CC BY
49
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2015 БИОЛОГИЯ Вып* 3
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.66+547.92
Г. А. Бажутин% Е. М. Ноговицннл\ В. В. Грншко", И. Б. Ившина" ь
а Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Пермь, Россия с Институт технической химии УрО РАН, Пермь. Россия
БИОТРАНСФОРМИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ РОДОКОККОВ В ОТНОШЕНИИ НАСЫЩЕННЫХ СТЕРННОВ
Исследована способность родококков, принадлежащих к видам Rhodococcus erythropoiis и Rhodococcus ruber, к биотрансформашш стерииов с насыщенным углеродным остовом на примере 5а-холестана и его Зр-гидроксипроизводного. Отобраны штаммы, трансформирующие в присутствии д-гексадекана или глюкозы 5а-холестан-Зр-ол с образованием 90-100% 5а-холестан-3-она, Методом тонкослойной хроматографии проведен качественный анализ смесей продуктов биотрансформации Зохолестана штаммами R, erythropoiis и R. ruber, В ряде экстрактов обнаружены соединения, не совпадающие по значению Rf с 5а-холестаном.
Ключевые слова: стерины; родококки; холесганол; холестан.
G. A. Bazhutin', Ye. M. Nogovitsinab, V. V. Grishko% L B. Ivshina"b
H Perm Slale University. Perm. Russian Federation
b Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Perm. Russian Federation c Institute of Technical Chemistry, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm. Russian Federation
BIOTRANSFORMATION ACTIVITY OF RHODOCOCCI TOWARDS SATURATED STERINES
This study describes the possibility of Rhodococcus erythropoiis and R, ruber members to biotran-formation sterines with a saturated carbon skeleton like 5a-cholestane and its 3p-liydroxy derivative 5a-cholestan-3p-ol. We selected strains that can transform 5a-cholestan-3p-ol to 5a-cholestan-3p-one with 90-100% effectiveness. Using a thin-layer chromatography, we performed the qualitative analysis of 5a-cholestane biotranformation products by rliodococci. In some extracts a coin-pounds that Rf value do not coincide with 5a-cholestane have been found.
Key words: sterines; rhodococci; cholestanol; cholestane.
Введение
Природные стерины (холестерол. Р-ситостерол, в частности), характеризующиеся наличием 3|> гцлроксильной группы и двойной связи при С-5, эффективно трансформируются бактериями с образованием физиологически активных соединений стероидной структуры [Malaviya. Gomes, 2008; Bhatti, Kliera, 2012]. Способность микроорганизмов к модификации стеринов с насыщенным углеродным остовом (производных 5а-холестана) практически не изучена. Опи-
сан единичный пример биотрансформации [Microbial 1991] 2о^За-дащщюкси-5-холссган-6ч)на Mycobacterium vaccae Zimct 11094 с образованием андростаиовых соединений (рис. 1).
Известно, что многие производные насыщенных стеринов обладают выраженной гормональной, противоопухолевой и антиангиогенной активностью [Factors .... 2008, Brassinosteroids.... 2012]. Стераны. в том числе 5а-холестан (рис. 2, 1), являются типичными компонентами сырой нефти [Seifert. Moldowan, 1979], что делает изучение процесса их биодеградации актуальным. L.J. Mul-
С, БажутинГ. А., Ноговицина Е. М , Гришко В. В., ИвшинаИ. Б., 2015
228
Биорансформируюиуая активность родококков в отношении насыщенных стертое 229
heirn и J, Van Еук [1981] с помощью метода ра- вители актинобактерий проявляют окислительную
диоуглеродной метки предположили, что предста- активность в отношении 5а-[4-14С) холестана.
но
но
но
но
г
он
2 а,За,6а-Т риг ид роке и-5а-a нд рост» н-17-он
НО
201,301 -Дигидрокси-5а-холестян-6-он
О
2 а-1 ид риксн il нд рис 1-4 -3 » 17-д и он
Рис. I. Биотрансформация 2аЗ а-дигидрокси-5-холестан-6-она клетками Л/, vaccae Zimet 11094
[Microbial .... 1991J
HO1
(1) (2) (3)
Рис. 2> Структуры 5а-холестана (1), ß-ситостерола (2), стигмаст-4-ен-З-она (3)
Ранее нами [Ноговицина, Гришко. Ившинак 2011: Гришко, Ноговицина. Ившина. 2012] показана способность представителей Rhodococ-cus erythropolis и R. ruber катализировать в присутствии w-гексадекана и глюкозы окисление Зр-гидроксильной группы ß-ситостерола (рис. 2, 2) и изомеризацию его двойной связи при С-5 в положение 4 с образованием 25-98%-ного стигмаст-4-ен-З-она (рис. 2, 3). обладающего гипогликеми-ческой и вазодепрессивиой активностью, а также перспективного для лечения андроген-зависимых заболеваний [Alexander-Lindo, Morrison, Nair. 2004; Secondary .... 2006, Streber. 1993].
Цель работы - оценка способности родококков к биотрансформации 5а-холестана и его Зр-гидроксипроизводного в присутствии ростовых субстратов.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы родококков из Региональной профилированной коллекции алка-нотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768. w\wv. iegm.ru/iegmcol). принадлежащие к видам Rhodococcus erythropolis (11 штаммов) и R. ruber (9 штаммов).
Родококки выращивали в условиях периодического культивирования на орбитальном шсйксрс (150 об/мин) при температуре 28°С. Базовый состав минеральной среды включал следующие компоненты (г/л): KN03 - 1.0; КН2Р04 - 1.0: К2НРО<-1.0; NaCl - 1.0; MgS04 - 0.2; СаС12 * 2Н20 - 0.02. В среду дополнительно вносили 1.0 г/л дрожжевого экстракта и 0.1 об.% микроэлементов по По-стгсйту [Романснко, Кузнецов, 1974]. В качестве посевного материала использовали родококки (5.0* 105 кл/мл)? выращенные на скошенном мясо-пситонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста. 5а-Холсстан или 5а-холестан-3|3-ол добавляли в срсду в концентрации 0.5 г/л в виде 10%-ного раствора в изопропаноле через 2 суг. роста бактериальных клеток в присутствии 0.1 об.% w-гексадекана или 1.0%-ной глюкозы.
Продукты бактериального окисления субстратов экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные этилацетатные вытяжки промывали насыщенным водным раствором NaCl и сушили с помощью обезвоженного Na2S04, Качественный анализ полученных смесей проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагслс с использованием пластин с флуоресцентной добавкой (Merck, Германия). Наличие продуктов биотрансформации определяли с помощью УФ облучателя LG/58 (Россия) и опрыскиванием пластин 5%-ной H2SO4 с последующим про-
230
Г. А. Бажутин, Е. М Ноговицына, В. В. Гртико, И. Б. И вши на
греванием при 95-100°С в течение 2-3 мин. Соотношение продуктов биотрансформации 5а-холестан-зр-ола подтверждали данными хромато-масс-спектрометрии с использованием системы Agilent 6890/ 5973N (кварцевая колонка HP-5MS SN US 15189741-1) Agilent technology . США. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью компьютерной программы Excel 2003. рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Эксперименты проводили в 3-кратной повторности.
vC
сГ4
X
0
1
СП
I
Отобраны культуры Я. егуЖгороНя ИЭГМ 490. ИЭГМ 766 и ИЭГМ 1018. обладающие высокой (87-100%) биотрансформирующей активностью в отношении исходного соединения. Выявлено, что штаммы Я. егугЬгоро/м ИЭГМ 10. ИЭГМ 769 и ИЭГМ 1179 эффективно трансформируют 5а-холестан-ЗР-ол только в присутствии глюкозы. При использовании //-гексадекана в качестве ростового субстрата их активность снижается в 1.3-3.3 раза.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что трансформирующие Р-сито-стерол коллекционные штаммы родококков способны аналогичным образом (по Зр-положению) окислять 5а-холестан-Зр-ол с образованием 5а-холестан-3-она (рис. 3). уровень содержания которого в сумме продуктов реакции варьирует от 20 до 100% (рис. 4).
С использованием метода ТСХ проведен качественный анализ проду ктов биотрансформации 5а-холестана штаммами R. erythropolis и R. ruber. В ряде экстрактов обнаружены соединения, не совпадающие по значению Rf с 5а-холестаном (рис. 5).
Отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 10, ИЭГМ 267. ИЭГМ 487, ИЭГМ 769. ИЭГМ 1140, ИЭГМ 1167. ИЭГМ 1179 и R. ruber ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220 для дальнейшего исследо-
IIО
100
80
60
40
20
СГ
5а-холестан-ЗР-ол 5а-холестан-3-он
Рис. 3. Биотрансформация 5а-холестан-Зр-ола родококками
u ¡Пшик
—« \о оо as
О* СО О ОЧ <4
Г-
^ — —
а ?
- = 2
— СЧ СЧ <N СЧ
£> О
£ £
и
£
s в в §
с
JS
я; яй £ £
oq
£
ос
Рис. 4. Биотрансформация 5а-холестан-Зр-ола родококками в присутствии глюкозы ■ или //-гексадекана □. Приведены данные после 5 сут. процесса биотрансформащш
Биорансформируюиуая активность родококков в отношении насыпанных стеринов 231
вания биотрансформирувдщей активности родо- her к биотрансформации 5а-холестана и его 3ß-
кокков в отношении 5а-холестана. Заключение
Проведена оценка способности родококков. принадлежащих к игтаммам К. егухЬгороНБ и Я. ги-
сз О О О О
О
о
гидроксипроизводного. В качестве основного продукта биотрансформации последнего идентифицирован 5а-холестан-3(3 -он. степень образования которого достигала 100%.
<о
О
CD
О
О
О
О О
•о> о
о
«о
1
8
10
И
12
Рис. 5. Схема тонкослойной хроматографии экстрактов продуктов трансформации 5а-холсстана:
I - 5а-холестан, 2 - 5а-холеетан-3р-ол, Штаммы R. etythropotis: 3 - ИЭГМ 769, 6 - ИЭГМ 1167, 8 - ИЭГМ 1140, 9 - ИЭГМ 487. 11 - ИЭГМ 267, 12 - ИЭГМ 1179, R. ruber: 4 - ИЭГМ 86, 5 - ИЭПЛ 220. 7 - ИЭГМ 85, 10 - ИЭГМ 172. Эксперименты проводили в присутствии к-гексадекана, В пробах 3 и 4 обнаружены соединения, детектируемые в УФ3 в остальных - после опрыскивания в 5%-иой H2S04
Работа выполнена при поддержке фантов Российского научного фонда (14-14-00643), РФФИ и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (проект № 14-04-96005-
р_>рал_а).
Библиографический список
Гришко B,B,S Ноговицина Е.А/., Ившина И. Б. Оптимизация условий биокаталитического получения стигмаст-4-ен-З-она // Химия природных соединений. 2012. № 3. С. 390-392. Ноговицина ЕМ., Гришко ВВ., Ившина И Б. Био-каталитичсскос получение фармакологически перспективного стигмаст-4-ен-З-она с использованием клеток родококков // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. №5. С. 697-704. Романенко BJL, Кузнецов CJL Экология микроорганизмов пресных водоемов. Л.: Наука. 1974. 194 с
4fexanrfer-1indo R.Г.. Morrison F.Y.S.A., Nair M.G. Hvpoglycaemic effect of stigmast-4-en-3-one and its corresponding alcohol from the bark of Ana-cardium occidentale (Cashew) // Phytotherapy Research. 2004. Vol. 18, № 5. P. 403-407. Bhatti H.N.. KheraRA. Biological transformations of steroidal compounds: a review // Steroids. 2012. Vol. 712. P. 1267-90. Brassinosteroids inhibit in vitro angiogenesis in human endothelial cells / L. Rarova et al. // Steroids. 2012. Vol. 77. № 13. P. 1502-9.
Factors influencing the steroid profile in doping control analysis / U. Mareck et al. Ii Journal of Mass Spectrometry* 2008. Vol. 43, № 7. P. 877-91. Maîaviva ,4., Gomes J. Androstcncdionc production by biotransformation of phytosterols // Bioresource Technology. 2008. Vol. 99, № 15. P. 6725-6737. Microbial degradation of 2ot.3a-dihvdroxv-5a-clioleslan-6-oiie b\ Mycobacterium vaccae / H. Vorbrodt ct al. // Steroids. 1991. Vol. 56, № 12. P. 586-588.
Mülheim L.J., Van Evk J. Microbiological Oxidation of Steroid Hydrocarbons fi Journal of General Microbiology. 1981. Vol. 126. P. 267-275. Secondary metabolites from Euphorbia he/ioscopia and their vasodepressor activity / A. Bar la et al. // Turkey Journal of Chemistrv. 2006. Vol. 30. P. 325-332.
Seifert W.K., Mohhwan J.M. The effect of biodégradation on stcrancs and tcrpancs in crudc oils // Geochimica et cosmochimica Acta. 1979. Vol. 43. P 11-126
Streber A.S. Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent disease // US Patent. 1993. No. 5264428.
References
Grishko V.V., Nogovitsina E.M., Ivshina I.B. [Optimization of conditions for biocatalytic production of stigmast-4-en-3-one]. Khimiya prirodnyh soedi-neniy. V. 48. N 3 (2012): pp. 432-4.15, (TnRusS.).
232
Г. А. Бажутт, Е. M Ноговицина, В. В. Гришка, И. Б. H вши на
Nogovitsina ЕМ.. Gricliko V.V., Ivshina I.В. [Bio-catalytic rccciving of phannacological pcrspcctivc stigmast-4-ene-3-one using rhodococcus cells]. Bioorganicheskaya khtmiya V. 37. N 5 (2011): pp, 687-704, (In Russ). Romanenko V.I., KuznetSOv S.I. Ecologiya microor-gamzmov presnovodnykh vodoyemov [Ecology of freshwater pond microorganisms]. Leningrad. Nauka Publ, 1974. 194 p. (in Russ). Alexander-Lindo R,L.. Morrison E.Y.S.A.. Nair M,G. Hvpoglvcaemic effect of stigmast-4-en-3-one and its corresponding alcohol from the bark of Anacardium occidentale (Cashew), Phytotherapy Research. V. 18. N 5 (2004): pp. 403-407. Bhatli H,N,, Khera R.A. Biological transfomiations of steroidal compounds: a review. Steroids. V. 77. N 12 (2012): pp, 1267-1290, Rarova L.. Zahler S.t Liebl J., KryStof V.fc Sedlak D.t Bartiinek P. Kohout L, Strnad M. Brassinosteroids inhibit in vitro angiogenesis in human endothelial cells. Steroids. V, 77, N 13 (2012): pp. 1502-1509.
Mareck U.. Gever H. Opfermann G, Thevis MK Schrinzer W, Factors influencing the steroid profile in doping control analysis. Journal of Mass Spectrometry. V. 43, N 7 (2008): pp. 877-891.
Об авторах
Бажутин Григорий Андреевич, студент биологического факультета ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева. 15; Sniffedby-badger f^gmai 1. com
Ноговицина Екатерина Михайловна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории алканотрофных микроорганизмов ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
614081. Пермь. \л. Голева, 13; nogovrft:iegin.ru; (342)2808114
Гришко Виктория Викторовна, кандидат химических туте, заведующий лабораторией биологически активных соединений ФГБУН Институт технической химии УрО РАН 614013, Пермь, Академика Королева, 3; gnshvic@gmail.com; (342)2378265
Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических наук, член-корр. РАН, ■заведующий лабораторией алканотрофных м икрооргантмов
ФГБУН Институт экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН
614081. Пермь, ул. Голева. 13; ivshinaSiiegm.ru;
(342)2808114
профессор кафедры микробиологии и иммунологии
ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990. Пермь, ул. Букирева, 15
Malaviva A.. Gomes J. Androstenedione production by biotransformation of phvtostcrols. Bioresource Technology. V. 99, N 15 (2008): pp. 6725-6737.
Vorbrodt. H.. Adam. G., Porzel. A.. Hörhold. С.. Dünhardt. S.. Böhme. К. Microbial degradation of 2a 3a-dihydroxv-5a-clioleslaii-6-one bv Mycobacterium vaccae. Steroids. V, 56, N 12 (1991): pp. 586-588.
Mulheirn L.J., Van Eyk J, Microbiological Oxidation of Steroid Hvdrocarbons. Journal of General Microbiology. V. 126(1981): pp. 267-275.
Barla A., Birman H., Kultur S.. Öksüz S, Secondary metabolites from Euphorbia helioscopia and their vasodepressor activity, Turkey Journal of Chemistry. V. 30 (2006): pp, 325-332,
Seifert W.K., Moldowan J.M. The effect of biodégradation on steranes and terpanes in crude oils, Geochimica et cosmochimica Acta. V. 43 (1993): p. 111-126,
Streber A.S, Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent disease. US Patent. (1993). No. 5264428,
Посту пила в редакцию 17 .08,2015
About the authors
Bazhutin Grigory Andreevich, Student of Biological faculty
Perm State University . 15, Bukirev str., Pemu Russia, 614990; sniffedbybadger@ginail.coin
Nogovitsina Yekaterina Mikhaylovna, Candidate of biology* rcscarchcr of Laboratory of Alkanotrophic Microorganisms
institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; nogovi® iegm.ru; (342)2808114
Grisliko Victoria Victorovna, Candidate of chemistry, head of Laboratory of Biologically-Active Compounds
Institute of Technical Chemistry, UB RAS. 3, Akad. Korolcva str., Perm. Russia. 614013; (342)2378265; grisliko@itch.perm.ru
Ivshina Irena Borisovna. Corresponding Member of
RAS. doctor of biology , head of Laboratory' of
Alkanot rophic Microorganisms
Institute of Ecology and Gcnctics of Microorganism
UB RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081;
ivshinaitf iegm.ru; (342)2808114
professor of Department of Microbiology and
Immunology
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm. Russia, 614990
