CC BY
61
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2007 Биология Вып. 5 (10)
УДК 579.663
ИЗУЧЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ РОДОКОККОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В МАКРОПОРИСТОМ КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА
А. Ю. Гаврин3, А.А. Елькина, М. С. Куюкинаа,ь, В.В. Гришкос, И. Б. Ившинаа,ь
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15 ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 с Институт технической химии УрО РАН, 614000, Пермь, ул. Ленина, 13
Определены оптимальные условия иммобилизации клеток родококков в макропористый криогель поливинилового спирта. На примере биодеградации н-гексадекана и биотрансформации тиоанизола показано, что каталитическая активность иммобилизованных клеток родококков в 2-2.5 раза выше таковой у свободных клеток.
Иммобилизованные клетки микроорганизмов широко используются в биотехнологиях получения целевых веществ (Синицин и др., 1994). Процесс иммобилизации микробных клеток способствует существенному повышению их каталитической активности и устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды. Использование криогелей различной
природы для закрепления бактериальных клеток (рис. 1) обеспечивает проведение данного процесса в «мягких» условиях, т. е. при физиологических значениях температуры, pH и без применения токсичных химических веществ. Криогель на основе поливинилового спирта - это макропористый, высокопрочный, по-
Рис. 1. Клетки Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, иммобилизованные в макропористом криогеле поливинилового спирта, в сканирующем электронном микроскопе: 1 - х 4500; 2 - х 25000
лимерныи материал, получаемый в результате замораживания с последующим оттаиванием концентрированных водных растворов данного полимера (Лозинский, Плиева, Зубов, 1995).
В настоящее время наиболее разрабатываемыми в биотехнологическом отношении актинобактерия-ми являются представители рода Rhodococcus sensu іігі^ (Ившина, 1997). В частности показано (Тол-стиков, Гришко, Ившина, 2003), что родококки катализируют реакции стереоселективного окисления фенилметилового сульфида (тиоанизола) (1) и
его гомологов в соответствующие (Я)- или ^)-суль-фоксиды (2), широко применяемые в химической и
СН3
о
СН3
о о
к
СН-,
(1)
(2) (3)
фармакологической промышленности. Цель настоящей работы - изучение углеводородокисляю-щей активности иммобилизованных клеток родо-кокков.
© А. Ю. Гаврин, А. А. Елькин, М. С. Куюкина, В. В. Гришко, И. Б. Ившина, 2007
113
Материалы и методы
В работе использовали штаммы R. ruber ИЭГМ 231 и R. rhodochrous ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алкано-трофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol). Культуры параллельно выращивали в мясопептонном бульоне и минеральной среде в присутствии н-гексадекана (Каталог штаммов..., 1994). В качестве носителя иммобилизованных клеток использовали криогель поливинилового спирта марки 40/2 (ГОСТ 10779-78) производства предприятия «Азот» (Невинномысск). Формирование гранул криогеля с закрепленными в них клетками родококков проводили согласно ранее описанной методике (Kuyukina et al., 2006). Для гидрофобизации криогеля использовали Rho-dococcus биосурфактант (Kuyukina et al., 2001). Сравнительное определение жизнеспособности свободных и иммобилизованных клеток родокок-ков осуществляли с помощью специфического окрашивания иодонитротетразолием фиолетовым. Каталитическую активность свободных клеток родококков, а также включенных в матрицу полимерного криогеля определяли в экспериментах по биодеградации н-гексадекана и трансформации тиоанизола. Количество остаточного н-гексадекана определяли гравиметрически. Анализ продуктов биотрансформации тиоанизола осуществляли методами тонкослойной хроматографии, а также хромато-масс-спектрометрии с использованием
хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N с квад-рупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора и кварцевой колонкой HP-5 MS SN US 1518974 -1 (Agilent, США). Долговременное хранение гранул биокатализатора осуществляли в высушенном виде при комнатной или пониженной температурах и в физиологическом растворе при комнатной или пониженной температурах. Жизнеспособность иммобилизованных клеток в процессе хранения контролировали еженедельно в течение 10 месяцев.
Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Для статистической обработки полученных данных использовали программу STA-TISTICA 6.0. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
В результате исследований установлено, что для иммобилизации родококков, предварительно выращенных в мясопептонном бульоне, оптимальное объемное соотношение клеточной массы и раствора поливинилового спирта составляет 1 : 3 с добавлением 10% Rhodococcus-биооурфактанта (табл. 1). Для клеток, выращенных в присутствии н-гексадекана, такое соотношение составляет 1:2, при этом не требуется добавления Rhodococcus-биосурфактанта (табл. 2).
Таблица 1
Характеристика биокатализатора на основе иммобилизированных клеток родококков, выращенных на мясопептонном бульоне
Соотношение клеточная суспензия : криогель, v/v Количество клеток родококков в 1 грануле криогеля, x 10З Концентрация Rhodococcus-биосурфактанта, % Распределение гранул криогеля в двухфазной среде Механическая прочность гранул криогеля
2 1 210 ± 1.0 З Вода Низкая
2 1 21.0 ± 1.0 5 Углеводород/вода Низкая
2 1 21.0 ± 1.0 10 Углеводород/вода Низкая
1 1 1З.5 ± 1.5 З Вода Низкая
1 1 1З.5 ± 1.5 5 Углеводород/вода Низкая
1 1 1З.5 ± 1.5 10 Углеводород/вода Низкая
1 2 8.0 ± 0.6 З Вода Высокая
1 2 8.0 ± 0.6 5 Вода Высокая
1 2 8.0 ± 0.6 10 Углеводород/вода Низкая
1 З 6.5 ± 0.4 З Вода Высокая
1 З 6.5 ± 0.4 5 Вода Высокая
1 З 6.5 ± 0.4 10 Углеводород/вода Высокая
1 5 З.0 ± 0.2 З Вода Высокая
1 5 З.0 ± 0.2 5 Вода Высокая
1 5 З.0 ± 0.2 10 Вода Высокая
Подобранные условия иммобилизации обеспечивают высокую концентрацию жизнеспособных клеток, заключённых в гель, значительную механическую прочность биокатализатора и распределение гранул криогеля на границе раздела фаз «углеводород-вода». Межфазная локализация приводит к тесному взаимодействию гранул катали-
затора со средой в гидрофильной и гидрофобной фазах, что способствует одновременному поступлению углеводородного субстрата, воды и кислорода к иммобилизованным клеткам.
По нашим данным, углеводородокисляющая активность закреплённых в криогеле клеток существенно выше по сравнению с таковой свободных
клеток. Так, степень биодеградации н-гексадекана иммобилизованными клетками родококков достигает 51%, тогда как данный показатель для свободных клеток составляет лишь 21%. Сравнительный анализ данных по окислению тиоанизола свободными и закрепленными бактериальными клетками показал, что при использовании свободных клеток родококков полная конверсия сульфида достигается только через 3 сут после его добавле-
ния, тогда как использование иммобилизованных клеток позволяет искючить двухдневную стадию подготовки биокатализатора и осуществить полную конверсию тиоанизола уже за 24 ч при условии одновременного введения биокатализатора и субстрата. При этом относительное содержание побочного продукта - сульфона тиоанизола (3) -не превышает 9.5% (рис. 2).
Таблица 2
Характеристика полученного биокатализатора на основе клеток родококков, выращенных в жидкой минеральной среде с добавлением н-гексадекана
Соотношение клеточная суспензия : криогель, v/v Количество клеток родо-кокков в 1 грануле криогеля, x 103 Распределение гранул криогеля в двухфазной среде Механическая прочность гранул криогеля
2 : 1 12.3 + 2.0 Углеводород / вода Низкая
1 : 1 9.3 +1.5 Углеводород / вода Низкая
1 : 2 6.2 + 0.4 Углеводород / вода Высокая
1 : 3 4.6 +0.6 Вода Высокая
1 : 5 3.1 + 0.7 Вода Высокая
100 п% 80
60
40
20
0
-20
1%
г ri l l
3
4
5
Время, сут
□ Т иоанизол □ Суль фоксид □ Сульфон
А
100
80
60
40
20
%
!Ш
12
□ Сульфоксид □ Сульфон
Б
3 4
Время, сут
Рис. 2. Динамика накопления продуктов биотрансформации тиоанизола с использованием свободных (А) и иммобилизованных (Б) клеток R. rhodoсhrous ИЭГМ 66
0
Установлено, что оптимальным способом долгосрочного поддержания полученного биокатализатора является его хранение в высушенном виде при комнатной или пониженной температурах. При этом жизнеспособность иммобилизованных клеток родо-кокков сохраняется на уровне 60-80% в течение 10 месяцев.
Исследования поддержаны грантами Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” и РФФИ № 04-04-97518-р_офи; 07-04-97612-р_офи.
Список литературы
Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, детекция, иммунодиагностика: Дис. ...д-ра биол. наук. Пермь, 1997.
Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. 163 с.
Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул // Биотехнология. 1995. № 1. С. 32-37.
Синицин А.П. и др. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 288 с.
Толстиков А.Г., Гришко В.В., Ившина И.Б. Энан-тиоселективное биокаталитическое окисление органических сульфидов в хиральные сульфок-сиды // Современные проблемы асимметрического синтеза / Под ред. А.Г. Толстикова. Екатеринбург, 2003. С. 165-205.
Kuyukina M.S. et al. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels
hydrophobized using a biosurfactant // J. Microbiol. tion // J. Microbiol. Methods. 2001. Vol. 46. P. Methods. 2006. Vol. 65. P. 596-603. 149-156.
KuyukinaM.S. et al. Recovery of Rhodococcus biosur- Поступила в редакцию 18.05.2006
factants using methyl-tertiary butyl ether extrac-
Study of hydrocarbon-oxidizing activity of Rhodococcus cells immobilized in poly(vinyl alcohol) cryogel
A.Yu. Gavrin, A.A. Elkin, M.S. Kuyukina, V.V. Grishko, I.B. Ivshina
Optimal conditions for immobilization of Rhodococcus cells to macroporous poly(vinyl alcohol) cryogel were developed. It was shown that catalytic activity of immobilized rhodococcal cells, e.g. «-hexadecane biodegradation and thioanisol transformation extent, is 2-2.5 times higher than that of free cells.
