CC BY
63
УДК 547.995.11:57.089.24:611.778.018:612.79.018
ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК КОЖИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВНУТРИДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ГИА-ЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Галеева1 А.Г., Камилов1 Ф.Х., Капулер2 О.М., Данилова3 О.В.
1ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа, Российская Федерация. 2ЗАО «Косметологическая лечебница», г. Уфа, Российская Федерация.
3ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия», г. Ижевск, Российская Федерация.
Аннотация: В работе представлены результаты изучения маркеров пролиферации белка Ki-67 фактора роста фибробластов - 1 (FGF-1) в коже самок крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) при внутридермальном введении техникой мезотерапии препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (мол.масса 1 млн.Да) широко используемой для коррекции инволюционных изменений кожи. Методом иммуногистохимии с использованием мышиных поликлональных антител установлено, что гиалуроновая кислота стимулирует пролиферацию фибробластов, эпителиальных клеток кожи и волосяных фолликул, эндотелия сосудов. Максимум экспрессии белка Ki-67 при этом приходиться на 7-е сутки после инъекции гиалуроновой кислоты, а FGF-1 - на 21-е сутки.
Ключевые слова: кожа; пролиферация клеток; нативная высокомолекулярная гиалуроновая кислота; внутри-дермальное введение; белок Ki-67; фактор роста фибробластов.
Возрастное старение и фотоповреждения кожи сопровождаются изменениями количества, морфологии, пролиферативных свойств, функциональной активности фибробластов [9]. Снижение биосинтетической активности фибробластов негативно отражается на метаболизме и биологических функциях внеклеточного матрикса и прежде всего его основных биополимеров - кол-лагеновых структрурах, гиалуроновой кислоте и неколлагеновых белках. Для эстетической коррекции инволюционных изменений кожи
наибольшее распространение получили омолаживающие технологии на основе препаратов гиалу-роновой кислоты, отвечающие основным требованиям инъекционных средств - безопасности и биосовместимости [1,3].
Гиалуроновая кислота определяет состояние водного баланса, тургора, упругости и других биомеханических характеристик, оказывает стимулирующий эффект на течение обменных процессов в коже, способствует увеличению объема
—--—
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Вестник представлен в научной электронной библиотеке (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--—
внеклеточного матрикса, количества его структурных элементов и активной регенерации [4,5,7,10]. При этом физиологические эффекты гиулуроновой кислоты связаны с ее молекулярной массой [5,8]. Гиалуроновая кислота с молекулярной массой более 500000Да подавляет размножение и миграцию клеток, а продукты ее деполимеризации до 100000Да усиливают пролиферацию фибробластов и ангиогенез [7]. Наиболее выраженный эффект на пролиферацию фибробла-стов оказывают олигомеры гиалуроновой кислоты, состоящие от 6 до 20 дисахаридных звеньев [8]. Вместе с тем в литературе имеются лишь единичные сообщения о регенеративных процессах в коже при введении препаратов гиалуроновой кислоты, положительный эффект их применения преимущественно основан на констатации визуализируемых изменении [1], а результаты, полученные в условиях ex vivo с культурами клеток, не всегда подтверждаются в экспериментах in vivo
[5].
Цель исследования. Оценить активность пролиферации клеток кожи при внутридермаль-ном введении экспериментальным животным на-тивной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты методом мезотерапии.
Материал и методы исследования. Исследования проведены на 30 самках белых крыс зрелого (10-12 месяцев) массой 280-320 г с соблюдением этических норм и рекомендации по гуманному отношению к животным, используемым в экспериментальных и других научных целях. Под легким эфирным наркозом крысам контрольной группы внутридермально методом мезотерапии вводили стерильный физиологический раствор, а животным опытной группы - препарат "Juvederm hydrate™" (Франция), содержащий 13,5 мг геля нестабилизированной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1 млн.Да и 9 мг маннитола в 1 мл фосфатного буфера рН7,2. Инъекции осу-
ществляли на боковые поверхности туловища животных (площадь 3х3 см) после предварительного удаления шерстяного покрова из расчета 0,06 мл на 100 г массы. Под легким эфирным наркозом животных выводили из эксперимента на 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки.
В кусочках кожи в местах введения препарата гиалуроновой кислоты и физиологического раствора изучали методом иммуногистохимии уровень маркеров пролиферации - белка Ki-67 и фактор роста фибробластов (FGF-1). Выявление цитокинов Ki-67, определяющегося в ядрах про-лиферующих клеток, и FGF-1 в цитоплазме экс-прессирующих этот фактор клеток [2] осуществляли согласно протоколу производителя с использованием мышиных поликлональных антител ("Santa Cruz Biotechnology", США) и универсальной системе вторичной детекции для визуализации (поликлональная непрямая стрептовидин -биотиновая система детекции LEICA BOND ("Novocastra™", Германия). Окрашивание производили в гистостейнере для иммуногистохимии LEICA BOND MAX ("LEICA", Германия). После проведения реакции срезы докрашивали раствором гематоксилина и заключали в бальзам. Подсчет клеток, экспрессирующих маркеры пролиферации, осуществляли с помощью микроскопа LEICA ДМ-5000В. Окрашенные клетки считали в поле зрения при увеличении в 400 раз. На каждый срок исследования подсчет меченых клеток делали в срезах в 20 полях зрения. Статическую обработку результатов осуществляли параметрическими методами с использованием пакета программ Statistica 6,0 for Windows.
Результаты и обсуждение. Антиген Ki-67 состоит из двух полипептидных цепей и ассоциирован с хромосомами фазы митоза. Экспрессия Ki-67 позволяет выделить клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла на всем протяжении (G1-,S-, G2^, М-фазы) [11].
—--—
~ 8 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Вестник представлен в научной электронной библиотеке (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—---
У животных контрольной группы после реакции на выявление Ю-67 положительно метились лишь отдельные клетки базального слоя эпидермиса, свидетельствуя о слабо выраженном
клеточном обновлении эпителиальных клеток. Большинство ядер эпителиоцитов окрашивались гематоксилином в синий цвет (рис.1).
Рис. 1. Иммуногистохимическое выявление белка Ю-67 (|) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 7-е сутки после введения физиологического раствора. До-
краска гематоксилином. Увел.х200.
После внутридермального введения крысам препарата гиалуроновой кислоты, начиная с 4-х суток опыта, цитокин Ю-67 выявлялся во многих клетках базального слоя эпителия, указывая на
интенсификацию процесса пролиферации. Наибольшей интенсивности процесс пролиферации достигал на 7-е сутки опыта (рис.2)
Рис. 2. Иммуногистохимическое выявление белка Ю-67 (|) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 7-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска гематоксилином. Увел.х400.
~ 9 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--—
На 21-е сутки в эпителиальном слое кожи белок Ю-67 экспрессировали лишь отдельные клетки базального слоя, цитокин интенсивно обнаруживался в клетках волосяных фолликул и фибробластического дифферона в сосочковом слое дермы под эпидермисом (рис.3), а также в яд-
рах эндотелиальных клеток стенок отдельных
кровеносных сосудов. На 37-е сутки после интер-дермального введения препарата гиалуроновой кислоты белок Ki-67 выявлялся в отдельных клетках эпителиального слоя и клетках волосяных луковиц.
Рис. 3. Иммуногистохимическое выявление белка Ki-67 (f) в ядрах пролиферирующих клеток (коричневое окрашивание) в коже крыс на 21-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска гематоксилином. Увел.х200.
Семейство факторов роста фибробластов включает 19 различных белков, являющихся потенциальными митогенами и стимуляторами ан-гиогенеза. Включая несколько путей внутикле-точной передачи сигналов FGF оказывают модулирующее влияние на внутриклеточные события: коммитирование клеток, их пролиферацию, диф-ференцировку, миграцию и апоптоз [6].
По результатам иммуногистохимической реакции на выявление FGF-1 в коже животных контрольной группы можно констатировать, что во все сроки опыта цитокин слабо экспрессиро-вался в цитоплазме лишь отдельных клеток (рис.4)
—--—
- 10 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Вестник представлен в научной электронной библиотеке (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—---
rr
/
Рис. 4. Иммуногистохимическое выявление FGF-1 (|) в цитоплазме клеток (коричневое окрашивание) на 21-е сутки после внутридермального введения физиологического раствора. Докраска гематоксилином. Увел.х200.
После внутридермального введения препарата гиалуроновой кислоты методом мезотерапии экспрессия FGF-1, наблюдалась на 4-е сутки и достигала максимума на 21-е сутки эксперимента. Фактор роста экспрессировался различными клетками: макрофагами, отдельными фибробла-стами, эндотелиальными клетками, перицитами.
Наиболее интенсивно в виде ярко-коричневого окрашивания он выявлялся в цитоплазме макрофагов (рис.5), которых было достаточно много в сосочковом слое непосредственно под эпителием, в фасциальной прослойке и вокруг кровеносных сосудов.
Рис. 5. Иммуногистохимическое выявление FGF-1 в цитоплазме клеток (коричневое окрашивание) в фасциальной прослойке и под эпидермисом кожи крысы на 21-е сутки после введения препарата гиалуроновой кислоты. Докраска гематоксилином. Увел.х200.
~ 11 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--—
Динамика показателей среднего количества клеток (в поле зрения при увел.Х400), экспрессирующих цитокин РСР-1 в коже крыс после введения препарата ГК
45 40
35 30 25 20 15 10 5 0
* #
s
У Jit ш
/ *
^ * 0 1 *
к. L и ШлШг
□ опытная группа ■ контрольная групп;
2 сутки 4 сутки
7 сутки 21 сутки 37 сутки сроки
Рис. 6. Диаграмма среднего количества клеток, экспрессирующих FGF-1 в коже крыс зрелого возраста после введения препарата нестабилизированной гиалуроновой кислоты. *) Р<0,05,
**)Р<0,001.
На 37-е сутки опыта количество клеток экспрессирующих фактор роста фибробластов снижалось и показатели приближались к контролю. Подсчет среднего количества клеток в поле зрения при увеличении х400, экспрессирующих FGF-1 после внутридермального введения препарата гиалуроновой кислоты, представленный на диаграмме, показывает, что наиболее высокая экспрессия выявляется на 21-е сутки опыта (рис.6)
Таким образом, результаты иммуногисто-химических исследовании с применением мо-ноклональных антител на выявление цитокинов Ю-67 и FGF-1 показывают, что внутридермальное введение методом мезотерапии крысам зрелого возраста препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты усиливает пролиферацию клеток эпителия кожи, фибробластов, эндо-телиальных клеток кровеносных сосудов, эпителиальных клеток волосяных фолликул.
Результаты наших исследований подтверждают данные литературы о стимулирующем действии гиалуроновой кислоты и фрагментов её деполимеризации на процессы пролиферации фибробластов и эндотелиальных клеток [1,4,5,7,8]. В то же время механизмы их действия требуют дальнейшего изучения.
Выводы: Внутридермальное введение препарата нативной высокомолекулярной гиалуро-новой кислоты методом мезотерапии животным зрелого возраста стимулирует в коже пролифера-тивные процессы клеток эпителия, фибробластов, эпителиальных клеток волосяных фолликул и эндотелия сосудов. Пик экспрессии антигена Ю-67 при этом приходится на 7-е сутки после инъекции препарата, а фактора роста фибробластов -1 на 21-е сутки.
~ 12 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Вестник представлен в научной электронной библиотеке (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--—
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Галлямова Ю.А., Баринова О.А. Структурные и функциональные параметры кожи лица до и после внутридермального введения гиалуроновой кислоты.// Росс.журнал кожных и венерических болезней. - 2012. - №2. - с.52-56.
[2] Иммуногистохимические методы: руководство/под ред. Г.А. Франка, П.Г. Малькова; пер. с англ. Н.В. Данилова, Л.В. Москвина, Н.М. Гай-фуллина. - М., 2011.-224 с.
[3] Марголина А., Эрнандес Е. Новая косметология. - М.: Ковель, 2005. - 424 с.
[4] Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалу-роновая кислота. - М.: Практическая медицина, 2012. - 224с.
[5] Чайковская Е.А., Шарова А.А. Гиалуроновая кислота и её фрагменты. Биологические функции в ракурсе фармакотерапии. // Инъекционные методы и композиции. - 2012. -№1.- с.9-16.
[6] Chen L., Deng C.X. Roles of FGF signaling in skeletal devolepment and Ruman genetic diseases. // Front. Biosci. - 2005. - №10. - P. 1961-1976.
[7] Fergusom E.L., Roberts J.L., Moseley R. et al. Evalu-tion of the physical and biological properties of hya-luronan and hyaluronan fragments. // Int. J. Pharm. -2011. - vol.420, №1. - P.84-92.
[8] Gao F., Liu Y., He Y. et al. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. // Matix. Bid. - 2010. - vol.29, №2. - P. 107-116.
[9] Sorrell M., Caplan A.I. Fibroblasts - a diverse population al the center of it all. // Int. Rev. Cell Molec. Boil. - 2009. - vol. 276. - P.161-204.
[10] Stern R., Maibach H.I. Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. // Clin. Dermatol. - 2008. - vol.26, №2. - P.1006-1022.
[11] Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. et al. Ki 67 in breast cancer: prognostic and predictive potencial // Lancet Oncod. - 2010. - vol.11, №2. - P.174-183.
PROLIFERATION OF SKIN CELLS WITH INTRADERMAL ADMINISTRATION OF HYALURONIC ACID TO EXPERIMENTAL ANIMALS
Galeeva1 A.G., Kamilov1 F.Ph., Kapuler2 O.M., Danilova3 O.V. 1Bashkir State Medical University, Ufa, Russian Federation. 2ZAO Kosmetologicheskaya lechebnitsa, Ufa, Russian Federation. 3Izhevsk State Medical Academy, Izhevsk, Russian Federation.
Annotation: The paper presents the results of studying the proliferation markers of the fibroblast-1 growth factor Ki-67 (FGF-1) in the skin of female rats of mature age (11-12 months) with intradermal mesotherapy with the preparation of native high-molecular hyaluronic acid (mol. Yes) immunohistochemical method using mouse polyclonal antibodies. It was found that hyaluronic acid stimulates the proliferation of fibroblasts, skin epithelial cells and hair follicles, and vascular endothelium. The maximum expression of the Ki-67 protein in this case occurs on the 7th day after the injection of hyaluronic acid, and FGF-1 on the 21st day.
Key words: Skin; Cell proliferation; Native high-molecular hyaluronic acid; Intradermal administration; Protein Ki-67; Fibroblast growth factor - 1.
~ 13 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--—
REFERENCES
[1] Gallyamova Yu.A., Barinova O.A. Structural and functional parameters of the facial skin before and after intradermal administration of hyaluronic acid. // Ross.journal of skin and venereal diseases, 2012, № 2, pp. 52-56. (in Russian)
[2] Immunohistochemical methods: guidance / ed. G.A. Frank, P.G. Malkova; Translation from English. N.V. Danilova, L.V. Moskvina, N.M. Gaifullin, M., 2011, 224 p. (in Russian)
[3] Margolina A., Hernandez E. New Cosmetology. -Moscow: Kovel, 2005, 424 p. (in Russian)
[4] Khabarov V.N, Boykov P.Ya., Selyanin M.A Hyaluronic acid. M.: Practical medicine, 2012, 224 p. (in Russian)
[5] Chaikovskaya E.A., Sharova A.A. Hyaluronic acid and its fragments. Biological functions in the perspective of pharmacotherapy. // Injection methods and compositions, 2012, № 1, pp. 9-16. (in Russian)
[6] Chen L., Deng C.X. Roles of FGF signaling in skeletal devolution and Random genetic diseases. // Front. Biosci, 2005, № 10, pp. 1961-1976.
[7] Fergusom E.L., Roberts J.L., Moseley R. et al. Evaluation of the physical and biological properties of hyaluronan and hyaluronan fragments. // Int. J. Pharm, 2011, vol. 420, № 1, рр. 84-92.
[8] Gao F., Liu Y., He Y. et al. Hyaluronan oligosaccharides to promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. // Matix. Bid, 2010, vol. 29, № 2, рр. 107-116.
[9] Sorrell M., Caplan A.I. Fibroblasts - a diverse population. // Int. Rev. Cell Molec. Boil, 2009, vol. 276, рр. 161-204.
[10] Stern R., Maibach H.I. Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. // Clin. Dermatol, 2008, vol. 26, № 2, рр. 1006-1022.
[11] Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. Et al. Ki 67 in breast cancer: prognostic and predictive potencial // Lancet Oncod, 2010, vol. 11, № 2, рр. 174-183.
—--—
~ 14 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ ЭЛ № ФС77-50518 Вестник представлен в научной электронной библиотеке (НЭБ) — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
