CC BY
29
УДК 531/534: [57+61]
Российский
Журнал
Биомеханики
www.biomech.ru
ОБ УЧЕТЕ ФОРМЫ СВОБОДНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОСТИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ
М.С. Куюкина1, И.Б. Ившина1, М.А. Осипенко2, Ю.И. Няшин2, А.Н. Тюленёва2,
М.К. Серебренникова3
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: kuyukina@iegm.ru
2 Кафедра теоретической механики Пермского государственного технического университета, Россия, 614990, Пермь, Комсомольский проспект, 29, e-mail: oma@theormech.pstu.ac.ru
3 Кафедра микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, Россия, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Аннотация. Моделируется процесс иммобилизации бактерий рода Rhodococcus на твердом носителе, представляющем собой гидрофобизованные хвойные опилки, в жидкой среде при различных гидродинамических условиях. Теоретически описана форма свободной поверхности жидкой среды, зависящая от значения круговой частоты движения платформы орбитального шейкера. С учетом полученного уравнения поверхности жидкости модифицирована разработанная ранее кинетическая модель иммобилизационного процесса. Произведено уточненное теоретическое вычисление вероятности иммобилизации свободной бактериальной клетки при столкновении с частицей носителя.
Ключевые слова: бактериальные клетки, Rhodococcus, иммобилизация, твердый носитель, круговая частота движения, форма свободной поверхности жидкости, математическое моделирование.
Введение
Сегодня наиболее разрабатываемой в биотехнологическом отношении группой актинобактерий являются представители рода Rhodococcus, осуществляющие процессы окислительной трансформации природных и антропогенных углеводородных соединений [8]. В частности, родококки синтезируют поверхностно-активные трегалозолипиды (биосурфактанты), аминокислоты, витамины, ферменты и катализируют реакции стереоселективного окисления фенилметилового сульфида (тиоанизола) и его гомологов в соответствующие (R)- или (^-сульфоксиды, применяемые в химической и фармацевтической промышленности [7, 9]. Представители отдельных видов родококков (R. ruber, R. erythropolis, R opacus) -активные биодеструкторы нефтяных углеводородов и других ксенобиотиков [1, 2]. Типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста родококков, способность
© Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Тюленёва А.Н., Серебренникова М.К., 2009
Куюкина Мария Станиславовна, д.б.н., в.н.с. лаборатории алканотрофных микроорганизмов, Пермь Ившина Ирина Борисовна, д.б.н., чл.-корр. РАН, зав. лабораторией алканотрофных микроорганизмов, Пермь
Осипенко Михаил Анатольевич, к.ф.-м.н., доцент кафедры теоретической механики, Пермь Няшин Юрий Иванович, д.т.н., профессор, зав. кафедрой теоретической механики, Пермь Тюленёва Анастасия Николаевна, аспирант кафедры теоретической механики, Пермь Серебренникова Марина Константиновна, магистрант кафедры микробиологии и иммунологии, Пермь
усваивать многие труднодоступные для других микроорганизмов органические субстраты, расти на минимальных средах и при экстремальных условиях делают использование этой группы микроорганизмов технологически перспективным [3].
В последние годы особое внимание в практике биотехнологии придается методам интенсификации микробиологических процессов путем иммобилизации клеток микроорганизмов. Для иммобилизации клеток алканотрофных родококков авторами успешно используется органический носитель на основе хвойных опилок, гидрофобизованных смесью олифы и Rhodococcus-биосурфактанта [6]. Разработана многоцелевая биокаталитическая система на основе иммобилизованных родококков, по основным технологическим параметрам (физико-химическим характеристикам, числу жизнеспособных бактериальных клеток, функциональной активности и стабильности при хранении и многократном использовании) отвечающая требованиям промышленной биотехнологии. Возможное применение разработанной биокаталитической системы заключается в получении практически ценных продуктов биосинтеза на углеводородном сырье, биоремедиации загрязненных нефтью и нефтепродуктами экосистем, производстве биологически активных интермедиатов для фармацевтической промышленности [10].
Для создания оптимальной технологической схемы и подбора эффективного режима иммобилизации бактериальных клеток необходимо построение математических моделей, адекватно описывающих данный процесс. Ранее авторами [4] построена согласующаяся с экспериментальными данными кинетическая модель процесса иммобилизации клеток родококков на твердом органическом носителе, учитывающая гидродинамические условия. Однако в построенной модели поверхность жидкой иммобилизационной среды в колбе, находящейся на движущейся платформе орбитального шейкера, условно предполагалась плоской. Фактически же поверхность жидкости не является плоской, она имеет более сложную геометрическую форму и при достаточно большой частоте движения платформы пересекается с дном колбы. В связи с этим, целью настоящей работы являлся учет формы свободной поверхности жидкости в рамках модифицированной модели процесса иммобилизации клеток родококков на твердом носителе.
Описание модели процесса иммобилизации бактериальных клеток
Экспериментальная установка и условия проведения процесса иммобилизации клеток родококков на гидрофобизованных древесных опилках описаны ранее в работе
[4]. Иммобилизация осуществляется в 250-миллилитровых колбах Эрленмейера, закрепленных на платформе орбитального шейкера. Горизонтальная платформа шейкера движется поступательно таким образом, что все ее точки описывают окружности радиусом l с постоянной круговой частотой движения ш . Схематично колба может быть представлена в виде цилиндра с радиусом основания R, поскольку содержимое колбы занимает лишь небольшую часть ее объема. Высота жидкости при неподвижной платформе шейкера равна H (рис. 1).
В колбе находятся жидкость, частицы твердого носителя и клетки родококков. В начальный момент времени все бактериальные клетки находятся в свободном состоянии. С течением времени происходят процессы 1) иммобилизации свободных клеток, 2) десорбции иммобилизованных клеток с поверхности частиц носителя (с переходом их в свободные клетки) и 3) распада клеточного мицелия на короткие палочковидные формы. Последний процесс обусловлен особенностями морфогенетического цикла родококков, представленного чередованием стадий
Рис. 1. Фотография и схематическое изображение основной части экспериментальной установки
коротких палочковидных клеток - ветвящегося клеточного мицелия - распада клеточного мицелия вновь на короткие палочковидные формы [3].
В зависимости от значения круговой частоты ш свободная поверхность жидкости в процессе перемешивания принимает различную форму. Качественно имеют место три варианта формы поверхности, описанные ниже.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМЫ СВОБОДНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОСТИ
Перейдем в подвижную (неинерциальную) систему отсчета Oxyz (рис. 1). Начало координат находится в центре основания колбы, ось х параллельна подводящим стержням A и B (см. рис. 1). В этой системе отсчета колба вращается с угловой скоростью ш, а поле сил инерции является стационарным. Будем считать жидкость идеальной, тогда вращение колбы не приводит к движению жидкости. Поэтому для определения формы поверхности жидкости можно использовать уравнение гидростатики [5]
^grad P = g - ae, (1)
P
где p - плотность жидкости, P - давление, g - ускорение свободного падения, ae = -(2(x -1),ш2y,0- - переносное ускорение частиц жидкости. Из (1) находим
P(x,y, z- = р(ш2 (x2 + y2 -2lx-y/2 - gz- +const. (2)
Из (2) и условия постоянства давления на свободной поверхности жидкости получаем уравнение поверхности
2
z(x, y, C) = Ш (x2 + y2 - 2lx- + C . (3)
2 gv ’
Постоянная C определяется по заданному объему V = kR2 H жидкости из уравнения
JJ z2x,y,C-dxdy = V, (4)
D (C)
где область интегрирования D(C) = {x2 + y2 < R2} I {z(x, y, C) > 0} .
Из (3) и (4) можно установить, что существуют два критических значения ос1 и
ОС 2 круговой частоты, имеющие следующий смысл. Если о<ос1, то свободная поверхность жидкости не пересекает дна колбы (область D - круг радиусом R, рис. 2). Если ос1 <о <ос2, то свободная поверхность пересекает дно колбы с образованием “сухого” круга (область D - круг радиусом R, из которого исключен другой круг, см. рис. 2). Если о > ос2, то “сухой” участок контактирует со стенками колбы (область
D - круг радиусом R, из которого исключена часть другого круга, см. рис. 2). Для о с1 и ос2 можно получить выражения:
О2 = 4 gH О2 = 4 gH (5)
Ос1 = R2(1 + 2a2), с2 = R2a2 (2 + (2-a)2) °
где a = l/R < 1.
Численные значения параметров: R = 4,8 см (это значение уточнено по
сравнению со значением, принятым в [4]), V = 50 см3, l = 1,25 см. Для этих значений из
(5) находим ос1 = 97 • 2п рад/мин, ос 2 = 177 • 2п рад/мин.
На рис. 3 показаны найденные численно из (3), (4) формы свободной поверхности жидкости при четырех различных значениях частоты движения платформы орбитального шейкера. Серым цветом показано дно колбы.
На рис. 4, а приведена экспериментальная фотография свободной поверхности жидкости для о = 160 • 2п рад/мин. На рис. 3, в показана теоретически найденная форма поверхности для этого значения ю. Сопоставление экспериментальной и теоретической форм проведено на рис. 4, б. Имеется удовлетворительное совпадение теории и эксперимента.
Модификация модели процесса иммобилизации с учетом формы поверхности
ЖИДКОСТИ
Основным результатом ранее разработанной кинетической модели [4] является определение теоретической зависимости средней концентрации свободных бактериальных клеток от времени.
ns(t)=1+T Л°/T () 2T xd т)+exp (-(vт(о)+vTd(о)) 0)x
1+Ti(о)/ Td(o)
x( ^) - (K T) -1) exp (- tjTf (o ) )), (6)
где ns0 - концентрация свободн^іх клеток в начальный момент времени,
Рис. 2. Область D при различных значениях круговой частоты ю
Рис. 3. Теоретические формы свободной поверхности жидкости при различных частотах движения платформы орбитального шейкера: (а) ю = 60-2п рад/мин,
(б) ю = 110-2п рад/мин, (в) ю = 160-2п рад/мин, (г) ю = 210-2п рад/мин
Т (ш) - характерное время иммобилизации, Тл (ш) - характерное время, за которое клетка будет десорбирована с поверхности частицы носителя, К > 1 - кратность распада клеточного мицелия, - характерное время распада. Для величины Т (ю)
найдено выражение
гг, л 4((ш) + 1/а*(ш)) V1-ехР(-ас(ш))}(!-ехР(-а*(ш)))
Т (ш) =-------------------------------------------------------, (/)
£пс шЯр(ш) 1 - ехр(-ас (ш) - а* (ш))
где
\2%У ( Р/ Л , ,= \2%У
пш2 Я 4
ас(ш) = 1 , а*(ш) = —^- 1 -^ , (8)
Рс ) пш Я ^ Р*)
Р/ - плотность жидкости, рс - плотность частицы носителя, р* - плотность свободной бактериальной клетки, пс - средняя (по объему жидкости в колбе) концентрация частиц носителя, £ - площадь поверхности частицы носителя, р(ш) - вероятность иммобилизации свободной клетки при ее столкновении с частицей носителя.
Сопоставляя (6) с экспериментальными данными, можно найти Т (ш) и далее из (7), (8) теоретически найти р(ш), что было сделано в [4]. Однако соотношение (7)
справедливо только для плоской поверхности жидкости. Это соотношение было
модифицировано с учетом найденной выше формы поверхности. Соответствующая модификация выглядит следующим образом:
Т (ш) = 4 (Vас (ш) + Vа* (ш)) . 3 (ас (ш)) 3 (а* (ш)) (9)
1 БпсшЯр(ш) 3(ас (ш) + а* (ш)) ,
где
3(а) = — ехр(- аг/И) ёхёуёг, (10)
У А(ш)
А(ш) - область, занятая жидкостью в колбе.
а б
Рис. 4. Сравнение теоретически полученной формы поверхности жидкости (б) с экспериментальной формой ((а) и (б)) при значении круговой частоты ю=160-2л рад/мин
Вероятность иммобилизации бактериальной клетки при столкновении с частицей носителя
№ п/п ю, рад/мин р (без учета формы поверхности жидкости) р (с учетом формы поверхности жидкости)
1 60-2л 1,210-7 2,1-10-7
2 110-2л 1,9-10-8 2,8-10-8
3 160-2л 2,3-10-8 3,0-10-8
4 210-2л 5,7-10-8 6,8-10-8
С помощью модифицированных формул (9), (10) численно найдены значения вероятности иммобилизации р(ю) одной бактериальной клетки. При этом
принимались следующие значения параметров: р1 = 1,0 г/см 3, рс = 0,6 г/см 3,
р^ = 1,2 г/см 3, S = 10 мм 2, пс = 40 см -3 (остальные численные значения приведены
выше). Результаты расчетов приведены в таблице, где сопоставлены значения р, полученные из (7) (то есть без учета реальной формы поверхности жидкости; они несколько отличаются от результатов [4], что вызвано упомянутым выше уточнением значения К), и значения, полученные из (9), (10) (с учетом формы поверхности).
Из таблицы видно, что учет формы поверхности жидкости в колбе приводит к увеличению значения р; это увеличение более выражено при малых значениях ю.
Заключение
В данной работе теоретически описана форма свободной поверхности жидкой иммобилизационной среды в зависимости от значения круговой частоты движения платформы орбитального шейкера. Теоретический результат сопоставлен с экспериментальными наблюдениями, и получено удовлетворительное согласие.
С учетом формы поверхности жидкости модифицирована ранее разработанная
кинетическая модель процесса иммобилизации клеток родококков на твердом носителе. Произведено уточненное теоретическое вычисление экспериментально не определяемого параметра - вероятности иммобилизации одной свободной бактериальной клетки при столкновении с частицей носителя.
Благодарности
Исследования поддержаны грантами Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-4112.2008.4) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Список литературы
1. Ившина, И.Б. Применение экологически безопасной экспресс-технологии очистки
нефтезагрязненных почв и грунтов (на примере районов нефтедобычи Пермской области) / И.Б. Ившина, М.С. Куюкина, С.М. Костарев // Нефтяное хозяйство. - 2003. - № 9. - С. 116-118.
2. Ившина, И.Б. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции не пригодных к
использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева,
Л.А. Чекрышкина, И.И. Мишенина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - № 4. -
С. 443-447.
3. Ившина, И.Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, Л.В. Зверева, Л.В. Рыбалка, Е.А. Еловикова // Микробиология. -1995. - Т. 64, № 4. - С. 507-513.
4. Куюкина, М.С. Кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.А. Осипенко, Ю.И. Няшин, А.Н. Тюленева, М.К. Серебренникова, А.В. Криворучко // Российский журнал биомеханики. - 2007. - Т. 11, № 2. -С. 79-87.
5. Ландау, Л.Д. Гидродинамика / Л.Д. Ландау, Е.М. Лифшиц. - М.: Наука, 1988.
6. Пат. 2298033 РФ. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, способ получения носителя и носитель иммобилизованных микроорганизмов / Подорожко Е.А., Куюкина М.С., Ившина И.Б., Филп Д.К., Лозинский В.И.; опубл. 27.04.07.
7. Толстиков, А.Г. Энантиоселективное биокаталитическое окисление органических сульфидов в хиральные сульфоксиды / А.Г. Толстиков, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Современные проблемы асимметрического синтеза; УрО РАН. - Екатеринбург. - 2003. - С. 165-205.
8. Ivshina, I.E. Operation and establishment of a Russian biological resource centre / WFCC Newsletter. -2001. - Vol. 33. - P. 8-14.
9. Kuyukina, M.S. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl-tertiary butyl ether extraction / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, J.C. Philp, N. Christofi, S.A. Dunbar, M.I. Ritchkova // Journal of Microbiological Methods. -2001. - Vol. 46. - P. 149-156.
10. Kuyukina, M.S. Petroleum-contaminated water treatment in a fluidized-bed bioreactor with immobilized Rhodococcus cells / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.K. Serebrennikova, A.V. Krivorutchko, E.A. Podorozhko, R.V. Ivanov, V.I. Lozinsky // International Biodeterioration & Biodegradation. - 2009. -Vol. 63. - P. 427-432.
MODELLING OF THE BACTERIAL CELL IMMOBILIZATION PROCESS ON A SOLID CARRIER TAKING INTO ACCOUNT THE LIQUID FREE-SURFACE SHAPE
M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.A. Osipenko, Y.I. Nyashin, A.N. Tyulenyova,
M.K. Serebrennikova (Perm, Russia)
The process of Rhodococcus bacteria immobilization on a solid carrier, namely hydrophobized pine sawdust, in a liquid medium under various hydrodynamic conditions is modeled. The shape of liquid free surface is theoretically described, which depends on the cyclic frequency of the orbital shaker platform motion. Taking into account the liquid free-surface equation obtained, we modified the immobilization kinetic model previously developed. Amended theoretical calculation of the probability of suspended bacterial cell immobilization upon cell collision with the carrier particle was performed.
Key words: bacterial cells, Rhodococcus, immobilization, solid carrier, cyclic frequency of motion, liquid free surface shape, mathematical modelling.
Получено 08 июня 2009
