CC BY
97
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 544.473+577.15+57.088.6+547.27
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АРИЛАЛКИЛЬНЫХ СУЛЬФИДОВ ЦЕЛЫМИ КЛЕТКАМИ Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66
А. А. Елькина, Т. И. Кылосоваь, В. В. Гришкос, И. Б. Ившинаa,b
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected] b Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected] с Институт технической химии УрО РАН, 614013, Пермь, ул. Академика Королева, 3, e-mail: [email protected]
В модельных экспериментах подобраны условия окислительной биотрансформации прохирального фенилметилового сульфида (тиоанизола) в соответствующий (^-сульфоксид (ее 82%) с использованием целых клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66. Установлено, что наиболее высокая окислительная активность характерна для клеток родококков, включенных в матрицу поливинилового спирта. Благодаря использованию приема иммобилизации оказалось возможным использовать сульфидные субстраты в концентрациях (1.0—1.5 г/л), токсичных для свободных клеток родококков. Окислительная активность закрепленных бактериальных клеток проявляется в способности их к образованию (5)-энантиомерно обогащенных фенилметил-, пара-толилметил-, фенилэтилсульфок-сидов и их последующему активному окислению в соответствующие сульфоны.
Ключевые слова: актинобактерии, Rhodococcus rhodochrous, целые клетки, биотрансформация, тиоани-зол, сульфоксид, иммобилизация, поливиниловый спирт
Введение
Интерес к оптически активным сульфоксидам обусловлен высокой реакционной способностью и возможностью последующего удаления медиаторов, включающих фрагмент RS^-O, в реакциях циклоприсоединения, альдольной конденсации, присоединения по Михаэлю и др. (Альфонсов и др., 1998). Данный подход позволяет осуществлять на основе хемо-, регио- и стереоселективных превращений сульфинильных интермедиатов синтез молекул практически любого класса органических соединений. Кроме того, некоторые сульфоксиды проявляют биологическую активность, определяющую полезные свойства таких растений как лук, чеснок, горчица и др. (Fernandez et al, 2003). Среди современных противоязвенных средств к наиболее эффективным блокаторам протонной помпы относится (S)-сульфоксид омепразола - эзомепразол (Cotton et al, 2000; Andersson et al, 2001).
Наряду с металлокомплексным катализом для направленного окисления прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфок-сиды используют метод биокаталитической трансформации. При этом в качестве катализаторов процесса сульфоксидирования применяются как индивидуальные ферменты, так и целые микробные клетки. Описаны единичные работы (Holland et al, 1992; Porto et al, 2002), в которых
для повышения эффективности процесса окисления прохиральных сульфидов применяется широко используемый в биотехнологии прием иммобилизации целых клеток мицелиальных грибов. Основные проблемы, возникающие в процессе разработки таких биокатализаторов - сохранение жизнеспособности и функциональной активности иммобилизованных клеток микроорганизмов. С этой точки зрения, наиболее эффективным представляется использование криогелей, обеспечивающих проведение иммобилизации бактериальных клеток при физиологических значениях pH, температуры без применения токсичных химических веществ (Лозинский, 1998).
Многие микроорганизмы в природе склонны к образованию агрегированных форм в виде хлопьев и биопленок. Так, среди бактерий выраженной способностью к кооперации отличаются представители рода Rhodococcus, самоиммобилизация которых в условиях индуцированного алканотроф-ного типа метаболизма способствует адаптации микробных клеток к экстремальным условиям обитания. Подобные адаптивные механизмы позволяют эффективно использовать родококки в биотехнологических целях, в том числе в процессах биотрансформации органических соединений (Ившина и др., 2007).
Цель настоящей работы - оценка способности иммобилизованных клеток родококков к окислительной биоконверсии арилалкилсульфидов.
© А. А. Елькин, Т. И. Кылосова, В. В. Гришко, И. Б. Ившина, 2010
27
Материалы и методы
В работе использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (акроним коллекции ИЭГМ; Каталог штаммов.., 1994; www.iegm.ru/iegmcol).
Биотрансформацию арилалкилсульфидов (0.51.5 г/л) свободными и иммобилизованными клетками родококков проводили в минеральной среде следующего состава, г/л: KNO3 - 1.0; К2НР04 -1.0; КН2Р04 - 1.0; №С1 - 1.0; MgSO4x7H2O - 0.2; СаС12х2Н20 - 0.02; FeQ3 - 0.001; дрожжевой экстракт - 0.1%; раствор микроэлементов по Постгейту - 1.0 мл/л; 0.1, 0.5 или 1.0 об.% н-гексадекана в качестве источника углерода и энергии. В качестве посевного материала использовали
1
мл
2 сут
биомассы
родококков
(5.0±0.4*10 кл/мл), выращенных на мясопептон-ном агаре и отобранных в экспоненциальной фазе роста, или 200 гранул иммобилизованных клеток (5.0±0.6*10б клеток) на 100 мл среды.
В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС). В работе применяли ПВС марки 40/2 (ГОСТ 10779-78) производства ПО «Азот» (Невинномысск, Россия). Иммобилизацию родококков осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС согласно методике, описанной в работе (Киуикша et а1, 2006). Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0.5% р-ре №С1 в течение 24 ч.
Бактериальные клетки выращивали в условиях периодического культивирования в колбах Эрлен-мейера с объемом питательной среды 100 мл на орбитальном шейкере СеАота^ (160 об/мин) при 28°С.
Коммерчески доступные фенилметиловый (!а), фенилэтиловый (К) и пара-толилметиловый Ов) сульфиды в виде раствора в изопропаноле (1:10) добавляли одновременно или через 2 сут культивирования бактериальных клеток. При этом продолжительность процесса биотрансформации ро-дококками составляла 1-12 сут.
Продукты биотрансформации тиоанизола экстрагировали этилацетатом. Объединенные этилаце-
татные вытяжки сушили над сульфатом натрия. Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя «Heidolph» (Германия). Качественный состав продуктов биотрансформации контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах с флуоресцентной добавкой фирмы «Sigma-Aldrich» (США), фиксируя образование продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными сульфидами и соответствующими сульфоксидами, полученными методом химического окисления.
Анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N с кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора. Оптическое вращение растворов образцов арилалкилсульфоксидов измеряли на поляриметре фирмы «Perkin-Elmer» (США) модель 341 при длине волны 589 нм. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле фирмы «Merck» (США) (0.06-0.20 мм), соотношение вещества и сорбента » 1 : 12, в качестве элюента использовали смесь гексана с возрастающим от 5 до 40% содержанием этилацетата.
Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью компьютерных программ Exel 2000 и Statistica (версия 6.0 для Windows).
Результаты и их обсуждение
Прием индукции оксигеназных ферментных систем родококков углеводородными субстратами широко используется в процессе биотрансформации органических соединений различных классов, в том числе органических прохиральных сульфидов (Ohta et al, 1984, 1985; Гришко и др. 2000, 2009). Ранее нами было показано (Гришко и др., 2004), что в присутствии 1 об.% н-гексадекана свободные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 трансформируют фенилметиловый сульфид (!а) (тиоа-низол) в оптически активный (^-сульфоксид (Па) (содержание в сумме продуктов реакции 55%) за 7 сут при условии добавления сульфида через 2-е сут инкубации родококков (рис. 1, 2).
OO R2
(I)
(II)
(III)
а Rj=H, R2=CH3 б Rj=H, R2=C2H5 в Rj=R2=CH3
Рис. 1. Биотрансформация арилалкилсульфидов R. rhodochrous ИЭГМ 66
R
2
R
R
%
Рис. 2. Биотрансформация тиоанизола (Ха) (0.5 г/л) свободными клетками родококков в присутствии н-гексадекана в концентрации, об. %:
1 - 0.1; 2 - 0.5; 3 - 1.0
Установлено, что существенное влияние на каталитическую активность оксигеназных ферментов R. гкоёоскгош ИЭГМ 66 в отношении тиоанизола оказывает концентрация н-гексадекана в ростовой среде. Как видно из рис. 2, снижение содержания н-гексадекана до 0.5 об. % приводит к увеличению сульфидокисляющей активности родо-кокков и, как следствие, повышению содержания сульфоксида (Па) до 68% в сумме продуктов биотрансформации. Полная конверсия тиоанизола (Ха) в соответствующий сульфоксид (ХХа) достигается в
присутствии 0.1 об. % н-гексадекана, что позволяет сократить продолжительность трансформации тиоанизола до 6-ти сут при условии добавления сульфида через 2-е сут инкубации родококков.
В то же время при повышении концентрации тиоанизола биокаталитическая активность родо-кокков заметно ингибируется. Так, при внесении 1.0 или 1.5 г/л тиоанизола уровень биоконверсии сульфида (Ха) составляет не более 25%, при увеличении продолжительности инкубации до 12 сут -не превышает 50%.
Для оптимизации процесса биоконверсии тио-анизола (Ха) использовали прием иммобилизации клеток родококков в криогель на основе ПВС. По данным хромато-масс-спектрометрии, полная биоконверсия тиоанизола (0.5 г/л) в целевой сульфоксид достигается при использовании иммобилизованных бактериальных клеток, предварительно выращенных в присутствии н-гексадекана. Установлено, что при использовании гранул биокатализатора, содержащих 0.1 об.% н-гексадекана, уже через 1 сут регистрируется образование в среде целевого сульфоксида (ХХа) и сульфона (ХХХа) тио-анизола в соотношении 3:1 (табл. 1).
Таблица 1
Биотрансформация тиоанизола (Ха) иммобилизованными клетками родококков
Содержание в сумме продуктов реакции (%)*
Соединение А Б В
1 сут 2 сут 3 сут 1 сут 2 сут 3 сут 1 сут 2 сут 3 сут
Тиоанизол (Ха) - - - 73.6 - - 94.1 18.0 -
Сульфоксид (ХХа) 74.7 34.3 13.3 26.4 55.9 28.3 5.9 78.3 41.2
Сульфон (ХХХа) 25.3 65.7 86.7 - 44.1 71.7 - 3.7 58.8
При концентрации тиоанизола (Ха) в среде: А - 0.5, Б - 1.0, В - 1.5 г/л.
*
Достигнутая благодаря использованию иммобилизованных клеток интенсификация окислительного процесса позволила использовать более высокие концентрации сульфидного субстрата. По данным хромато-масс-спектрометрии, иммобилизованные клетки R. гкоёоскгош ИЭГМ 66 при добавлении тиоанизола (Ха) в концентрации 1.0 и 1.5 г/л катализируют активное окисление образующегося сульфоксида (ХХа) в сульфон (ХХХа) уже в течение первых суток. Как следствие, на момент полного исчезновения тиоанизола через 2-3-е сут концентрация побочного сульфона (ХХХа) составляет 44.1 и 58.8 % соответственно (см. табл. 1).
На следующем этапе исследовали ферментативную активность иммобилизованных клеток R. гкоёоскгош ИЭГМ 66 в отношении арилал-кильных гомологов тиоанизола - фенилэтилового (Хб) и пара-толилметилового (Хв) сульфидов. Установлено, что родококки при добавлении сульфидов (Хб, Хв) в концентрации 1.5 г/л, как и в модельных экспериментах с тиоанизолом (Ха), катализируют образование соответствующих (5)-
сульфоксидов (ХХб, ХХв). Однако, показатель оптической чистоты арилалкилсульфоксидов (ХХб, ХХв) уступает таковому сульфоксида тиоанизола (ХХа). Энантиомерный избыток (ее) (5)-сульфоксидов (ХХб, ХХв) составляет 54.7 и 48.0 %, соответственно. Как видно из табл. 2, при окислении арилалкил-сульфидов (Ха, Хб, Хв) параллельно с процессом образования сульфоксидов (ХХа, ХХб, ХХв) регистрируется накопление побочных продуктов окисления - сульфонов (ХХХа, ХХХб, ХХХв), сопровождающееся снижением эффективности процесса направленного синтеза целевых сульфоксидов (ХХа, ХХб, ХХв), химический выход которых не превышает 30%. На наш взгляд, решение проблемы ингибирования сульфоноокисляющей активности родококков позволит сместить направление процесса окислительной биотрансформации в сторону направленного образования целевого продукта и повышения его оптической чистоты.
Таблица 2
Биотрансформация арилалкилсульфидов (Ia, 1б, 1в) иммобилизованными клетками родококков
Сульфид Содержание (%) продуктов биотрансформации Химический выход (%), ее (%) и [a]D ^-сульфоксида (II)
(I) (II) (III)
Тиоанизол (1а) 0.0 41.2 58.8 27.5; 82.1; -134 (с 0.4; CHCl3)
Фенилэтилсульфид (1б) 0.0 43.6 56.4 28.4; 54.7; -116 (с 0.3; EtOH)
пара-Толилметилсульфид (1в) 9.8 40.3 49.9 29.6; 48.0; -86 (с 0.4; CHCl3)
Заключение
Таким образом, полученные в результате проведенных исследований данные свидетельствуют о значительном повышении сульфидокислительной активности целых клеток R. гкоёоскгош ИЭГМ 66 при включении их суспензии в ПВС-криогель. Установлено, что использование иммобилизованной формы биокатализатора позволяет осуществить конверсию арилалкилсульфидов в концентрациях (>0.5 г/л), токсичных для свободных клеток родо-кокков, и сократить продолжительность процесса биотрансформации до 3 сут. О высоком окислительном потенциале родококков свидетельствует активность полученного биокатализатора в отношении образующихся в процессе биотрансформации арилалкилсульфоксидов, ингибирование процесса окисления которых в соответствующие суль-фоны может способствовать повышению продуктивности процесса образования целевых сульфок-сидов.
Работа поддержана грантами Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4 и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие».
Библиографический список
Гришко, В.В. Биотрансформация изопимаровой и дегидроабиетиновой кислот с использованием бактерий рода Rhodococcus / В.В. Гришко, А.В. Воробьев, Э.Н. Шмидт // Химия в инт. устойч. развития. 2000. № 8. С. 693-698.
Гришко, В.В. Биотрансформация тиоанизола акти-нобактериями Rhodococcus &ети &'М^о / В.В. Гришко, И.Б. Ившина, А.Г. Толстиков // Биотехнология. 2004. № 5. С. 49-56.
Гришко, В.В. Биокаталитическое получение физиологически активных соединений на основе растительного Р-ситостерола / В.В. Гришко, Е.М. Ноговицина, И.Б. Ившина // Кат. в промышл. 2009. № 1. С. 67-74.
Ившина, И.Б. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях среды / И.Б.
Ившина, Т.Н. Каменских, Б.А. Анохин // Вестн. Перм. ун-та. Сер. Биология. 2007. № 5 (10). С. 107-112.
Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. 163 с.
Лозинский, В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта // Успехи химии. 1998. Т. 67, № 7. С. 641-652.
Получение и свойства органических соединений серы / В.А. Альфонсов [и др.]; под ред. Л.И. Беленького. М.: Химия. 1998. 560 с.
Andersson, T. Pharmacokinetic studies with esome-prazole, the (S)-isomer of omeprazole / T. Andersson, M. Hassan-Alin, G. Hasselgren [et al.] // Clin. Pharmacokinet. 2001. Vol. 40. № 6. P. 411-426.
Cotton, H. Asymmetric synthesis of esomeprazole / H. Cotton, T. Elebring, M. Larsson [et al.] // Tetrahedron: Asymmetry. 2000. Vol. 11. № 18. P. 38193825.
Fernandez, I. Recent developments in the synthesis and utilization of chiral sulfoxides / I. Fernandez, N. Khiar. // Chem. Rev. 2003. Vol. 103. P. 36513705.
Holland, H.L. Effect of cell immobilization and organic solvents on sulfoxidation and steroid hydroxyla-tion by Mortierella isabellina / H.L. Holland, S. Poddar, B. Tripet // J. Ind. Microbiol. 1992. Vol. 10. P. 195-197.
Kuyukina, M.S. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, A.Y. Gavrin [et al.] // J. Microbiol. Methods. 2006. Vol. 65. P. 596-603.
Ohta, H. Asymmetric synthesis of chiral sulfoxides via microbial oxidation of sulfides / H. Ohta, Y. Okamoto, G. Tsuchihashi // Chem. Lett. 1984. P. 205-208.
Ohta, H. Microbial oxidation of allylic sulfides to the corresponding optically active sulfoxides / H. Oh-ta, Y. Okamoto, G. Tsuchihashi // Agric. Biol. Chem. 1985. Vol. 49, № 3. P. 671-676.
Porto, A.L.M. Aspergillus terreus CCT 3320 immobilized on chrysotile or cellulose/TiO2 for sulfide oxidation / A.L.M. Porto, F. Cassiola, S.L.P. Dias
[et al.] // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2002. Vol. 19-20. P. 327-334.
Поступила в редакцию 15.03.2010
Biotransformation of alkyl aryl sulfides by Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 A. A. Elkin, PhD-student
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2446712
Т. I. Kylosova, student
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected] V. V. Grishko, candidate of chemistry, head of laboratory
Institute of Technical Chemistry, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 3, Korolev str, Perm, Russia, 614013; [email protected]
I. B. Ivshina, doctor of biology, professor, correspondent member of RAS
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; [email protected]
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
Conditions for oxidative biotransformation of methyl phenyl sulfide (thioanisole) to corresponding (S)-sulfoxide (82% ее) by whole cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 were determined in the model experiments. Poly(vinyl) alcohol cryogel-immobilized rhodococci showed higher oxidation activities. As a result, the effective oxidation of thioanisole methyl p-tolyl and ethyl phenyl sulfide (1.5 g/1) into optically active (S)-sulfoxides after 3-day incubation was achieved using an immobilized biocatalyst.
Key words: actinobacteria; Rhodococcus rhodochrous; whole cells; biotransfprmation; thioanisole; sulfoxide; immobilization; poly(vinyl) alcohol cryogel.
Елькин Андрей Анатольевич, аспирант
ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Кылосова Татьяна Ивановна, студент
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
Гришко Виктория Викторовна, кандидат химических наук, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт технической химии УрО РАН»
Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
