CC BY
28
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Галеева А.Г., 2017
УДК 577.124:547.995.15:615.032:611.77]-092.9 Б01:10.23888/НШ20172152-157
ОБМЕН УГЛЕВОДОВ В КОЖЕ КРЫС В ОБЛАСТИ ВНУТРИДЕРМАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО НАТИВНОГО ГИАЛУРОНАНА
А.Г. ГАЛЕЕВА
Башкирский государственный медицинский университет, ул. Ленина, 3, 450008, г. Уфа, Российская Федерация
У самок белых крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) массой 280-320 г при ин-тердермальном трёхкратном введении препарата нестабилизированной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты изучали содержание в коже в области инъецирования следующие показатели углеводного обмена: пируват, лактат, активность гек-сокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, уровни гликогена, гликозаминогликанов суммарно и гиалуроновой кислоты. Препарат, содержащий 13,5 мг/мл геля гиалуронана с молекулярной массой 1 млн Да вводили на 1-й, 3-й и 6-й день эксперимента методом мезотерапии. Содержание показателей углеводного обмена и активность ферментов изучали на 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки опыта. Результаты исследования позволили придти к заключению, что внутридер-мальное курсовое введение препарата высокомолекулярной нативной гиалуроновой кислоты методом мезотерапии приводит в коже в зоне инъекции в первые дни к повышению процессов анаэробного окисления углеводов с мобилизацией гликогена. Об этом свидетельствуют статистически значимое увеличение в коже содержания молочной кислоты на 2-е, 4-е и 7-е сутки эксперимента до 120,8%, 144,8% и 139,8%, соотношения лактат/пируват до 118,2%, 152,3% и 146,9%, уменьшение содержания гликогена до 90,1%, 76,8% и 78,6% с повышением активности лактатдегидрогеназы до 138,9%, 133,3% и 139,1% соответственно. В отдалённые сроки после проведения курсовой терапии препарата гиалуронана в коже происходит активация процессов аэробного окисления с усилением использования глюкозы на биосинтетические цели, что находит своё отражение в достоверном увеличении на 37-е сутки эксперимента активности гексокиназы до 133,3% и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы до 164,1%, снижении коэффициента лактат/пируват до 80,7%, повышении концентрации гиалуронана до 130% и общих гликозаминогликанов до 114,3%. Изменение в обмене углеводов в коже в области внутридермального введения препарата высокомолекулярной нативной гиалуроновой кислоты является отражением улучшения обменных процессов, позволяющих пролонгировать эстетический эффект мезотерапии.
Ключевые слова: высокомолекулярный гиалуронан, интердермальное введение, обмен углеводов кожи.
CARBOHYDRATE METABOLISM IN THE SKIN RATS IN INTRADERMAL ADMINISTRATION OF THE PREPARATION OF HIGH-MOLECULAR NATIVE HYALURONAN
AG. GALEEVA
Bashkir State Medical University, Lenina str., 3, 450008, Ufa, Russian Federation
At females of white rats of mature age (11-12 months) weighing 280-320 g at interdermal triple introduction of medicine of not stabilized high-molecular hyaluronic acid studied contents in skin in the field of an injection the following indicators of carbohydrate exchange: pyruvate, lactate, activity of a hexakinase, glucose-6- phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, levels of a glycogen, glycosaminoglycan totally and hyaluronic acid. The medicine containing 13,5 mg/ml of gel of a gialuronan with a molecular weight of 1 million. It was entered for the 1st, 3rd and 6th day of an experiment by a me-sotherapy method. The maintenance of indicators of carbohydrate exchange and activity of enzymes studied for the 2nd, 4th, 7th, 21st and 37th days of experience. Results of a research have allowed to come to conclusion that interdermal course introduction of medicine of high-molecular native hyaluronic acid by method of a mesotherapy brings in skin in an injection zone in the first days an increase in processes of anaerobic oxidation of carbohydrates with mobilization of a glycogen. Ratios a lactate/pyruvate to 118,2%, 152,3% and 146,9%, reduction of maintenance of a glycogen to 90,1%, 76,8% and 78,6% with increase in activity of a lactated ehydroge^sis to 138,9%, 133,3% and 139,1% respectively testify to it statistically significant increase in skin of content of lactic acid for the 2nd, 4th and 7th days of an experiment to 120,8%, 144,8% and 139,8%. In the remote terms after performing course therapy of medicine of a gialuronan in skin there is an activation of processes of aerobic oxidation to strengthening of use of glucose on the biosyn-thetic purposes that finds the reflection in reliable increase for the 37th days of an experiment of activity of a hexakinase up to 133,3% and glucose-6-Phosphatdehydrogenesis to 164,1%, decrease in coefficient a lactate/pyruvate to 80,7%, increase in concentration of a gialuronan to 130% and the general glycosaminoglycan to 114,3%. Change in exchange of carbohydrates in skin in the field of interdermal introduction of medicine of high-molecular native hyaluronic acid is reflection of improvement of the exchange processes allowing to prolong esthetic effect of a mesotherapy.
Keywords: high-molecular hyaluronan, interdermal injection, exchange of carbohydrates of skin.
Кожа характеризуется высоким содержанием и интенсивным обменом полисахаридов. Период полураспада гиалу-ронана в коже человека составляет 24-48 ч [1], в коже крысы, кролика 2,4-4 суток [2].
Оба компонента дисахаридного фрагмента полимера гиалуронана являются производными глюкозы, синтезируются из глюкозы и состояние обмена глюкозы при внутридермальном введении гиа-луроновой кислоты представляет несо-
мненный интерес, поскольку широко используемый в эстетической медицине и косметологии гиалуронан в составе различных препаратов химически идентичен гиалуронану дермы и отличается лишь количеством дисахаридных звеньев [3, 4].
Цель исследования Охарактеризовать обмен углеводов в коже при внутридермальном курсовом введении препарата высокомолекулярного гиа-луронана экспериментальным животным.
Материалы и методы
В опытах были использованы 114 самок крыс зрелого (11-12 месяцев) возраста, которые содержались в виварии при сбалансированном питании и естественном освещении. При проведении экспериментов соблюдали этические нормы и рекомендации по гуманному отношению к животным, изложенным в Европейской конвекции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, а также приказ Минздрава РФ от 19.06.2013 г. №267 «Об утверждении правил лабораторной практики».
В работе использовали препарат «Juvederm Hydrate™», содержащий в 1 мл фосфатного буфера рН 7,2 13,5 мг геля гиалуроновой кислоты и 9 мг маннитола. Введение препарата производили под лёгким эфирным наркозом интердермально техникой мезотерапии на боковую поверхность туловища (площадь 3х3 см) после предварительного удаления шерстяного покрова из расчёта 0,06 мл на 100 г массы тела крысы трижды на 1-е, 3-и и 6-е сутки эксперимента. Контрольной группе животных также интердермально инъецировали стерильный физиологический раствор.
Животных выводили из эксперимента мгновенной декапитацией под лёгким эфирным наркозом на 2-е, 4-е, 7-е, 21 -е и 37-е сутки.
В коже в областях инъекции препарата гиалуронана и физиологического раствора изучали содержание гликогена [5] с последующим определением глюкозы в гидролизате глюкозооксидазным методом (реагенты ООО «Ольвекс Диагно-стикум», Россия), гиалуронана [6], суммарных гликозаминогликанов [7], пирува-та [8], лактата (реагенты ООО «Ольвекс Диагностикум»), активность гексокиназы [9], лактатдегидрогеназы (реагенты ООО «Ольвекс Диагностикум») и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [10]. Содержание белка в пробах определяли по Лоури.
Статистическую обработку результатов осуществляли, используя пакет про-
грамм Statistica 6,0 for Window, рассчитывали медиану, верхний и нижний квартили. Межгрупповые различия показателей оценивали по U-критерию Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования показали, что в коже животных в области введения препарата гиалуроновой кислоты содержание пировиноградной кислоты не претерпевает существенных изменений (табл. 1). При этом уровень молочной кислоты после введения препарата повышается, достигая статистически значимых различий на 2-е, 4-е и 7-е сутки, характеризуя усиление анаэробного окисления глюкозы. Показательно в этом отношении динамика изменений лактат/пируват. У крыс 1-й, 2-й и 3-й групп (на 2-е, 4-е и 7-е сутки эксперимента) этот коэффициент возрастает, отражая превалирование анаэробных процессов утилизации глюкозы, а на поздних сроках эксперимента (21-е и 37-е сутки) - снижается, характеризуя усиления аэробного окисления.
Об изменении обмена глюкозы в коже при внутридермальном введении препарата гиалуронана свидетельствуют и результаты определения активности ферментов. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) повышалась в первые дни эксперимента, подтверждая данные определения лактата и пирувата, свидетельствующие об усилении анаэробного окисления глюкозы.
Активность ключевого фермента обмена глюкозы - гексокиназы, наоборот, статистически значимо увеличивалась в поздние сроки после инъекции препарата гиалуронана, отражая интенсификацию потребления глюкозы. Активность глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-фДГ) в первые дни при курсовом введении гиа-луронана снижалась, а на 21-е и 37-е сутки опыта была статистически значимо выше контрольных значений. Увеличение окисления глюкозы по гексозомонофос-фатному пути характеризует повышение продукции восстановленного НАДФН и фосфорных эфиров пентоз, используемых на биосинтетические цели.
Таблица 1
Изменение показателей обмена углеводов в коже животных в области введения препарата гиалуронана
Контрольная Опытная группа животных
Показатели группа п=24 2-е сутки п=10 4-е сутки п=16 7-е сутки п=14 21-е сутки п=14 37-е сутки п=16
Пируват, 0,059 0,056 0,049 0,054 0,049 0,065
мкмоль/г ткани [0,052-0,07] [0,05-0,064] [0,04-0,056] [0,048-0,06] [0,04-0,061] [0,061-0,07]
Лактат, 0,96 1,16* 139*** 1 34*** 0,80 0,92
мкмоль/г ткани [0,76-1,13] [0,97-1,43] [1,3-1,42] [1,31-1,40] [0,75-0,84] [0,83-1,04]
Лактат/пируват 17,6 [14,2-18,8] 20,8** [19,2-22,5] 26,8** [25,2-29,7] 25,8** [23,6-27,0] 15,3 [13,3-17,1] 14,2* [13,2-15,6]
Гексокиназа, нмоль НАДФН мг белка-1 мин-1 4,2 [3,1-4,8] 4,6 [4,0-4,9] 3,8 [3,1-4,5] 3,9 [3,3-4,6] 5,3* [4,1-5,8] 5,6*** [4,4-6,2]
ЛДГ, 0,18 0,25* 0,24* 0,25* 0,21 0,20
Ед/мг белка [0,16-0,21] [0,21-0,29] [0,18-0,29] [0,17-0,28] [0,18-0,30] [0,2-0,24]
Г-6-ф ДГ, 1,03 0,78* 0,75** 0,80* 1 44*** 1 69***
ЕД/мг белка [0,99-1,21] [0,72-0,84] [0,7-0,84] [0,73-1,04] [1,21-1,56] [1,41-1,80]
Гликоген, 3,93 3,7 3,02** 3,09* 3,35* 3,69
мг/г ткани [3,42-4,53] [3,54-4,32] [2,75-3,5] [2,45-4,07] [2,9-3,65] [3,01-4,35]
ГАГ сумм., моль гексуроновых кислот/ г ткани 16,8 [14,3-20,4] 30,4*** [25,1-33,3] 30,8*** [26,2-34,6] 34,0*** [27,2-36,5] 18,8 [15,6-23,7] 19,2* [15,8-24,6]
Гиалуронан, мг 274 678*** 623*** 607*** 305** 357**
гексуроновых кислот/ г ткани [246-303] [576-795] [583-710] [570-645] [271-400] [332-374]
Примечание: * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.
У опытной группы животных в первые дни после инъекции препарата гиалу-ронана в коже содержание гликогена снижалась, а уровень суммарных глико-заминогликанов (ГАГ) и гиалуроновой кислоты резко увеличивался. Снижение гликогена, очевидно, связано с усилением его мобилизации на обеспечение энергетических и других процессов на фоне некоторого падения активности гексокина-зы. Увеличение уровня ГАГ и гиалурона-на на следующие сутки после внутридер-мального введения гиалуроновой кислоты извне вполне объяснимо его накоплением, поскольку основная масса (99%) полисахарида находится во внеклеточном пространстве в свободном состоянии [3]. Статистически значимое увеличение гиалу-ронана в коже опытных животных на 21 -е и 37-е сутки свидетельствует об усилении биосинтетических процессов с образованием полисахаридов denovo. Повышение
активности гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эти же сроки эксперимента не противоречат данному предположению.
В практике эстетической медицины препарат гиалуронан в настоящее время используется не только с целью восстановления оптимальных параметров вяз-коэстетических и других биомеханических свойств ткани, но и как модулятор процессов пролиферации и функционального состояния фибробластов, стимулятор неоангиогеназа, биосинтеза коллагена и других компонентов межклеточного мат-рикса [3, 4, 11]. Изменения в обмене углеводов в коже в области внутридермально-го введения препарата гиалуронана являются отражением этих процессов.
Выводы
1. Внутридермальное курсовое введение препарата высокомолекулярной на-тивной гиалуроновой кислоты методом
мезотерапии приводит в зоне инъекции в коже в первые дни к повышению процессов анаэробного окисления углеводов с мобилизацией гликогена. Об этом свидетельствуют увеличение в коже содержания молочной кислоты и соотношения лактат/пируват с повышением активности лактатдегидрогеназы.
2. В отдалённые сроки после проведения курсовой терапии препарата гиалу-
Литература
1. Кошевенко Ю.Н. Кожа человека: в 2-х т. М.: Медицина, 2006. Т. 1. 360 с.
2. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически изменённой соединительной ткани. Ленинград: Изд-во «Медицина», 1969. 374 с.
3. Хабаров ВН., Байков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота. М.: Практическая медицина, 2012. 224 с.
4. Чайковская Е.А., Шарова А.А. Гиалуроновая кислота и её фракции. Биологические функции в ракурсе фармакотерапии // Инъекционные методы и композиции. 2012. №1. С. 9-16.
5. Good C., Cramer H., Somogyi M. The determination of glycogen // J. Biol. Chem. 1933. Vol. 2. P. 485-497.
6. Башкатов С.А. Гликозаминогли-каны в механизмах адаптации организма. Уфа: Изд-во Башкирского ГУ, 1995. 144 с.
7. Шараев П.Н., Пешков В Н., Зубарев О.Н. и др. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани. Ижевск, 1990. 22 с.
8. Асатиани В.С. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969. С. 201-203.
9. Алексахина Н.В. Сетина Н.Ю., Щербатых Л.Н. Солюбилизация, очистка и некоторые свойства гексокиназы скелетных мышц крыс // Биохимия. 1973. Т. 38, №5. С. 915-921.
10. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: справочник / под ред. проф. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 1999. С. 24-25.
11. Михайлова Н.П., Шехтер А.Б. Сравнительное исследование взаимодейст-
ронана в коже происходит активация процессов аэробного окисления с усилением использования глюкозы на биосинтетические цели, что находит своё отражение в увеличении активности гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, снижении коэффициента лактат/пируват, повышении концентрации гиалуронана и общих гликозаминогликанов.
Конфликт интересов отсутствует.
вия инъецированных гелей немодифициро-ванной и модифицированной гиалуроновой кислоты с биотканью // Вестник эстетической медицины. 2014. Т. 13, №3-4. С. 55-62.
References
1. Koshevenko YN. Kojacheloveka [Human skin] v 2-h t. Moscow: Medicina, 2006; 1: 360 p. (in Russian)
2. Slushzkij LI. Biohimija normal 'noi i patologicheski izmenennoi soediniteVnoi tkani [Biochemistry of normal and pathologically altered connective tissue]. Leningrad: Izd-vo «Medicina»; 1969. 374 p. (in Russian)
3. Habarov VN, Baikov PYa, Selya-nin MA. Gialuronovaya kislota [Hyaluronic acid]. Moscow: Prakticheskaya medicina; 2012. 224 p. (in Russian)
4. Chaikovskya EA. Gialuronovaya kislota i ee frakcij. Biologicheskie funkcij v rakurse farmakoterapij [Hyaluronic acid and its fractions. Biological functions pharmacotherapy foreshortened]. Inekcionnye metody i kompozishchij [Injection methods and compositions]. 2012; 1: 9-16. (in Russian)
5. Good C, Cramer Н, Somogyi М. The determination of glycogen. J. Biol. Chem. 1933; 2: 485-97.
6. Bashkatov SA. Glycosaminogly-cany v mehanizmah adaptacii organizma [Glycosaminoglycans in the body's mechanisms of adaptation] Ufa: Izd-vo Bashkirsko-go GU; 1995. 144 p. (in Russian)
7. Sharaev PN, Peshkov BN, Zubarev ON [i dr.]. Biohimicheskie metody analizapo-kazateley obmena biopolimerov soediniteVnoi tkani [Biochemical analysis of the indicators of exchange of connective tissue biopolymers]. Izhevsk; 1990. 22 p. (in Russian)
8. Asatiani VS. Fermentnye metody analiza [Enzymatic methods of analysis] , Moscow: Nauka; 1969. P. 201-3. (in Russian)
9. Aleksahina NB, Setina NYu, Shcherbatyh LN. Solubilizacija, ochistka i nekotorye svoistva geksokinazi skeletnyh myshzkrys [Solubilization, purification and some properties of rat skeletal muscle hexokinase]. Biohimija [Biochemistry]. 1973; 38 (5): 915-21. (in Russian)
10. Medicinskie laboratornye tehnolo-gij i diagnistika [Medical laboratory tech-
nology and diagnostics]. Spravochnic [Directory] / pod red. prof. A.I. Karpishchenko. Saint Petersburg: Intermedika; 1999. P. 24-5. (in Russian)
11. Mihailova NP. SravniteFnoe issle-dovanie vzaimodeistvija in'ecirovanija geley nemodificirovannoi i modificirivannoi gialu-ronovoi kisloty s biotkan'y [A comparative study of the interaction of the injected gel unmodified and modified hyaluronic acid from biological tissue]. Vestnic esteticheskoi mediciny [Journal of Aesthetic Medicine]. 2014; 13 (3-4): 55-62. (in Russian)
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРЕ
Галеева А.Г. - аспирант кафедры биологической химии, Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа, Российская Федерация. E-mail: [email protected]
INFORMATION ABOUT THE AUTHOR
Galeeva A.G. - graduate student of biological chemistry, Bashkir State Medical University, Ufa, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
