Кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе Текст научной статьи по специальности «Математика»

УДК 531/534: [57+61]

Российский Журнал

www.biomech.ru

КИНЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ

М.С. Куюкина*, И.Б. Ившина*, М.А. Осипенко**, Ю.И. Няшин**,

А.Н. Тюленёва**, М.К. Серебренникова***, А.В. Криворучко***

* Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]

** Кафедра теоретической механики Пермского государственного технического университета, Россия, 614990, Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: [email protected]

*** Кафедра микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, Россия, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Аннотация. Разработана кинетическая модель процесса иммобилизации бактерий рода Rhodococcus на твердом носителе, представляющем собой гидрофобизованные хвойные опилки. Полученные в рамках модели теоретические результаты согласуются с экспериментальными данными по адсорбционной иммобилизации клеток родококков в различных гидродинамических условиях, т.е. при заданных значениях круговой частоты (ш) движения платформы орбитального шейкера. На основании разработанной модели рассчитаны основные кинетические параметры процесса иммобилизации бактериальных клеток и определено оптимальное значение ш.

Ключевые слова: бактериальные клетки, Rhodococcus, иммобилизация, твердый носитель, круговая частота движения, математическое моделирование, кинетические уравнения.

Введение

Иммобилизация бактериальных клеток есть процесс их закрепления, то есть ограничения движения в пространстве. Иммобилизованные клетки обладают рядом преимуществ по сравнению со свободными клетками: повышенной

жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды, высокой каталитической активностью. Кроме того, иммобилизация позволяет концентрировать большие количества биомассы и избегать ее значительных потерь, что важно в условиях биореактора или при внесении бактериальных клеток в окружающую среду. Применение иммобилизованных клеток имеет экономические преимущества по сравнению с традиционными процессами биосинтеза на основе свободных клеток микроорганизмов. Так, иммобилизация позволяет многократно использовать однажды выращенные микробные клетки, что приводит к снижению затрат на производство биомассы.

При иммобилизации живых бактериальных клеток часто используют метод адсорбции, то есть иммобилизации клеток на поверхности носителя при отсутствии диффузионного барьера. В качестве адсорбентов применяют большое количество

© Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Тюленёва А.Н.,

Серебренникова М.К., Криворучко А.В., 2007

09806267

минеральных и органических материалов природного и искусственного происхождения. Для иммобилизации клеток алканотрофных родококков, характеризующихся гидрофобной клеточной поверхностью, успешно используется целлюлозосодержащий носитель на основе древесного опила, гидрофобизованного смесью олифы и Якойососсж-биосурфактанта [4].

Подбор эффективного режима и создание оптимальной технологической схемы иммобилизации бактериальных клеток предусматривают построение математических моделей, адекватно описывающих данный процесс. В настоящее время кинетические модели широко используются для описания процесса бактериальной адгезии к твердым субстратам [6]. Однако данные модели в основном разработаны для адгезионных процессов, протекающих в стационарных условиях, в частности при формировании биопленок, либо они не учитывают влияние гидродинамического режима на кинетику бактериальной адгезии [8]. В данной работе представлены результаты экспериментального исследования и предложена учитывающая гидродинамические условия кинетическая модель процесса иммобилизации клеток родококков на твердом носителе, представляющем собой гидрофобизованные хвойные опилки.

На рис. 1 показаны внешний вид и схематичное изображение основной части экспериментальной установки, представляющей собой 250-мл колбу Эрленмейера, закрепленную на платформе орбитального шейкера (СвМоша /£, ЗаНопж, Германия). Г оризонтальная платформа шейкера движется поступательно таким образом, что все ее точки описывают окружности с постоянной круговой частотой движения ш. Колба неподвижна относительно платформы и может быть схематично представлена в виде цилиндра (радиус основания - К), поскольку содержимое колбы занимает лишь небольшую часть ее объема. В колбе находится жидкость (буферный раствор), а в жидкости - бактериальные клетки и частицы твердого носителя (хвойные опилки). В начальный момент времени все клетки находятся в свободном состоянии. С течением времени происходят процессы: (1) иммобилизации свободных клеток, (2) десорбции

Экспериментальное исследование процесса иммобилизации бактериальных клеток

Рис. 1. Фотография и схематичное изображение основной части

экспериментальной установки

иммобилизованных клеток с поверхности частиц носителя (с переходом их в свободные клетки) и (3) распада клеточного мицелия на короткие палочковидные формы. Последний процесс обусловлен особенностями морфогенетического цикла родококков, представленного чередованием стадий коротких палочковидных клеток -ветвящегося клеточного мицелия - распада клеточного мицелия вновь на короткие палочковидные формы [2]. Так, отобранные для иммобилизации бактериальные клетки находятся в экспоненциальной фазе роста. Морфология клеток родококков на данной стадии развития представлена длинными ветвящимися формами. После помещения данных клеток в буферный раствор для проведения процесса иммобилизации родококки переходят в стационарную фазу роста, характеризующуюся процессом распада мицелия на короткие палочковидные формы, что приводило к увеличению числа бактериальных клеток в суспензии по сравнению с первоначальной численностью.

Эксперименты по иммобилизации клеток R. ruber ИЭГМ 231 на гидрофобизованных хвойных опилках проводили при четырех различных значениях круговой частоты движения платформы орбитального шейкера: ю1 = 2% • 60 рад/мин, w 2 = 2% • 110 рад/мин, ю3 = 2% • 160 рад/мин, w 4 = 2% • 210 рад/мин. При этом в каждом варианте опыта использовали три одинаковые колбы с носителем и бактериальными клетками и одну контрольную колбу (с неинокулированным носителем). Процесс иммобилизации контролировали путем измерения оптической плотности (ОП 600 нм) содержимого опытных и контрольной колбы [7] с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США). Отбор образцов (1 мл) для

0 20 40 60 80 100 120 t, час 0 20 40 60 80 100 120 t, час

0 20 40 60 80 100 120 и час 0 20 40 60 80 100 120 час

Рис. 2. Экспериментальные зависимости (точки) и их линейные аппроксимации (линии), характерные для контрольных вариантов опыта (колбы с неинокулированным

носителем)

спектрофотометрического анализа проводили в течение 0-130 часов, при этом осторожно отбирали жидкую фазу без присутствия частиц носителя.

На рис. 2 точками показаны графики зависимости величины ОП 600 нм от времени, отвечающие контрольным вариантам опыта. Полученные данные обрабатывали следующим образом. Точки (показаны ромбами на рис. 2), отстоящие “далеко” от основного массива точек (показаны кружками на рис. 2), отбрасывали, а оставшиеся точки аппроксимировали линейными зависимостями по методу наименьших квадратов [1]. Для полученных линейных зависимостей (показанных сплошными линиями на рис. 2) определяли границы доверительных областей с 95%-м уровнем доверия [1] (границы доверительных областей показаны на рис. 2

пунктирными линиями; в случае ш = о 1 пунктирные линии не видны, так как сливаются со сплошной линией). Следует отметить, что отброшенные точки во всех случаях лежат вне доверительной области.

С использованием полученных аппроксимированных контрольных линейных зависимостей обрабатывали результаты опытных вариантов. При этом из значений ОП 600 нм в опытных вариантах вычитали соответствующие контрольные значения ОП 600 нм, полученные с помощью линейной аппроксимации. Далее результаты определения оптической плотности пересчитывали с помощью калибровочного графика в значения концентрации п5 свободных бактериальных клеток. Графики

зависимостей п ^) концентрации свободных (неиммобилизованных) клеток родококков от времени показаны точками на рис. 3.

Предположим, что в системе отсчета, связанной с колбой, частицы носителя и свободные бактериальные клетки образуют (за счет движения жидкости) идеальные “псевдогазы”, находящиеся под действием силы тяжести и силы Архимеда. Обозначим через u(ш) среднюю скорость движения “псевдомолекул” и через Nc (z) и Ns (z, t) -концентрации соответственно частиц носителя и свободных клеток как функции высоты z (см. рис. 1) и времени t. Тогда, согласно распределению Больцмана [3],

где g - ускорение свободного падения, mc - масса частицы носителя, ms - масса свободной клетки, рl - плотность жидкости, р - плотность носителя, р - плотность свободной клетки, k - постоянная Больцмана, Tc и Ts - “псевдотемпературы” “псевдогазов” частиц носителя и свободных клеток соответственно, причем [3]

Математическая модель процесса иммобилизации

Nc (^ = Сc ехр(- mcg(і - РііРc )z|kTc ),

Ns (^ t) = Сs 0) ехр(- msg(і -Рі IРs )z|kTs ),

(1)

(2)

(3)

а величины С, С) находятся из условий

H

H

о

о

Рис. 3. Экспериментальные (точки) и теоретические (линии) зависимости концентрации свободных (неиммобилизованных) клеток от времени. Для каждого варианта опыта (заданного значения ш) приведены данные трех параллельных экспериментов

где пс, п8 ) - средние (по объему жидкости в колбе) концентрации частиц носителя и свободных клеток соответственно, H - высота жидкости в колбе (см. рис. 1). Через ni (£) обозначим среднюю концентрацию иммобилизованных клеток.

Величину пс считаем известной. Изменение п8 и щ со временем определяется упомянутыми выше тремя процессами. Поэтому можно записать, что

(п5 (г)/Л = В,(1) (г) + В(2 (г) + В(3 (г), (5)

(п1 ^)/СИ = Вг(1) (г) + в(2) ^) + Вг(3) ^), (6)

где в(^^), в\^)(t) (у = 1,2,3) - скорости изменения соответственно п5 ^) и щ ^) за счет каждого из трех процессов.

Найдем В1у)^), В(у)(t). За бесконечно малый промежуток времени ^ с частицей носителя столкнется половина свободных клеток родококков, находящихся в окружающем частицу слое жидкости толщиной и(ш) ^ (вторая половина движется в противоположном направлении), следовательно, с данной частицей столкнутся Би(ш)Ns (г, t) 2 свободных клеток, где 5 - площадь поверхности частицы.

Обозначим через р(ш) вероятность иммобилизации свободной клетки при ее столкновении с частицей носителя. Тогда за промежуток времени ^ в горизонтальном

слое жидкости бесконечно малой толщины ёг количество свободных клеток уменьшится на (5и(ш)N, (г, t) Ж/2)р(ш)Nc (г)кЯ2(г , откуда легко получаем

В™ (0 = -5’и(Ш)Н>(Ш> Н К, (г, IN (г)ёг . (7)

Очевидно, что

П<''’(1) = -£><»(/). (8)

Пусть вероятность десорбции иммобилизованной клетки за промежуток

времени Л равна dt|Td (ш), где Т— (ш) - среднее время, за которое клетка будет десорбирована от частицы носителя; тогда

д12)(*) = П (')/Т— (и), (9)

В<2)(() =-В<2>(*). (10)

Будем считать, что ^3)^), Dг■3^(t) пропорциональны соответственно

концентрациям п (і) и пг- (t) :

ві()()) = а(1 П 0), (11)

Д(3|«) = а(0п(г), (12)

где коэффициент а^) выбирается из следующих соображений. Пусть из трех

перечисленных выше процессов имеет место только процесс распада клеточного

Г1 ^

мицелия; тогда из (5) и (11) следует, что п!і ) = п!і (0)ехр |а(т)—т

V о у

П (t). Будем считать, что процесс распада мицелия (с увеличением числа клеток) происходит по закону п5 ^) = п5 (0) • (к (и) - (К (и) - 1) ехр(- t|Tf (и))), где К > 1 -

кратность распада, Т^ - характерное время распада. Тогда

а^, ш) = — 1п(к(ш) - (К(ш) -1) ехр(- t|Tf (ш))). (13)

dt

При t = 0 иммобилизованные клетки отсутствуют, а средняя концентрация свободных клеток равна начальному значению п^. Тогда, подставляя (7)-(12) в (5) и (6) и учитывая (1)-(4), получим следующую задачу Коши для кинетических уравнений относительно функций п5 ^) и пг- (ї) :

dns 0 у— = - ns 0 У Ті(ш) + пі 0 УТ—(ш) + а0, ш)ns(t),

—пі ^ У— = ns 0 У Ті(ш) - пі ^ VТ—(ш) + а(t, ш)пі(t), (14)

ns (0) = ns0 ,

Пі (0) = 0, где

и аналогично для

2(1/ас (ш) + Vа, (ш)) (1 - ехр(-ас (ш)))(1 - ехр(-а, (ш)))

ас (ш) =

5 пси(ш) р(ш) 3gV

пи 2(ш)Я 2

, а, (ш) =

1 - ехр(-ас (ш) - а, (ш)) 3gV

пи 2(ш) Я 2

V = пЯ 2 Н

Из (14) и (13) находим [5]

п, (|) =

п,0

1 + Т (ш)/ Тё(ш)

Т (ш)/ Тё(ш) + ехр(- (VТ (ш)+V Тё(ш)) 1)) •

• (к(ш) - (К(ш) -1) ехр(- 11Т/ (ш))).

(15)

(16)

(17)

Заметим, что, зная Т (ш) и и(ш), можно из (15), (16) найти р(ш) . В дальнейшем полагаем и(ш) = шЯ/ 2.

Из (14) можно найти теоретическое значение степени иммобилизации ( клеток родококков (при заданной ш):

( = п (+^ )/(пг-(+да) + п,(+да)) = Тс/ (Тс + Т).

Сравнение теоретических и экспериментальных результатов

Теоретическая формула (17) была сопоставлена с описанными выше экспериментальными зависимостями (см. рис. 3). При этом для всех экспериментов принимались следующие значения параметров: Я = 4 см, V = 50 см , рI = 1,0 г/см , рс = 0,6 г/см 3, р, = 1,2 г/см 3, 5 = 10 мм 2, пс = 40 см -3. Линии на рис. 3 проведены методом наименьших квадратов [1] на основе формулы (17); варьируемые параметры: п,0, Т, Т(, К, Ту. В результате получено хорошее соответствие теоретических и

экспериментальных зависимостей. Это свидетельствует о том, что предложенная модель верно описывает основные черты процесса иммобилизации бактериальных клеток.

В таблице приведены средние (по данным трех параллельных экспериментов) значения параметров Т, Т(, К, Ту, р, ( процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе, определенные на основании разработанной модели.

Таблица

Рассчитанные параметры процесса иммобилизации в зависимости от круговой частоты ю ____________________движения платформы орбитального шейкера___________________

№ п/п ш, рад/мин Т , час Та ,час К Тг, час Р С %

1 2п60 130 350 1,6 88 4,2-10"7 73

2 2п110 280 м 1 0 2,8 10-8 100

3 2п160 150 4400 1,2 7,0 2,9 10-8 97

4 2п210 46 1000 3,6 52 7,0 10-8 96

Следует отметить, что для круговой частоты ш 2 движения платформы шейкера значение Т( найти не удается (оно неопределенно велико), а процесс распада клеточного мицелия не обнаруживается (К = 1, Ту = 0). Как видно из таблицы, в диапазоне значений круговой частоты движения ш 2 - ш 4 теоретически рассчитанные параметры процесса иммобилизации изменяются монотонно с увеличением ш . Однако рассчитанные параметры, отвечающие минимальной исследуемой круговой частоте ш 1 = 2п- 60 рад/мин, нарушают выявленную закономерность. Возможное объяснение этого факта заключается в неравномерном перемешивании жидкости в колбе при столь малой круговой частоте движения платформы шейкера, что оказывает влияние на кинетику процесса иммобилизации бактериальных клеток.

Характерно, что величина (, определяющая эффективность иммобилизации клеток родококков, достигает максимального значения при ш = ш 2 = 2п-110 рад/мин (см. таблицу). Однако данная частота соответствует наибольшей продолжительности (Т) иммобилизационного процесса, что может привести к дополнительным временным и материальным затратам при биотехнологическом производстве. Следовательно, выбор режима проведения иммобилизации в конкретных производственных условиях определяется оптимальным сочетанием рассчитанных на основании предложенной модели параметров.

Таким образом, в результате проведенных исследований для практически важного диапазона значений ш, соответствующего 2п• (110-210) рад/мин, выявлена зависимость кинетики процесса иммобилизации клеток родококков от гидродинамических условий. На основании выявленной зависимости теоретически рассчитаны основные показатели эффективности иммобилизационного процесса (степень иммобилизации, время иммобилизации и десорбции бактериальных клеток, коэффициент увеличения числа свободных клеток в результате распада клеточного мицелия) и определен оптимальный режим процесса иммобилизации, соответствующий круговой частоте движения платформы орбитального шейкера ш = 2п • (110-160) рад/мин.

Заключение

Проведено экспериментальное исследование и построена кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе, учитывающая различные гидродинамические условия. Установленные на основании построенной модели временные зависимости п, (I) средней концентрации свободных

(неиммобилизованных) клеток родококков при различных значениях круговой частоты движения платформы орбитального шейкера согласуются с экспериментальными данными. Модель является перспективной и допускает дальнейшее развитие, которое может заключаться в учете большего количества экспериментальных данных и в более детальном исследовании функций и(ш), Т (ш), а(1, ш) .

Исследования поддержаны грантами Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” и РФФИ № 07-04-97612-р_офи, а также финансировались в рамках Госконтракта № 02.512.11.2014.

Список литературы

1. Брандт, З. Статистические методы анализа наблюдений / З. Брандт. - М.: Мир, 1975.

2. Ившина, И.Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И. Б. Ившина, М. В. Бердичевская, Л. В. Зверева и др. // Микробиология. - 1995. - Том 64, № 4. -С. 507-513.

3. Ландау, Л.Д. Статистическая физика / Л.Д. Ландау, Е.М. Лифшиц. - М.: Наука, 1964.

4. Подорожко, Е.А. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, способ получения носителя и носитель иммобилизованных микроорганизмов / Е.А. Подорожко, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина и др. Патент РФ № 2298033. Зарегистр. в Госреестре изобретений РФ 27.04.2007.

5. Тихонов, А.Н. Дифференциальные уравнения / А.Н. Тихонов, А.Б. Васильева, А.Г. Свешников. - М.: Наука, 1998.

6. Федорович, В.В. Разработка феноменологической модели кинетики бактериальной адсорбции на низкоэнергетических поверхностях / В.В. Федорович, С.В. Калюжный, П. Ван дер Мирен,

B. Верстрает // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. - 2002. - Том 43, № 6. -

C.417-419.

7. Podorozhko, E.A. Hydrophobised sawdust as a carrier for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing bacterium Rhodococcus ruber / E.A. Podorozhko, V.I. Lozinsky, I.B. Ivshina, M.S. Kuyukina, et al. // Bioresource Technology. 2007. doi:10.1016/j.biortech.2007.03.024.

8. Vadillo-Rodrguez, V. Relations between macroscopic and microscopic adhesion of Streptococcus mitis strains to surfaces / V. Vadillo-Rodr?guez, H.J. Busscher, W. Norde, et al. // Microbiology. - 2004. -Vol. 150. - P. 1015-1022.

A KINETIC MODEL OF BACTERIAL CELL IMMOBILIZATION PROCESS ON THE SOLID CARRIER

M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina, M.A.Osipenko, Yu.I. Nyashin, A.N. Tyulenyova,

M.K. Serebrennikova, A.V. Krivoruchko (Perm, Russia)

A kinetic model of the process of Rhodococcus bacteria immobilization on the solid carrier was developed. The carrier used was the hydrophobized pine sawdust. The theoretical results obtained were in agreement with the experimental data on the immobilization of Rhodococcus bacteria under different hydrodynamic conditions determined by various cyclic frequencies (ro) of the orbital shaker platform motion. On the base of this model, the main kinetic parameters of the immobilization process were calculated and the optimum ro value was found.

Key words: bacterial cells, Rhodococcus, immobilization, solid carrier, cyclic frequency of motion, mathematical modelling, kinetic equations.

Получено 06 июля 2007