CC BY
52
УДК 547.995.11:57.089.24:611.778.018:612.79.018
ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК КОЖИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВНУТРИДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Галеева1 А.Г., Камилов1 Ф.Х., Капулер2 О.М., Данилова3 О.В.
1ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет», г.Уфа, Российская Федерация. 2ЗАО «Косметологическая лечебница», г. Уфа, Российская Федерация.
3ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», г. Ижевск, Российская Федерация.
Аннотация: В работе представлены результаты изучения маркеров пролиферации белка Ю-67 фактора роста фибробластов - 1 (FGF-1) в коже самок крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) при внутридермальном введении техникой мезотерапии препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (мол.масса 1 млн.Да) широко используемой для коррекции инволюционных изменений кожи. Методом иммуногистохимии с использованием мышиных поликлональных антител установлено, что гиалуроновая кислота стимулирует пролиферацию фибробластов, эпителиальных клеток кожи и волосяных фолликул, эндотелия сосудов. Максимум экспрессии белка Ю-67 при этом приходиться на 7-е сутки после инъекции гиалуроновой кислоты, а FGF-1 - на 21-е сутки.
Ключевые слова: кожа; пролиферация клеток; нативная высокомолекулярная гиалуроновая кислота; внутридермальное введение; белок Ю-67; фактор роста фибробластов - 1.
Возрастное старение и фотоповреждения кожи сопровождаются изменениями количества, морфологии, пролиферативных свойств, функциональной активности фибробластов [9]. Снижение биосинтетической активности фибробластов негативно отражается на метаболизме и биологических функциях внеклеточного матрикса и прежде всего его основных биополимеров - коллагеновых структрурах, гиалуроновой кислоте и неколлагеновых белках. Для эстетической коррекции инволюционных изменений кожи наибольшее распространение получили омолаживающие технологии на основе препаратов гиалуроновой кислоты, отвечающие основным требованиям инъекционных средств -безопасности и биосовместимости [1,3].
Гиалуроновая кислота определяет состояние водного баланса, тургора, упругости и других биомеханических характеристик, оказывает стимулирующий эффект на течение обменных процессов в коже, способствует увеличению объема внеклеточного матрикса, количества его структурных элементов и активной регенерации [4,5,7,10]. При этом физиологические эффекты гиулуроновой кислоты связаны с ее молекулярной массой [5,8]. Гиалуроновая кислота с молекулярной массой более 500000Да подавляет размножение и миграцию клеток, а продукты ее деполимеризации до 100000Да усиливают пролиферацию фибробластов и ангиогенез [7]. Наиболее выраженный эффект на пролиферацию фибробластов оказывают олигомеры гиа-
луроновой кислоты, состоящие от 6 до 20 дисахарид-ных звеньев [8]. Вместе с тем в литературе имеются лишь единичные сообщения о регенеративных процессах в коже при введении препаратов гиалуроновой кислоты, положительный эффект их применения преимущественно основан на констатации визуализируемых изменении [1], а результаты, полученные в условиях ex vivo с культурами клеток, не всегда подтверждаются в экспериментах in vivo [5].
Цель исследования. Оценить активность пролиферации клеток кожи при внутридермальном введении экспериментальным животным нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты методом мезотера-пии.
Материал и методы исследования. Исследования проведены на 30 самках белых крыс зрелого (10-12 месяцев) массой 280-320 г с соблюдением этических норм и рекомендации по гуманному отношению к животным, используемым в экспериментальных и других научных целях. Под легким эфирным наркозом крысам контрольной группы внутридермально методом мезо-терапии вводили стерильный физиологический раствор, а животным опытной группы - препарат "Juvederm hydrate™" (Франция), содержащий 13,5 мг геля нестабилизированной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1 млн.Да и 9 мг маннитола в 1 мл фосфатного буфера рН7,2. Инъекции осуществляли на боковые поверхности туловища животных (площадь 3х3 см) после предварительного удаления шерстяного
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
покрова из расчета 0,06 мл на 100 г массы. Под легким эфирным наркозом животных выводили из эксперимента на 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки.
В кусочках кожи в местах введения препарата гиа-луроновой кислоты и физиологического раствора изучали методом иммуногистохимии уровень маркеров пролиферации - белка Ki-67 и фактор роста фибробла-стов (FGF-1). Выявление цитокинов Ki-67, определяющегося в ядрах пролиферующих клеток, и FGF-1 в цитоплазме экспрессирующих этот фактор клеток [2] осуществляли согласно протоколу производителя с использованием мышиных поликлональных антител ("Santa Cruz Biotechnology", США) и универсальной системе вторичной детекции для визуализации (полик-лональная непрямая стрептовидин - биотиновая система детекции LEICA BOND ("Novocastra™", Германия). Окрашивание производили в гистостейнере для иммуногистохимии LEICA BOND MAX ("LEICA", Германия). После проведения реакции срезы докрашивали раствором гематоксилина и заключали в бальзам.
Подсчет клеток, экспрессирующих маркеры пролиферации, осуществляли с помощью микроскопа LEICA ДМ-5000В. Окрашенные клетки считали в поле зрения при увеличении в 400 раз. На каждый срок исследования подсчет меченых клеток делали в срезах в 20 полях зрения. Статическую обработку результатов осуществляли параметрическими методами с использованием пакета программ Statistica 6,0 for Windows.
Результаты и обсуждение. Антиген Ki-67 состоит из двух полипептидных цепей и ассоциирован с хромосомами фазы митоза. Экспрессия Ki-67 позволяет выделить клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла на всем протяжении (G1-,S-, G2^, М-фазы) [11].
У животных контрольной группы после реакции на выявление Ki-67 положительно метились лишь отдельные клетки базального слоя эпидермиса, свидетельствуя о слабо выраженном клеточном обновлении эпителиальных клеток. Большинство ядер эпителиоцитов окрашивались гематоксилином в синий цвет (рис.1).
Рис. 1. Иммуногистохимическое выявление белка Ю-67 (|) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 7-е сутки после введения физиологического раствора. Докраска гематоксилином.
Увел.х200.
После внутридермального введения крысам препарата гиалуроновой кислоты, начиная с 4-х суток опыта, цитокин Кь67 выявлялся во многих клетках базаль-
ного слоя эпителия, указывая на интенсификацию процесса пролиферации. Наибольшей интенсивности процесс пролиферации достигал на 7-е сутки опыта (рис.2)
КМ.
■Ч - *
Рис. 2. Иммуногистохимическое выявление белка Ki-67 (|) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 7-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска гематоксилином.
Увел.х400.
На 21-е сутки в эпителиальном слое кожи белок Ю-67 экспрессировали лишь отдельные клетки базаль-ного слоя, цитокин интенсивно обнаруживался в клетках волосяных фолликул и фибробластического диф-ферона в сосочковом слое дермы под эпидермисом
(рис.3), а также в ядрах эндотелиальных клеток стенок отдельных кровеносных сосудов. На 37-е сутки после интердермального введения препарата гиалуроновой кислоты белок Ki-67 выявлялся в отдельных клетках эпителиального слоя и клетках волосяных луковиц.
Ш-ШШШ
Рис. 3. Иммуногистохимическое выявление белка Ki-67 (|) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 21-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска гематоксилином. Увел.х200.
Семейство факторов роста фибробластов включает 19 различных белков, являющихся потенциальными митогенами и стимуляторами ангиогенеза. Включая несколько путей внутиклеточной передачи сигналов FGF оказывают модулирующее влияние на внутриклеточные события: коммитирование клеток, их пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз [6].
По результатам иммуногистохимической реакции на выявление FGF-1 в коже животных контрольной группы можно констатировать, что во все сроки опыта цитокин слабо экспрессировался в цитоплазме лишь отдельных клеток (рис.4) .
ж;-, "г*"!
Рис. 4. Иммуногистохимическое выявление FGF-1 (|) в цитоплазме клеток (коричневое окрашивание) на 21-е сутки после внутридермального введения физиологического раствора. Докраска гематоксилином. Увел.х200.
После внутридермального введения препарата гиа-луроновой кислоты методом мезотерапии экспрессия FGF-1, наблюдалась на 4-е сутки и достигала максимума на 21-е сутки эксперимента. Фактор роста экс-прессировался различными клетками: макрофагами, отдельными фибробластами, эндотелиальными клетками, перицитами. Наиболее интенсивно в виде ярко-
коричневого окрашивания он выявлялся в цитоплазме макрофагов (рис.5), которых было достаточно много в сосочковом слое непосредственно под эпителием, в фасциальной прослойке и вокруг кровеносных сосудов.
^ АЛ* .
—--—
Рис. 5. Иммуногистохимическое выявление FGF-1 в цитоплазме клеток (коричневое окрашивание) в фасциальной прослойке и под эпидермисом кожи крысы на 21-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска
гематоксилином. Увел.х200.
На 37-е сутки опыта количество клеток экспресси- экспрессирующих РОР-1 после внутридермального рующих фактор роста фибробластов снижалось и по- введения препарата гиалуроновой кислоты, представ-казатели приближались к контролю. Подсчет среднего ленный на диаграмме, показывает, что наиболее высо-количества клеток в поле зрения при увеличении х400, кая экспрессия выявляется на 21-е сутки опыта (рис.6)
Динамика показателей среднего количества клеток (в поле зрения при увел.ХДОО), экспрессирующих цитокин РСР-1 в коже крыс после введения препарата ГК
45 * * i
40
35
30 m
25
20 □ опытная группа
15- * □ контрольная группг
10 * rL *
5 Г) □Ь Lb _ь LD
2 сутки 4 сутки 7 сутки 21 сутки 37 сутки
сроки
Рис. 6. Диаграмма среднего количества клеток, экспрессирующих FGF-1 в коже крыс зрелого возраста после введения препарата нестабилизированной гиалуроновой кислоты. *) Р<0,05, **)Р<0,001.
Таким образом, результаты иммуногистохимиче-ских исследовании с применением моноклональных антител на выявление цитокинов Ю-67 и РОР-1 показывают, что внутридермальное введение методом ме-зотерапии крысам зрелого возраста препарата натив-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты усиливает пролиферацию клеток эпителия кожи, фиб-робластов, эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, эпителиальных клеток волосяных фолликул.
Результаты наших исследований подтверждают данные литературы о стимулирующем действии гиалуроновой кислоты и фрагментов её деполимеризации на процессы пролиферации фибробластов и эндотелиаль-ных клеток [1,4,5,7,8]. В то же время механизмы их действия требуют дальнейшего изучения.
Выводы: Внутридермальное введение препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты методом мезотерапии животным зрелого возраста стимулирует в коже пролиферативные процессы клеток эпителия, фибробластов, эпителиальных клеток волосяных фолликул и эндотелия сосудов. Пик экспрессии антигена Ki-67 при этом приходится на 7-е сутки после инъекции препарата, а фактора роста фибробластов -1 на 21-е сутки.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Галлямова Ю.А., Баринова О.А. Структурные и функциональные параметры кожи лица до и после внутридермального введения гиалуроновой кислоты.// Росс.журнал кожных и венерических болезней. - 2012. - №2. - с.52-56.
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
[2] Иммуногистохимические методы: руководство/под ред. Г.А. Франка, П.Г. Малькова; пер. с англ. Н.В. Данилова, Л.В. Москвина, Н.М. Гайфуллина. - М., 2011.224 с.
[3] Марголина А., Эрнандес Е. Новая косметология. - М.: Ковель, 2005. - 424 с.
[4] Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроно-вая кислота. - М.: Практическая медицина, 2012. -224с.
[5] Чайковская Е.А., Шарова А.А. Гиалуроновая кислота и её фрагменты. Биологические функции в ракурсе фармакотерапии. // Инъекционные методы и композиции.
- 2012. -№1.- с.9-16.
[6] Chen L., Deng C.X. Roles of FGF signaling in skeletal devolepment and Ruman genetic diseases. // Front. Biosci.
- 2005. - №10. - Р. 1961-1976.
[7] Fergusom E.L., Roberts J.L., Moseley R. et al. Evalution of the physical and biological properties of hyaluronan and hy-aluronan fragments. // Int. J. Pharm. - 2011. - vol.420, №1.
- P.84-92.
[8] Gao F., Liu Y., He Y. et al. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angi-ogenesis. // Matix. Bid. - 2010. - vol.29, №2. - P. 107-116.
[9] Sorrell M., Caplan A.I. Fibroblasts - a diverse population al the center of it all. // Int. Rev. Cell Molec. Boil. - 2009.
- vol. 276. - P.161-204.
[10] Stern R., Maibach H.I. Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. // Clin. Dermatol. -2008. - vol.26, №2. - P.1006-1022.
[11] Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. et al. Ki 67 in breast cancer: prognostic and predictive potencial // Lancet On-cod. - 2010. - vol.11, №2. - P.174-183.
PROLIFERATION OF SKIN CELLS WITH INTRADERMAL ADMINISTRATION OF HYALURONIC ACID TO EXPERIMENTAL ANIMALS
Galeeva1 A.G., Kamilov1 F.Kh., Kapuler2 O.M., Danilova3 O.V.
'Bashkir State Medical University, Ufa, Russian Federation. 2ZAO Kosmetologicheskaya lechebnitsa, Ufa, Russian Federation. 3Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russian Federation.
Annotation: The paper presents the results of studying the proliferation markers of the fibroblast-1 growth factor Ki-67 (FGF-1) in the skin of female rats of mature age (11-12 months) with intradermal mesotherapy with the preparation of native high-molecular hyaluronic acid (mol. Yes) immunohistochemical method using mouse polyclonal antibodies. It was found that hyaluronic acid stimulates the proliferation of fibroblasts, skin epithelial cells and hair follicles, and vascular endothelium. The maximum expression of the Ki-67 protein in this case occurs on the 7th day after the injection of hyaluronic acid, and FGF-1 on the 21st day. Key words: Skin; Cell proliferation; Native high-molecular hyaluronic acid; Intradermal administration; Protein Ki-67; Fibroblast growth factor - 1._
REFERENCES
[1] Gallyamova Yu.A., Barinova O.A. Structural and functional parameters of the facial skin before and after intradermal administration of hyaluronic acid. // Ross.journal of skin and venereal diseases, 2012, № 2, pp. 52-56. (in Russian)
[2] Immunohistochemical methods: guidance / ed. G.A. Frank, P.G. Malkova; Translation from English. N.V. Danilova, L.V. Moskvina, N.M. Gaifullin, M., 2011, 224 p. (in Russian)
[3] Margolina A., Hernandez E. New Cosmetology. - Moscow: Kovel, 2005, 424 p. (in Russian)
[4] Khabarov V.N, Boykov P.Ya., Selyanin M.A Hyaluronic acid. M.: Practical medicine, 2012, 224 p. (in Russian)
[5] Chaikovskaya E.A., Sharova A.A. Hyaluronic acid and its fragments. Biological functions in the perspective of pharmacotherapy. // Injection methods and compositions, 2012, № 1, pp. 9-16. (in Russian)
[6] Chen L., Deng C.X. Roles of FGF signaling in skeletal devolution and Random genetic diseases. // Front. Biosci, 2005, № 10, pp. 1961-1976.
[7] Fergusom E.L., Roberts J.L., Moseley R. et al. Evaluation of the physical and biological properties of hyaluronan and hyaluronan fragments. // Int. J. Pharm, 2011, vol. 420, № 1, pp. 84-92.
[8] Gao F., Liu Y., He Y. et al. Hyaluronan oligosaccharides to promote excisional wound healing through enhanced angi-ogenesis. // Matix. Bid, 2010, vol. 29, № 2, pp. 107-116.
[9] Sorrell M., Caplan A.I. Fibroblasts - a diverse population. // Int. Rev. Cell Molec. Boil, 2009, vol. 276, pp. 161-204.
[10] Stern R., Maibach H.I. Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. // Clin. Dermatol, 2008, vol. 26, № 2, pp. 1006-1022.
[11] Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. Et al. Ki 67 in breast cancer: prognostic and predictive potencial // Lancet Oncod, 2010, vol. 11, № 2, pp. 174-183.
