CC BY
42
УДК 531/534:[57+61]
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ АКТИНОБАКТЕРИЙ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ С ПСЕВДООЖИЖЕННЫМ СЛОЕМ
М.С. Куюкина1, 2 3, И.Б. Ившина1, 2 ,3,
М.К. Серебренникова1, М.А. Осипенко3, Ю.И. Няшин3
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]
2 Кафедра микробиологии и иммунологии Пермского государственного национального исследовательского университета, Россия, 614900, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected]
Кафедра теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета, Россия, 614990, Пермь, Комсомольский проспект, 29, e-mail: [email protected]с.ru
Аннотация. В работе представлены результаты экспериментального исследования и теоретического анализа процесса иммобилизации актинобактерий на гидрофобизованных биосурфактантом хвойных опилках в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем, формирующимся за счет высокой скорости (0,6-2,8 мл/мин) подачи бактериальной суспензии. Для поддержания опилок в рабочей зоне использовали расположенный на входе в биореактор фильтр из кварцевого стекла, который также позволял поддерживать однородную структуру носителя без прохождения воздушных пузырьков и снизить их вклад в формирование псевдоожиженного слоя. Процесс иммобилизации родококков контролировали по изменению показателя оптической плотности содержащейся в колбе бактериальной суспензии. При средней скорости подачи суспензии в биореактор процесс иммобилизации характеризовался равномерным снижением показателя оптической плотности в течение всего периода эксперимента. В то же время при минимальной и максимальной скоростях наблюдалось увеличение контролируемого показателя после 96 и 120 ч эксперимента соответственно. С течением времени в биореакторе происходят процессы иммобилизации свободных клеток, десорбции иммобилизованных клеток с поверхности частиц носителя с их последующим переходом в свободное состояние и распада клеточного мицелия на короткие палочковидные формы. Получена задача Коши для кинетических уравнений относительно зависимостей от времени концентраций свободных и иммобилизованных клеток. Установлено, что рассчитанные на основе разработанной математической модели показатели иммобилизации для четырех исследуемых скоростей подачи суспензии в биореактор согласуются с полученными экспериментальными данными. Предложенная математическая модель может быть использована для оптимизации кинетических параметров иммобилизационного процесса в биореакторе при его последующем масштабировании.
Ключевые слова: актинобактерии, иммобилизация, биореактор, псевдоожиженный слой, биомеханическая модель.
© Куюкина М. С., Ившина И.Б., Серебренникова М.К., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., 2012 Куюкина Мария Станиславовна, д.б.н., в.н.с. лаборатории алканотрофных микроорганизмов, профессор кафедры микробиологии и иммунологии, профессор кафедры теоретической механики, Пермь Ившина Ирина Борисовна, д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН, завлабораторией алканотрофных микроорганизмов, профессор кафедры микробиологии и иммунологии, профессор кафедры теоретической механики, Пермь
Серебренникова Марина Константиновна, аспирант института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Осипенко Михаил Анатольевич, к.ф.-м.н., доцент кафедры теоретической механики, Пермь Няшин Юрий Иванович, д.т.н., профессор, завкафедрой теоретической механики, Пермь
ВВЕДЕНИЕ
Интенсификация микробиологических процессов очистки промышленных сточных вод является одной из задач экологической биотехнологии, решение которой предусматривает использование иммобилизованных на носителе микроорганизмов (биокатализаторов) и биореакторов различного типа. Иммобилизация позволяет поддерживать высокую плотность активной биомассы и многократно использовать микробные клетки, способствует их адаптации к залповому поступлению загрязняющих веществ и повышению каталитической мощности, а также снимает необходимость отделять биомассу от реакционной среды [3, б, 8]. В качестве носителя для иммобилизации актинобактерий рода Rhodococcus, имеющих гидрофобную клеточную стенку, авторами используются гидрофобизованные Rhodococcus-биосурфактантом хвойные опилки [5].
Использование биореакторов усовершенствованных конструкций дает возможность регулировать и подбирать оптимальный рабочий режим с целью повышения эффективности осуществляемых биотехнологических процессов. Среди большого количества разнообразных типов реакторов широкое применение в очистке загрязненных вод получили биореакторы с псевдоожиженным слоем (fluidized-bed bioreactors) [9]. Их конструкция позволяет увеличивать время удержания
биокатализатора внутри реакторного блока в условиях постоянного водного потока, равномерно распределять жидкость между носителем с закрепленными клетками, избегать значительных перепадов давления по высоте реактора, использовать конструкции небольших размеров, не требует применения дополнительных систем аэрации [10, 11]. Кроме того, подвижность носителя с иммобилизованными микроорганизмами в водной фазе биореактора с псевдоожиженным слоем обеспечивает более активный, чем в реакторах с неподвижным слоем, теплообмен и массоперенос, что, в свою очередь, приводит к выравниванию температуры по всему объему реактора, возрастанию скорости и увеличению эффективности биотехнологических процессов [1].
С целью оптимизации режима работы биореактора применяются математические модели, позволяющие подбирать оптимальные технологические параметры и прогнозировать эффективность микробиологических процессов. Следует отметить, что процессы, протекающие в биореакторах с псевдоожиженным слоем катализатора, являются одними из сложных объектов для математического
моделирования. Это связано с тем, что псевдоожиженный слой представляет собой сложную дисперсную систему, в которой возникают самоорганизующиеся
коагрегированные частицы [7]. Кроме того, ограничено число параметров, которые можно измерить непосредственно в биореакторе: плотность носителя, частота
колебания плотности частиц, изменение скорости потока по высоте биореактора. Поэтому наиболее часто используемый для описания таких процессов подход основан на получении одномерных временных данных. При этом псевдоожиженный слой катализатора рассматривается как единое целое, где перемешивание частиц по всей его высоте считается идеальным, а их распределение - равномерным [4]. В данной работе представлены результаты экспериментального и теоретического исследования процесса иммобилизации клеток родококков на твердом органическом носителе -
гидрофобизованных хвойных опилках, в биореакторе с псевдоожиженным слоем.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ АКТИНОБАКТЕРИЙ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ
Для экспериментального изучения процесса иммобилизации актинобактерий использовали колоночный биореактор (рис. 1), рабочие параметры которого приведены в табл. 1.
Z
Я
О
Рис. 1. Экспериментальная установка для изучения процесса иммобилизации клеток родококков: 1 - суспензия клеток родококков; 2 - перистальтический насос; 3 - колоночный биореактор
Таблица 1
Рабочие параметры колоночного биореактора
Параметр Значение Параметр Значение
Объем биореактора, см3 43,2 Концентрация частиц носителя, мм-3 0,1
Высота рабочей зоны, см 14 Площадь поверхности частицы, 2 мм 10
Радиус рабочей зоны, см 0,7 Общая площадь поверхности носителя, см2 55,3
Масса носителя, г 2,0 Концентрация биомассы, кл/мл 2,0^ 107
Размер частиц носителя, см 0,1-0,3 Соотношение R. ruber : R. opacus 1:1
Скорость подачи бактериальной суспензии, мл/мин 0,6; 1,2; 2,0; 2,8
Биореактор представлял собой стеклянную колонку, заполненную стерильными гидрофобизованными хвойными опилками. Для их поддержания в рабочей зоне использовали расположенный на входе в биореактор фильтр из кварцевого стекла, который также позволял поддерживать однородную структуру носителя без прохождения воздушных пузырьков и снизить их вклад в формирование псевдоожиженного слоя. При помощи силиконовых трубок колонка соединялась с колбой, содержащей суспензию (200 мл) бактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 615 и Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 из региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains.html), взятых в равных соотношениях. Бактериальная суспензия из колбы подавалась в биореактор с помощью перистальтического насоса через нижнюю часть реактора в восходящем направлении и, пройдя через слой носителя, через его верхнюю часть возвращалась обратно в колбу. За счет высокой скорости (1,2-2,8 мл/мин) подачи бактериальной суспензии в биореакторе формировался псевдоожиженный слой, омывающий каждую частицу носителя, в результате чего увеличивалась вероятность адсорбции клеток на их поверхности.
Рис. 2. Кинетика иммобилизации актинобактерий на гидрофобизованных опилках в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем при средней (а) и минимальной / максимальной (б) скорости подачи бактериальной суспензии, мл/мин:
(о) - 0,6; (0) - 1,2; (+) - 2,0; (□) - 2,8. Сплошные линии - теоретические зависимости
Процесс иммобилизации родококков контролировали по изменению показателя оптической плотности (ОП 600 нм) содержащейся в колбе бактериальной суспензии с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США). Отбор образцов проводили ежедневно в течение 7 суток. Все эксперименты осуществляли в трех повторностях.
На рис. 2 точками показано измеренное изменение показателя оптической плотности клеточной суспензии от времени при различных скоростях ее подачи в колоночный биореактор. Как видно из рис. 2, процесс иммобилизации родококков при средней скорости (1,2-2,0 мл/мин) подачи суспензии в биореактор характеризовался равномерным снижением показателя оптической плотности в течение всего периода эксперимента. В то же время при минимальной (0,6 мл/мин) и максимальной (2,8 мл/мин) скорости наблюдалось увеличение контролируемого показателя после 96 и 120 ч эксперимента соответственно. В случае минимальной исследуемой скорости такое увеличение может быть обусловлено коагрегацией бактерий в нижней части биореактора с последующим их вымыванием. Коагрегация клеток вызвана тем, что скорость подачи суспензии 0,6 мл/мин недостаточно высока для формирования псевдоожиженного слоя, в результате этого частицы носителя оставались неподвижными и плотно уложенными, что препятствовало равномерному распределению адсорбирующихся бактериальных клеток между ними. Наблюдаемое повышение показателя оптической плотности суспензии родококков в случае высокоскоростного режима (2,8 мл/мин) работы биореактора может быть обусловлено механическим повреждением и выносом материала носителя из реактора из-за интенсивного движения частиц в псевдоожиженном слое, а также фрагментацией клеточного мицелия, являющейся особенностью морфогенетического цикла родококков.
Для выяснения общих тенденций и закономерностей протекания процесса иммобилизации актинобактерий при заданных значениях скорости подачи бактериальной суспензии в колоночный биореактор проведен теоретический анализ полученных экспериментальных данных методом биомеханического моделирования.
Биомеханический анализ процесса иммобилизации актинобактерий
В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ С ПСЕВДООЖИЖЕННЫМ СЛОЕМ
Представим схематично рабочую зону биореактора в виде цилиндра высотой Н (см. рис. 1) и радиусом основания Я. В цилиндре располагаются частицы носителя, а в колбе - суспензия клеток родококков, в начальный момент времени находящихся в свободном состоянии. Перистальтический насос прокачивает клеточную суспензию по замкнутому контуру. Обозначим скорость подачи суспензии через ф; тогда скорость
движения жидкости в цилиндре V = фф(пЯ2) . Для описания происходящих процессов
применим подход, изложенный в работе [2].
Учитывая, что с течением времени в биореакторе происходят процессы: (1) иммобилизации свободных клеток, (2) десорбции иммобилизованных клеток
с поверхности частиц носителя с их последующим переходом в свободное состояние и (3) распада клеточного мицелия на короткие палочковидные формы, изменение концентрации свободных (п) и иммобилизованных (п) клеток можно записать следующим образом:
Лпг (О/л = о«(0+о^(0+А(3)(0, (1)
Спг (1) / сИ = О(1) (1) + О(2) (1) + О(3) (1), (2)
где О^Ц), £><•«(/) (] = 1, 2, 3 ) - скорости изменения соответственно п3 (1) и п (1) за
счет каждого из трех процессов. Найдем О^)(1) , О^^)(1) . Допустим, что за бесконечно
малый промежуток времени Л с частицей носителя столкнутся свободные клетки родококков, находящиеся в прилегающем к «одной стороне» частицы слое жидкости толщиной vdt, следовательно, с данной частицей столкнутся Svns (1 )Л / 2 свободных клеток, где £ - площадь поверхности частицы. Обозначим через р(у) вероятность иммобилизации свободной клетки при ее столкновении с частицей носителя. Тогда за промежуток времени количество свободных клеток уменьшится на
(Svns (1 )С1 /2)р^)пспЯ2Н , где пс - концентрация частиц носителя. Отсюда следует, что
А(1)0) = -^П 0) Р(У)пс/2 . (3)
Очевидно, что
О'п«) = -П^). (4)
Пусть вероятность десорбции иммобилизованной клетки за промежуток времени равна / Та (V), где Та (V) - среднее время, за которое клетка будет десорбирована от
частицы носителя; тогда
О(21(0 = МО/ад, (5)
О<Г)«) = -О</>«). (6)
Будем считать, что О>(3)(1), О}3)(1) пропорциональны соответственно концентрациям ^ 0) и П 0):
оР)(1 )=“0к о^ (7)
О?’«) = а^ )п (t), (8)
1ББМ 1812-5123. Российский журнал биомеханики. 2012. Т. 16, № 4 (58): 83-91 87
где коэффициент а(1) выбирается из следующих соображений. Пусть из трех перечисленных выше процессов имеет место только процесс распада клеточного
мицелия; тогда из (1) и (7) следует, что п:! (1) = п:! (0)ехр а(т)Ст| и аналогично для
П (1). Будем считать, что процесс распада мицелия, сопровождающийся увеличением числа клеток, происходит по закону п!1 (1) = п!1 (0) • (К(V) - (К(V) - 1)ехр(-1 / Т/- (V))), где К > 1 - кратность распада, Т/ - характерное время распада. Тогда
с
а0, = —1п (К( - (К(v) -1) ехР (- (Т/ (v))).
(9)
При 1 = 0 иммобилизованные клетки отсутствуют, а концентрация свободных клеток равна начальному значению п,0. Тогда, подставляя (3)-(8) в (1) и (2), получим следующую задачу Коши для кинетических уравнений относительно функций п, (1) и
п 0):
0) / л = -п, 0) / Т (v)+п 0) / Тс (v)+а(1, 0),
Сп (1) / = п, (1) / Т (V) - п (1) / Та (V) + а(1, v)nг (1),
п(0) = п 0,
п (0) = 0,
(10)
где
Из (10) и (9) находим п, 0) =
п
,0
Т 00 = 2/ (£пс^р(У)).
- К(IТс(v)+ехр (- (КТ (v)+VТл оо) 0)х
(11)
1 + Т (V)/ Тс (V)
х (К (- ( к (v) -1) ехр (- ут/ о;>)).
(12)
Из (10) можно найти теоретическое значение степени иммобилизации С клеток родококков: С = п (+го)/(п; (+ю) + п,(+ю)) = Та / (Тс + Т). Кроме того, зная Т(V) , из уравнения (11) можно найти р(^).
Оценим теперь зависимость п, и п от точки пространства, т.е. от координаты г (см. рис. 1): п,(г, 1) и п(г, 1) . Пусть из упомянутых выше трех процессов происходит только иммобилизация свободных клеток. Тогда значение п, (г, 1 ) определяется
переносом свободных клеток из точки с координатой г - vdt и иммобилизацией свободных клеток в точке с координатой г (см. (1)):
п (г
(г, 1 ) = п:! (г - vdt, 1) - О(рС1.
где (см. (3), (11))
Из (13), (14) находим
о;11 = -п, (г, t)/Т.
дп, / + vдn, / дг + п, / Т = 0 .
(13)
(14)
(15)
Пусть в начальный момент времени в цилиндре не было свободных клеток, а из колбы поступает клеточная суспензия с постоянной концентрацией п50 свободных клеток. Тогда
п3 (г, 0) = 0 при 0 < г < Н , п3 (0,1) = п30 при 1 > 0. (16)
Решение уравнения (15) с дополнительными условиями (16) имеет вид
( .) К0ехР(-г /(УТ1)) при 0 < г < *, (17)
п5 (г, о ЧЛ , (17)
[0 при г > VI.
Так как в рассматриваемом случае 5пг. / д1 = пп / Т (см. (10)) и ц (г,0) = 0 при 0 < г < Н, то из (17) находим
( а \п*0(1_г/^>ехр(_г/(^)) при 0 < г ^ (18)
Щ(z, 0 Ч0 > , (18)
[0 при г > VI.
Из (17) и (18) следует, что если Н/)«1 и 1»Н¡V, то п8 (г, 1) и п (г, I) слабо зависят от г. Из табл. 2 (см. ниже) следует, что Н/) < 0,0 1 и первое из выписанных выше неравенств выполнено. Поскольку Н¡V < 36 мин, а измерения продолжаются 7 сут., то второе из выписанных выше неравенств выполнено в течение практически всего промежутка измерений. Таким образом, вполне правомерно пренебречь зависимостью п8 и п от г, как это и сделано выше. Следует, однако, заметить, что при I ~ Н¡V неравномерность распределения п по 2 наблюдается экспериментально по изменению цвета содержимого цилиндра.
Сопоставление экспериментальных и теоретических данных
Теоретическая формула (12) сопоставлялась с экспериментально измеренными значениями п3 (1) (в единицах ОП 600 нм, рис. 2) в диапазоне значений ф от 0,6 до
2,8 мл/мин. В формуле (12) п80 = 1ОП600нм, а параметры Т , Та, К и Ту находились
методом наименьших квадратов. При этом получено, что К = 1 (не обнаруживается распада клеток), и тогда значение Ту определить невозможно. Найденные значения Т
и Та приведены в табл. 2. Величина р вычислена по формуле (11), где £ = 10 мм ,
_3
пс = 0,1 мм (см. табл. 1). Соответствующие теоретические кривые показаны на рис. 2.
Как видно из рис. 2, теоретические зависимости показателя оптической плотности от времени качественно совпадают с экспериментальными данными.
Таблица 2
Теоретически найденные параметры процесса иммобилизации
ф, мл/мин 0,6 1,2 2,0 2,8
Т, ч 49 210 73 41
ч 40 140 73 53
р 1,8-Ю-4 2,110-5 3,5-10-5 4,5-10-5
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная модель адекватно описывает основные черты протекания иммобилизационного процесса и допускает дальнейшее развитие, которое может состоять в теоретическом описании ряда вышеупомянутых явлений, приводящих к немонотонностям в исследуемых зависимостях.
Заключение
Проведено экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации актинобактерий на твердом носителе при различных скоростях подачи бактериальной суспензии в колоночный биореактор. Установлено, что рассчитанные на основе математической модели показатели ns (t) для четырех исследуемых скоростей
подачи клеточной суспензии в биореактор согласуются с экспериментальными данными. Разработанная модель является перспективной и допускает дальнейшее развитие, которое может заключаться в учете большего количества экспериментальных данных и в более детальном исследовании функций ns (z, t) и nt (z, t) .
Благодарности
Исследования поддержаны грантами Министерства образования и науки РФ (ГК 16.518.11.7069) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052).
Список литературы
1. Касаткин А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии. - М.: Химия, 1973. - 750 с.
2. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Тюленёва А.Н., Серебренникова М.К., Криворучко А.В. Кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе // Российский журнал биомеханики. - 2007. - Т. 11, № 2. - С. 79-87.
3. Лейкин Ю.А., Черкасова Т. А., Смагина Н.А. Саморегенерирующиеся сорбенты для очистки воды от нефтяных углеводородов // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т. 8, вып. 4. -С. 585-599.
4. Митрофанов А.В., Огурцов А.В., Магницкий В.А., Мизонов В.Е., Tannous K. Математическая модель псевдоожижения бинарной смеси частиц // Вестник ИГЭУ. - 2012. - Вып. 1. - С. 1-4.
5. Подорожко Е.А., Куюкина М.С., Ившина И.Б., Филп Д.К., Лозинский В.И. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, способ получения носителя и носитель иммобилизованных микроорганизмов: патент РФ № 2298033 от 27.04.2007.
6. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1994. - 288 с.
7. Слинько М. Г. История развития математического моделирования каталитических процессов и реакторов // Теоретические основы химической технологии. - 2007. - Т. 41, № 1. - С. 16-34.
8. Cassidy M.B., Lee H., Trevors J.T. Environmental applications of immobilized microbial cells: a review // Journal of Industrial Microbiology. - 1996. - Vol. 16. - Р. 79-101.
9. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Serebrennikova M.K., Krivoruchko A.V., Podorozhko E.A., Ivanov R.V., Lozinsky V.I. Petroleum-contaminated water treatment in fluidized-bed bioreactor with immobilized Rhodococcus cells // International Biodeterioration & Biodegradation. - 2009. - Vol. 63. - P. 427-432.
10. Shieh W.K., Keenan J.D. Fluidized bed biofilm reactor for wastewater treatment // Biotechnology. -1986. -Vol. 33. - Р. 131-169.
11. Sokol W., Korpal W. Aerobic treatment of wastewaters in the inverse fluidised bed biofilm reactor // Chemical Engineering Journal. - 2006. - Vol. 118. - Р. 199-205.
EXPERIMENTAL AND THEORETICAL STUDIES OF THE ACTINOBACTERIA IMMOBILIZATION PROCESS IN A COLUMN FLUIDIZED-BED BIOREACTOR
M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.K. Serebrennikova, M.A. Osipenko, Y.I. Nyashin
(Perm, Russia)
Experimental results and theoretical description of the process of actinobacteria immobilization on pine sawdust hydrophobized with biosurfactant in a fluidized-bed column bioreactor are reported. The fluidized bed is formed in the bioreactor as a result of bacterial suspension pumping through the column at high speed (1.2-2.8 ml/min). A quartz glass filter is located at the bioreactor inlet and serves as a support for the sawdust carrier in the operational section of bioreactor. The filter helps maintaining homogeneous structure of the carrier by breaking large air bubbles and reducing their contribution to the formation of the fluidized bed. The immobilization process is controlled by the optical density measurements of the suspension. The optical density of bacterial suspension decreases steadily at medium flow rates over the experiment. At the same time, this parameter increases slightly after 96 and 120 hours at minimum and maximum flow rates respectively. In the course of time the following processes are taking place: immobilization of suspended cells, desorption of immobilized cells which become suspended and cell mycelium fragmentation into short rod-shape cells. The Cauchy problem for the kinetic equations in time dependence of suspended and immobilized cells concentrations is obtained. Immobilization parameters estimated using the mathematical model developed for four different rates of bacterial suspension pumping are in agreement with the experimental data obtained. The mathematical model developed can be used to optimize kinetic parameters of the bacterial immobilization processes in bioreactors during their industrial applications.
Key words: actinobacteria, immobilization, bioreactor, fluidized bed, biomechanical model.
Получено 14 ноября 2012
