ПОИСК ОПТИМАЛЬНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ РОДОКОККОВ С ЦЕЛЬЮ БИОТРАНСФОРМАЦИИ β-СИТОСТЕРОЛА Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.66+547.92

ПОИСК ОПТИМАЛЬНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ РОДОКОККОВ С ЦЕЛЬЮ БИОТРАНСФОРМАЦИИ 0-СИТОСТЕРОЛА

© Е. М. Ноговицина1*, Г. А. Бажутин2, В. В. Гришко3

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН Россия, 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13.

2Пермский государственный национальный исследовательский университет Россия, 614990 г. Пермь, ул. Букирева, 15.

3Институт технической химии Уральского отделения Российской академии наук Россия, 614013 г. Пермь, ул. Академика Королева, 3.

Тел.: +7 (342) 280 81 14.

*Email: nogov@iegm.ru

С использованием иммобилизованных актинобактерий рода Rhodococcus из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol) исследован процесс биотрансформации fi-ситостерола. Установлено, что закрепленные на технической полимерной ткани родококки в присутствии глюкозы проявляют высокую трансформирующую активность в отношении fi-ситостерола. Максимальная (от 44 до 64%) степень окислительной биотрансформации fi-ситостерола с образованием фармакологически активного соединения стигмаст-4-ен-3-она достигается при использовании клеток R. ruber ИЭГМ220 и R. ruber ИЭГМ 233.

Ключевые слова: биотрансформация, актинобактерии рода Rhodococcus, иммобилизация, в-ситостерол, стигмаст-4-ен-3-он.

Введение

Иммобилизация (фиксация) бактерий на твердых поверхностях — один из эффективных способов повышения их каталитической активности. Иммобилизованные клетки по сравнению с незакрепленными обладают повышенной жизнеспособностью и стабильностью в экстремальных условиях внешней среды, устойчивостью к высоким концентрациям токсичных органических соединений и растворителей [1]. В отличие от свободных клеток способность иммобилизованных бактерий к биотрансформации Р-ситостерола — ценного источника физиологически активных стероидных соединений исследована недостаточно. Ранее нами [2-4] проведено детальное изучение процесса биотрансформации Р-ситостерола свободными клетками актинобактерий рода Rhodococcus. Установлено, что родококки, растущие в присутствии н-гексадекана, эффективно (50-95%) трансформируют Р-ситосте-рол с образованием стигмаст-4-ен-3-она, обладающего гипогликемической и вазодепрессивной активностью, а также перспективного для лечения гиперплазии простаты [5-7].

Цель настоящей работы — поиск носителя для иммобилизации, при использовании которого достигается наиболее высокий уровень биотрансформации Р-ситостерола закрепленными клетками родококков.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы R. erythropolis ИЭГМ 179, R. globerulus ИЭГМ 591, R. rhodnii ИЭГМ 555, R. rhodochrous ИЭГМ 66, ИЭГМ 760 и R. ruber ИЭГМ 85, ИЭГМ 220, ИЭГМ 233, ИЭГМ 381,

хранящиеся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol).

Эксперименты проводили с использованием носителей различного происхождения (табл. 1).

Носители, использованные в работе

Таблица 1

Материал носителя

Изготовитель

Углеродный Каталитический волокнистый углерод, d частиц = 1-2 мм Минеральный Силикагель крупный гранулированный, d частиц 2.7-8.0 мм

Кератинсодержащий Куриные перья, дезинфицированные кипячением

Полимерный Ткань техническая из нитей СВМ арт. 56313 "Н" ТУ 17 ВНИИПХВ-350-88, S кусков = 1 см2

Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия

«Реактив», Санкт-Петербург, Россия

Институт элементо-органических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия

ООО «УкрматериалИн-вест», Харьков, Украина

Для получения иммобилизованных клеток родококки предварительно культивировали на орбитальном шейкере (150 об/мин) при температуре 28 °С в течение 2 сут. В качестве инкубационных сред использовали мясопептонный бульон, минеральную среду К состава (г/л): KNOз - 1.0, КН2РО4 - 1.0, К2НРО4ХЗН2О - 1.0, ШС1 - 1.0, MgSO4x7H2O - 0.2, СаСЪх2Н20 - 0.02 с добавле-

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2014. Т. 19. №3

859

нием дрожжевого экстракта (10.0 г/л) и глюкозы (10.0 г/л), а также глюкозосодержащую среду D. Wilmanska с соавт. [8] состава (г/л): K2HPO4 х ЗН2О - 1.0, (NH4)2HPO4 - 1.5, MgSO4 х 7Н2О - 0.1, FeSO4 х 7Н2О - 0.01, ZnSO4 х 7Н2О - 0.002, глюкоза - 5.0, дрожжевой экстракт - 10.0. Дополнительно в качестве индуктора в среды вносили 0.2 г/л Р-ситостерола в виде 10% раствора в изопропаноле. Через 2 сут родококки отделяли от инкубационной среды центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин и дважды промывали фосфатно-щелочным буфером (KH2PO4/NaOH, pH 7). Затем к 50 мл приготовленной в этом же буфере клеточной суспензии (OD600 1.0) добавляли 4 см3 носителя. Иммобилизацию проводили в течение 5 сут на орбитальной качалке (130 об/мин) при температуре 28 °С. Показатель абсорбции клеток родококков на поверхности носителей определяли каждые 24 ч на спектрофотометре Lambda EZ201 «Perkin-Elmer» (США) по изменению оптической плотности суспензии.

Биотрансформацию Р-ситостерола проводили в минеральной среде К с добавлением глюкозы (10 г/л) или н-гексадекана (0.1 об.%); глюкозосодер-жащей среде D. Wilmanska с соавт. [8]; фосфатно-щелочном буфере pH 7. Р-Ситостерол добавляли в среду в концентрации 0.5 г/л в виде 10% раствора в изопропаноле одновременно с биокатализатором. В отдельных экспериментах использовали иммобилизованные клетки, предварительно выдержанные в течение 2 сут в глюкозосодержащих средах с добавлением 0.2 г/л Р-ситостерола.

В экспериментах применяли Р-ситостерол «Sigma-Aldrich» (США). Образец стигмаст-4-ен-3-она получен из Новосибирского института органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН. Продукты микробного окисления Р-ситостерола экстрагировали этилацетатом (3 х 50 мл). Объединенные экстракты сушили над Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе. Качественный и количественный состав полученных смесей анализировали методом ТСХ с использованием пластин «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ фирмы ЗАО «Сорбполимер» (Россия) [7], УФ-спектроскопии на спектрофотометре Lambda EZ201 «Perkin-Elmer» (США) и хроматомасс-спектрометрической системы Agilent 6890/5973N (кварцевая колонка HP-5MS

SN US 15189741-1) «Agilent technology» (США). Эксперименты проводили в 3 кратной повторности. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы Excel 2003.

Результаты и их обсуждение

Как видно из табл. 2, максимальная (от 60 до 94%) степень адсорбции родококков регистрируется на поверхности технической полимерной ткани (ТПТ) или каталитического волокнистого углерода (КВУ). Установлено, что количество закрепленных родококков на носителях зависит от условий их предварительного выращивания. Так, культивирование R. ruber ИЭГМ 233 в глюкозосодержащей среде D. Wilmanska с соавт. [8] с добавлением Р-ситостерола приводит к повышению их адсорбционной способности к поверхности куриных перьев или ТПТ в 1.2-2.1 раза по сравнению с остальными вариантами опыта.

Установлено, что наиболее высокий (52-57%) уровень окислительной активности родококков в отношении Р-ситостерола достигается в присутствии глюкозы при использовании в качестве носителя ТПТ. Необходимым условием эффективной биотрансформации исходного стерола с образованием стигмаст-4-ен-3-она является использование бактериальных клеток, иммобилизованных после предварительной инкубации в среде D. Wilmanska с соавт. [8] с добавлением Р-ситостерола (рис. 1).

Примечание. Иммобилизацию проводили с использованием родококков, предварительно выращенных без добавления Р-ситостерола (числитель) или с добавлением 0.2 г/л Р-ситостерола в виде 10% раствора в изопропаноле (знаменатель).

С целью подбора оптимальных условий процесса биотрансформации Р-ситостерола иммобилизованными родококками исследована стеролтранс-формирующая активность клеток R. ruber ИЭГМ 233, закрепленных на технической полимерной ткани и выдержанных в течение 2 сут в присутствии глюкозы и 0.2 г/л Р-ситостерола в качестве индуктора. Установлено, что после переноса данных бактерий в свежую питательную среду их способность к окислительной трансформации Р-сито-стерола повышается на 6-7% по сравнению с клетками без дополнительной инкубации в присутствии глюкозы и Р-ситостерола (табл. 3).

Таблица 2

Степень адсорбции (%) клеток R. ruber ИЭГМ 233 на поверхности носителей

Носители Среды культивирования родококков до этапа иммобилизации

Мясопептонный бульон Минеральная среда К D. Wilmanska с соавт. [8]

КВУ ТПТ Перья Силикагель

93.4 ± 0.76 74.8 ± 8.85

60.5 ± 0.15 52.8 ± 11.21

25.8 ± 11.55 22.4 ± 1.15

21.9 ± 10.40 24.9 ± 8.92

93.6 ± 0.81

84.8 ± 5.17

60.2 ± 3.93

55.5 ± 4.89

15.9 ± 7.66

29.6 ± 10.41 25.8 ± 13.35

19.3 ± 10.54

77.3 ± 1.04 85.0 ± 3.49

57.0 ± 10.02 73.8 ± 5.56 11.2 ± 7.00

54.2 ± 11.38

50.1 ± 17.25

28.3 ± 11.45

100 -

60 -

" 20 -

S КВУ □ ТПТ

□ Куриные перья □ Силикагель

А

П П

□

I

1234123412341234

S КВУ □ ТПТ Б

□ Куриные перья □ Силикагель

S , 4N ,

лЛ

1234123412341234

Рис. 1. Биотрансформация р-ситостерола иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 233 в минеральной среде «К» с добавлением н-гексадекана (1) или глюкозы

(2), среде D. Wilmanska с соавт. [8] (3), фосфатно-щелочном буфере (4). Бактерии предварительно выращивали в среде D. Wilmanska с соавт. [8] без добавления (А) или с добавлением (Б) 0.2 г/л исходного стерола. Приведены данные после 5 сут биотрансформации р-ситостерола.

Таблица 3

Биотрансформация p-ситостерола клетками R. ruber ИЭГМ 233, иммобилизованными на поверхности технической полимерной ткани

Инкубационная среда Стигмаст-4-ен-3-он, %

1 2 3

Минеральная среда «К» с

глюкозой Глюкозосодержащая среда D. Wilmanska с соавт. [8]

45.3 ± 4.03

27.6 ± 3.11

57.1 ± 3.50

55.2 ± 4.00

63.5 ± 5.96

60.5 ± 4.66

Примечание. Для биотрансформации Р-ситостерола использовали: иммобилизованные клетки без дополнительной инкубации в присутствии глюкозы и Р-ситостерола (1, 2); иммобилизованные клетки, выдержанные в течение 2 сут в глюкозосо-держащих средах с добавлением 0.2 г/л Р-ситостерола в качестве индуктора (3). До этапа иммобилизации бактерии выращивали в среде D. Wilmanska с соавт. [8] без добавления (1) или с добавлением 0.2 г/л Р-ситостерола (2, 3).

В отдельных экспериментах наряду с R. ruber ИЭГМ 233 способность к эффективной (44%) трансформации Р-ситостерола выявлена также у

клеток R. ruber ИЭГМ 220, иммобилизованных на технической полимерной ткани. Установлено, что другие представители рода, использованные в работе, окисляют лишь 2-25% стерола в стигмаст-4-ен-3-он.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что использование в качестве носителя технической полимерной ткани обеспечивает эффективную биотрансформацию Р-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он иммобилизованными клетками родококков. При этом максимальный (более 55%) уровень стеролтрансформирую-щей активности родококков достигается после культивирования бактерий до этапа иммобилизации в присутствии Р-ситостерола в качестве индуктора. Дополнительная инкубация закрепленных на ткани родококков в глюкозосодержащих средах с добавлением Р-ситостерола способствует повышению их способности к биотрансформации Р-ситостерола до 64%. Среди исследованных штаммов выявлены культуры R. ruber ИЭГМ 220 и ИЭГМ 233, которые после иммобилизации на технической полимерной ткани, наиболее активно трансформируют Р-ситостерол с образованием стигмаст-4-ен-3-она.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (проект № 14-04-96005-р_урал_а).

ЛИТЕРАТУРА

1. Martins S. C. S., Martins C. M., Fiuza L. M. C. C., Santaella S. T. Immobilization of microbial cells: A promising tool for treatment of toxic pollutants in industrial wastewater // African J. Biotechnol. 2013. V. 12(28). P. 4412-4418.

2. Ившина И. Б., Гришко В. В., Ноговицина Е. М., Кукина Т. П., Толстиков Г. А. Биотрансформация p-ситостерола и его сложных эфиров актинобактериями рода Rhodococcus // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. №»6. С. 626-633.

3. Ноговицина Е. М., Гришко В. В. Ившина И. Б. Биокаталитическое получение фармакологически перспективного стигмаст-4-ен-3-она с использованием клеток родококков // Биоорганическая химия. 2011. №5. С. 697-704.

4. Гришко В. В., Ноговицина Е. М., Ившина И. Б. Оптимизация условий биокаталитического получения стигмаст-4-ен-3-она//Химия природных соединений. 2012. N° 3. 390-392.

5. Use of stigmasta-4-en-3-one in the treatment of androgen dependent disease. Pat. 5264428, USA / S.Streber. - Appl. No. 876.131; Filing Date. 29.04.1992.; Publication Date. 23.11.1993.

6. Alexander-Lindo R. L., Morrison E. Y. S. A., Nair M. G. Hypoglycaemic Effect of Stigmast-4-en-3-one and its corresponding alcohol from the bark of Anacardium occidentale (Cashew) // Phytother. Res. 2004. V. 18. P. 403-407.

7. Barla A., Birman H., Kultur S., Oksuz S. Secondary metabolites from Euphorbia helioscopia and their vasodepressor activity // Turk. J. Chem. 2006. V. 30. P. 325-332.

8. Wilmanska D., Dziadek J., Sajduda A., Milczarek K., Jawor-ski A., Murooka Y. Identification of cholesterol oxidase from fast-growing mycobacterial strains and Rhodococcus sp. // J. Ferment. Bioeng. 1995. V. 79 P. 119-124.

0

0

Поступила в редакцию 23.09.2014 г.

ISSN 1998-4812

BecTHHK BamKHpcKoro yHHBepcureTa. 2014. T. 19. №3

861

THE SEARCH OF OPTIMAL RHODOCOCCI IMMOBILIZATION CARRIERS FOR B-SITOSTEROL BIOTRANSFORMATION

© E. M. Nogovitsina1*, G. A. Bazhutin2, V. V. Grishko3

1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms Ural Branch of Russian Academy of Sciences 13 Golev St., 614081 Perm, Russia.

2Perm State University 15 Bukirev St., 614990 Perm, Russia.

3Institute of Technical Chemistry, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences 3 Akademika Koroleva St., 614013 Perm, Russia.

Phone: +7 (342) 280 81 14.

*Email: nogov@iegm.ru

The genus Rhodococcus actinobacteria deposited in the Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms (official acronym IEGM, World Federation for Culture Collections #768, www.iegm.ru/iegmcol) were used in the researches of p-sitosterol biotransformation process by bacterial cells immobilized on the different solid carriers. It was shown that the level of the p-sitosterol transforming activity of rhodococci has no direct dependence on the degree of bacterial adsorption on the carriers. It was found that R. ruber IEGM 233 cells efficiently (to 94%) adsorbed on the surface of catalytic carbon fiber after the immobilization oxidized no more than 5% p-sitosterol to produce a pharmacologically active compound stigmast-4-en-3-one. Optimal conditions of p-sitosterol oxidative biotransformation by rhodococci cells fixed on technical polymer fabric were determined. It was found that the level of p-sitosterol transforming ability by Rhodococcus strains immobilized on this carrier varied from 2 to 64%. R. ruber IEGM 220 and IEGM 233 bacterial cultures catalyzing oxidative biotransformation of p-sitosterol to stigmast-4-en-3-one most efficiently (more than 40%) were selected.

Keywords: biotransformation, genus Rhodococcus actinobacteria, immobilization, fi-sitosterol, stigmast-4-en-3-one.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Martins S. C. S., Martins C. M., Fiuza L. M. C. C., Santaella S. T. African J. Biotechnol. 2013. Vol. 12(28). Pp. 4412-4418.

2. Ivshina I. B., Grishko V. V., Nogovitsina E. M., Kukina T. P., Tolstikov G. A. Prikl. biokhimiya i mikrobiologiya. 2005. No. 6. Pp. 626-633.

3. Nogovitsina E. M., Grishko V. V. Ivshina I. B. Bioorganicheskaya khimiya. 2011. No. 5. Pp. 697-704.

4. Grishko V. V., Nogovitsina E. M., Ivshina I. B.Khimiya prirodnykh soedinenii. 2012. No. 3. 390-392.

5. Use of stigmasta-4-en-3-one in the treatment of androgen dependent disease. Rat. 5264428, USA / S.Streber. - Appl. No. 876.131; Filing Date. 29.04.1992.; Publication Date. 23.11.1993.

6. Alexander-Lindo R. L., Morrison E. Y S. A., Nair M. G Phytother. Res. 2004. Vol. 18. Pp. 403-407.

7. Barla A., Birman H., Kultur S., Oksuz S. Turk. J. Chem. 2006. Vol. 30. Pp. 325-332.

8. Wilmanska D., Dziadek J., Sajduda A., Milczarek K., Jaworski A., Murooka Y. J. Ferment. Bioeng. 1995. Vol. 79 Pp. 119-124.

Received 23.09.2014.