветеринарных правил. М.: Информ. издат. центр Госкомсанэпиднадзора; 1996. 256 с.
3. Черкасский Б.Л., Иванова А.А. Эпидемиологическая ситуация по зоонозам в России. Эпидемиол. и инф. бол. 1996; 2:12-5.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Onishchenko G.G., Monisov A.A., Gul’chenko L.P., Fedorov Yu.M. [Morbidity from natural-focal and zooanthroponotic infections and measures for their prevention]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1999; 4:14-7.
2. [Prophylaxis and Control of Contagious Diseases, Common for Both Humans and Animals: The Digest of Sanitary and Veterinary Regulations]. Moscow: Inform. Izd. Tsentr Goskomsanepidnadzor; 1996. 256 p.
3. CherkasskyB.L., IvanovaA.A. [Epidemiological situation on zoonotic infections in the Russian Federation]. Epidemiol. Inf. Bol. 1996; 2:12-5.
Authors:
MalakhaevaA.N., SayapinaL.V., BarulinaI.S., KasinaI.V.,Abdrashitova A.S. L.A.Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control. Sivtsev Vrazhek Lane, 41 Moscow, 119002, Russia. E-mail: gisk@info.ru OsinaN.A., SharovaI.N., MayorovN.V., ZaytsevaL.V., MironovaN.P. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: microbe@san.ru
Yatsyshina S.B. Central Research Institute of Epidemiology. Novo-gireevskaya St., 3a, Moscow, 111123, Russia. E-mail: syatsyshina@pcr.ru
Об авторах:
Малахаева А.Н., Саяпина Л.В., Барулина И.С., Касина И.В., Абдрашитова А.С. Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических пре-наратов им. Л.А.Тарасевича, 119002, Москва, нер. Сивцев Вражек, 41, E-mail: gisk@info.ru
Осина Н.А., Шарова И.Н., Майоров Н.В., Зайцева Л.В., Миронова Н.П. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Яцышина С.Б. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии. 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а. E-mail: syatsyshina@pcr.ru
Поступила 14.09.10.
б0
