CC BY
32
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2009 Биология Вып. 10 (36)
УДК 57.088.6+577.175.62
ВЛИЯНИЕ ИНДУКТОРОВ ХОЛЕСТЕРОЛОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК РОДОКОККОВ НА ПРОЦЕСС БИОКОНВЕРСИИ Р-СИТОСТЕРОЛА
Е.М. Ноговицина3, В.В. Гришкоь, И.Б. Ившина а,с
аИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ЬИнститут технической химии УрО РАН, 614013, Пермь, ул. Академика Королева, 3 сПермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Исследована возможность индукции холестеролоксидазной активности родококков в отношении р-ситостерола. Показано, что холестеролоксидазная реакция более эффективно катализируется родококками в присутствии алифатических кислот, что приводит к увеличению степени образования стигмаст-4-ен-3-она из Р-ситостерола. Так, в присутствии пальмитиновой кислоты родококки катализируют образование стигмаст-4-ен-
3-она до 55 %.
Для получения оксигенированных стеролов и андростановых производных на основе доступных стериновых спиртов растительного, животного и микробного происхождения наиболее перспективно использование интактных клеток микроорганизмов, катализирующих реакции окисления с высокой степенью регио- и стереоселективности. В настоящее время выделены и охарактеризованы ферменты микроорганизмов, ответственные за синтез ключевых продуктов процесса биотрансформации стеролов. На первом этапе окислительной трансформации стеролов с помощью бактериальных клеток образуются 4-ен-3-оновые производные (рис. 1), синтез которых катализируется бифункциональным ферментом - холестеролокси-дазой (Toyama et.al, 2002). На основе данной реакции разработан ферментативный метод диагностики уровня холестерола в биологических жидкостях и современные технологии переработки холесте-ролсодержащего сырья в диетические продукты посредством превращения холестерола в холест-4-ен-3-он (MacLachlan et al., 2000). Обоснована возможность использования стигмаст-4-ен-3-она, образующегося при окислении холестеролоксидазой растительного ß-ситостерола, в качестве лекарственного средства при лечении эндокринных заболеваний ( Streber, 1993).
Ранее нами было установлено, что родококки, обладающие способностью трансформировать широкий спектр труднодоступных для других микроорганизмов органических субстратов, являются эффективными катализаторами процесса биоконверсии ß-ситостерола. Определены оптимальные условия процесса биотрансформации ß-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он клетками ро-дококков, предполагающие использование изо-
пропанола в качестве растворителя данного стеро-ла, ростового субстрата н-гексадекана и представителей R. ruber как наиболее эффективных биокатализаторов процесса конверсии Р-ситостерола (Ившина и др., 2005; Ноговицины и др., 2007).
Цель настоящей работы - поиск новых альтернативных методов повышения эффективности процесса биоконверсии Р-ситостерола в стигмаст-
4-ен-3-он клетками родококков.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы R. erythropolis ИЭГМ 487 и R. ruber ИЭГМ 233 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (Каталог ..., 1994;
http://www.iegm.ru/iegmcol/). Клетки родококков выращивали в условиях периодического культивирования в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на орбитальных шейкерах (150 об/мин) при температуре 28оС. Базовый состав минеральной среды включал следующие компоненты (г/л): KNO3 -1,0; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 х 3H2O - 1,0; NaCl -1,0; MgSO4 х 7H2O - 0,2; CaCl2 х 2H2O - 0,02 (Каталог ..., 1994). В среду добавляли 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,1 об.% микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). В различных экспериментах р-ситостерол (0,5 г/л) вводили одновременно с внесением культуры или через 1-3 сут роста бактериальных клеток в 5,0 мл изопропанола. В ростовую среду дополнительно вносили 0,79 мМ н-декана, н-ундекана, н-додекана, н-гексадекана или н-октадекана, а также декано-вой, ундекановой, лауриновой, тридекановой, пен-тадекановой, пальмитиновой или стеариновой ки-
© Е. М. Ноговицина, В. В. Гришко, И. Б. Ившина, 2009
119
слот в 1 мл изопропанола. При проведении экспериментов по биотрансформации Р-ситостерола в соокислительных условиях в качестве ростового субстрата в базовую минеральную среду добавляли 0,1 об. % н-гексадекана. В качестве посевного материала использовали родококки (5,0 х 105 клеток/мл), выращенные на мясопептонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста.
Продукты бактериального окисления экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные этилацетатные вытяжки промывали насыщенным водным раствором NaCl, высушивали с помощью обезвоженного Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя. Образование стигмаст-4-ен-3-она контролировали методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием флуоресцентных пластин (Merck, Германия) и ультрафиолетовой лампы КФ-4М (Россия). Экспрессное определение содержания Р-ситостерола в культуральной жидкости проводили ферментативным методом ( Allain et al., 1974) с детекцией при 500 нм на спектрофотометре Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США). При этом использовали коммерческую тест-систему контроля уровня холестерола (ООО «Ольвекс Диагности-кум», Санкт-Петербург). Количественный анализ продуктов биотрансформации Р-ситостерола осуществляли методом УФ-спектроскопии на спектрофотометре Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США). Для определения содержания стигмаст-4-ен-3-она 1 мг пробы растворяли в 1 мл этанола. Величину
абсорбции полученных растворов измеряли при длине волны 240 нм, при расчетах учитывали коэффициент экстинкции целевого продукта (е) -12,2-т3 М-1см-1 ( Kreit et al., 1994).
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерной программы Excel 2003, рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Все эксперименты проводили в 3 кратной повторности.
Результаты и их обсуждение
На рис. 2. приведены данные исследования динамики образования стигмаст-4-ен-3-она R. ruber ИЭГМ 233 в присутствии н-гексадекана. Установлено, что максимальная (0,25 г/л) степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигается в условиях добавления стерола через 2 сут от начала эксперимента.
Известно (Halpern, 1981), что в качестве индукторов холестеролоксидазной активности микроорганизмов наряду с н-алканами применяются алифатические кислоты в свободном или связанном виде. При исследовании влияния свободных органических кислот на эффективность холестеролок-сидазной реакции использовали штамм R. erythropolis ИЭГМ 487, катализирующий в присутствии н-алканов образование стигмаст-4-ен-3-она в количестве лишь 7,0-11,6 % (табл. 1).
HO
O
Холестерол (R = H) Кампестерол (R = CH3) ß-Ситостерол (R = C2H5)
Холест-4-ен-3-он (R = H) Кампест-4-ен-3-он (R = CH3) Стигмаст-4-ен-3-он (R = C2H5)
O
O
Рис. 1. Основные пути биотрансформации стеролов бактериальными клетками Mycobacterium spp.; Rhodococcus spp.; Moraxella spp. и др. (по. Fernandes et al., 2003)
Время, сут
Рис. 2. Динамика образования стигмаст-4-ен-3-она из Р-ситостерола клетками R. ruber ИЭГМ 233. При добавлении Р-ситостерола в среду с н-гексадеканом 1 - одновременно с внесением культуры, 2 -через 1 сут роста культуры, 3 - через 2 сут, 4 - через 3 сут.
Таблица 1
Биотрансформация Р-ситостерола R. erythropolis ИЭГМ 487 в присутствии углеводородов
Индуктор Сумма продуктов реакции, г/л Содержание в сумме продуктов реакции, г/л
Р-Ситостерола* Стигмаст-4-ен-3 -она
Без добавления индукторов (контроль) н-Декан (С10) н-Ундекан (С11) н-Додекан (С12) н-Гексадекан (С16) н-Октадекан (С18) 0,55 ± 0,002 0,33 ± 0,105 0,44 ± 0,024 0,28 ± 0,071 0,39 ± 0,050 0,46 ± 0,061 0,48 ± 0,001 0,25 ± 0,014 0,38 ± 0,006 0,22 ± 0,004 0,28 ± 0,012 0,42 ± 0,001 0,06 ± 0,008 (10,9)** 0,04 ± 0,006 (11,6) 0,05 ± 0,005 (11,4) 0,04 ± 0,004 (11,4) 0,04 ± 0,007 (10,3) 0,03 ± 0,000 (7,0)
Примечание. *Р-Ситостерол добавляли одновременно с внесением культуры. **Здесь и в табл. 2 в скобках приведено процентное содержание стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов биотрансформации.
При использовании в качестве индукторов алифатических кислот (табл. 2) уровень холестро-локсидазной активности значительно повышается по сравнению с таковым в присутствии н-алканов. При этом максимальное количество стигмаст-4-ен-3-она достигается при внесении Р-ситостерола в минеральную среду одновременно с инокулятом. Степень образования стигмаст-4-ен-3-она зависит от объема алкильного фрагмента алифатической кислоты, используемой в качестве индуктора. Так, в присутствии кислот с количеством углеродных атомов Сш-С^ среди продуктов биотрансформации обнаруживается лишь следовое количество целевого стигмаст-4-ен-3-она. Существенное повышение уровня конверсии Р-ситостерола в стиг-маст-4-ен-3-он наблюдается в присутствии кислот
Сі3-Сі8 (табл. 2), среди которых более эффективно индуцируют холестеролоксидазную реакцию алифатические кислоты с четным числом атомов углерода. При этом максимальная (до 55 %) степень образования стигмаст-4-ен-3-она из Р-ситостерола регистрируется при использовании пальмитиновой кислоты (С16).
Об особенностях индукции холестеролокси-дазной активности родококков в присутствии н-алканов или органических кислот судили по результатам сравнительного эксперимента с использованием н-гексадекана и пальмитиновой кислоты, имеющих одинаковый алкильный радикал. Обнаружено, что в течение первых 3 сут характер накопления стигмаст-4-ен-3-она в присутствии данных соединений практически не изменяется, затем в
присутствии пальмитиновой кислоты в среде биотрансформации регистрируется резкое увеличение концентрации стигмаст-4-ен-3-она. По-видимому, наличие карбоксильной группы в алифатическом индукторе способствует более эффективному катализу реакции р-окисления, которая, по мнению Халпэна (На1рет, 1981), на генетическом уровне связана с холестеролоксидазной реакцией.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что использование алифатических кислот в качестве индукторов холе-
стеролоксидазной активности позволяет существенно повысить (до 55,3 %) выход стигмаст-4-ен-3-она и сократить в 1,5 раза продолжительность процесса биоконверсии р-ситостерола (с 7 до 5 сут).
Работа поддержана грантами «Ведущие научные школы Российской Федерации» № НШ-4112.2008.4 и грантом междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.
Таблица 2
Биотрансформация Р-ситостерола К. егуЬгоро^ ИЭГМ 487 в присутствии алифатических кислот
Индуктор Сумма продуктов реакции, г/л Содержание в сумме продуктов реакции, г/л
Р-Ситостерола Стигмаст-4-ен-3 -она
Без добавления индукторов (контроль) 0,55 ± 0,002 0,48 ± 0,001 0,06 ± 0,008 (10,9)
Декановая кислота (Сю) 0,41 ± 0,030 0,34 ± 0,035 (<1,0)
Ундекановая кислота (Си) 0,31 ± 0,042 0,28 ± 0,012 (<1,0)
Лауриновая кислота (С12) 0,46 ± 0,023 0,45 ± 0,004 (<1,0)
Тридекановая (С13) 0,23 ± 0,018 0,14 ± 0,043 0,06 ± 0,006 (26,1)
Пентадекановая (С15) 0,24 ± 0,060 0,21 ± 0,006 0,02 ± 0,003 (8,3)
Пальмитиновая кислота (С^) 0,38 ± 0,019 0,17 ± 0,004 0,21 ± 0,019 (55,3)
Стеариновая кислота (С18) 0,38 ± 0,025 0,24 ± 0,004 0,12 ± 0,006 (31,6)
Время, сут
Рис. 3. Динамика образования стигмаст-4-ен-3-она клетками К. erythropolis ИЭГМ 487 при добавлении в качестве индукторов: пальмитиновой кислоты (1) или н-гексадекана (2).
Библиографический список
Ившина И.Б. Биотрансформация Р-ситостерола и сложных эфиров Р-ситостерола актинобак-териями рода Rhodococcus / И.Б. Ившина, В.В. Гришко, Е.М. Ноговицина, Т.П. Кукина, Г.А. Толстиков // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 6. С. 626-633. Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994. 163 с.
Ноговицина Е.М. Актинобактерии рода Rhodo-coccus как биокатализаторы процесса трансформации р-ситостерол / Е.М. Ноговицина,
B.В. Гришко, И.Б. Ившина // Вестник Оренбург. гос. ун-та. 2007. № 75. С. 248-249.
Романенко В.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. / В.И. Романенко,
C.И.Кузнецов. Л.: Наука, 1974. 194 с.
Allain C.C. Enzymatic determination of total serum
cholesterol / C.C. Allain, L.S. Poon, C.S.G. Chan, W. Richmond, P.C. Fu // Clin. Chem. 1974. Vol. 20. P. 470-475.
Fernandes P. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments / P. Fernandes, A.
Cruz, B. Angelova, H.M. Pinheiro, J.M.S. Cabral // Enzyme Microb. Technol. 2003. Vol. 32, № 6. P. 688-705.
Halpern M.G. Cholesterol oxidase from bacteria. Industrial enzymes from microbial sources / M.G. Halpern // Chem. Technol. Rev. 1981. Vol. 186. P. 3-22.
Kreit J. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus erythropolis. / J. Kreit, G. Lefeb-vre, P. Germain // J. Biotechnol. 1994. Vol. 33. P. 271-282.
MacLachlan J. Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications. / J. MacLachlan, A.T.L. Wotherspoon, R.O. Ansell,
C.J.W. Brooks // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 72. P. 169-195.
Streber S. Use stigmasta-4-en-3-on in the treatment of androgen dependent disease / S. Streber. Patent 5264428 USA. 23.11.1993.
Toyama M. Alteration of substrate specificity of cholesterol oxidase from Streptomyces sp. by site-directed mutagenesis / M. Toyama, M. Ya-mashita, M. Yoneda, A. Zaborowski, M. Naga-to, H. Ono, N. Hirayama, Y. Murooka //. Protein Eng. 2002. Vol. 15, № 6. P. 477-484.
Influence of cholesterol oxidase activity inductors in rhodococci cells on p-sitosterol bioconversion
Ye.M. Nogovitsina, V.V. Grishko, I.B. Ivshina
Possible induction of cholesterol oxidase activity of rhodococci cells towards p-sitosterol bioconversion was investigated. It was shown that rhodococci more effectively catalyzed cholesterol oxidase reaction in the presence of aliphatic acids; this resulted in the increased levels of stigmast-4-ene-3-one formation from p-sitosterol. Thus, rhodococci cells catalyzed up to 55 % stigmast-4-ene-3-one formation in the presence of palmitic acids.
