CC BY
11S. Asghar H., Diop O.M., Weldegebriel G. et al. Environmental surveillance for polioviruses in the Global Polio Eradication Initiative. J. Infect. Dis. 2014, 210 (1): 294-303.
9. Aylward R.B., Sutter R.W., Cochi S.T. et al. Risk Management in a Polio-Free World. Risk Analysis. 2006, 26 (б): 1441-1448.
10. Burns C.C., Dior O.M., Sutter R.W. et al. Vaccine-Derived Polioviruses. J. Infect. Dis. 2014, 210: S2S3-293.
11. Cochi S.L., Freeman A., Guirguis S. et al. Global polio eradication initiative: Lessons learned and legacy. J. Infect. Dis. 2014, 210 (l): S540-546.
12. Shrivastava S.R., Shrivastava P.S., Ramasamy J. Recommended Strategies to Move Closer Toward the Global Eradication of Polio: International Health Regulations. Int. J. Preventive Medicine 2016, 7-17.
Поступила 04.12.17
Контактная информация: Фельдблюм Ирина Викторовна, д.м.н., проф.,
614990, Пермь, ул. Петропавловская, 26, р.т. (342)218-16-68
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
И.В.Мокроусов1, О.А.Пасечник2, А.А.Вязовая1, А.И.Блох2, Е.Н. Черняева3, В.Л.Стасенко2
О ВАЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭВОЛЮЦИОННО НАДЕЖНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОГО СЕМЕЙСТВА LAM
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; 2Омский государственный медицинский университет; 3Санкт-Петербургский государственный университет
Цель. Клиническая и эпидемиологическая значимость генетического семейства LAM (Latin American Mediterranean) Mycobacterium tuberculosis определяет важность корректной детекции штаммов LAM. В настоящем исследовании комплекс молекулярных методов был использован для анализа штаммов LAM в популяции M. tuberculosis в Омской области Западной Сибири, для которой характерен высокий уровень заболеваемости резистентным туберкулезом. Материалы и методы. Изученная коллекция включала 207 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Омской области в 2015 — 2016 гг. Методы исследования включали сполиготипирование, анализ полиморфизма Rv0129c 309G>A, специфического для семейства LAM, полногеномное секвенирование с последующим биоинформационным анализом. Результаты. В результате сравнения полученных профилей CRISPR-сполиготипирования с международной базой данных SITVIT_WEB 11 штаммов (5,3%) было отнесено к генотипу LAM. В то же время, в результате анализа филогенетического SNP в гене Rv0129c к генотипу LAM было отнесено 30 изолятов (14,5%). Для четырех изолятов, представляющих разные типы сполигопрофилей, было проведено полногеномное секвенирование. Заключение. Полученные результаты показывают ограниченность правил принятия решения, имплементированных в SITVIT_WEB для определения семейства LAM для штаммов с протяженными блоками делетированных спейсеров в локусе CRISPR или усеченными профилями сполготипирования. Для детекции штаммов LAM может быть рекомендован подход, включающий (1) первичное сполиготипирование, сравнение с SITVIT_WEB и обязательное уточнение интерпретации профилей в свете экспертного знания; (2) детекцию LAM-специфического SNP (например, с помощью PCR-RFLP).
Журн. микробиол., 2018, № 3, С. 60—66
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, эволюция, полногеномное секвенирование, сполиготипирование, генотип LAM (Latin-American Mediterranean)
I.V.Mokrousov1, O.A.Pasechnik2, A.A. Vyazovaya1, A.I.Blokh2, E.N.Chernyaeva3, V.L.Stasenko2
ON IMPORTANCE OF USING EVOLUTIONARILY ROBUST MARKERS FOR DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS OF LAM GENETIC FAMILY
1Pasteur St. Petersburg State Institute of Epidemiology and Microbiology; 2Omsk State Medical University; 3St. Petersburg State University, Russia
Aim. The clinical and epidemiological significance of the Latin American Mediterranean (LAM) genetic family of Mycobacterium tuberculosis determines the importance of the correct detection of LAM strains. In this study, a complex of molecular methods was used to analyze LAM strains in the population of M. tuberculosis in the Omsk region of Western Siberia, which is characterized by a high incidence of drug-resistant tuberculosis. Materials and methods. The collection included 207 strains of M. tuberculosis, isolated in the Omsk region in 2015 — 2016. The strains were subjected to spoligotyping, analysis of LAM-specific SNP Rv0129c 309G>A, and whole genome sequencing followed by bioinformatics analysis. Results. A comparison of the obtained CRISPR-spoligotyping profiles with the international SITVIT_WEB database, assigned 11 strains (5.3%) to the LAM genotype. At the same time, based on analysis of phylogenetic SNP in the gene Rv0129c, 30 isolates (14.5%) were assigned to LAM. Whole genome sequencing was performed for 4 isolates with different spoligotyping profiles. Conclusion. The results of this study show the limited utility of the decision rules implemented in SITVIT_WEB to define LAM family for isolates with long deleted blocks of spacers or abridged spoligoprofiles. The following approach can be recommended for detection of LAM isolates (1) primary spoligotyping, comparison with SITVIT_ WEB, and mandatory interpretation in the light of expert knowledge; (2) detection ofLAM-specific SNP (e.g., using PCR-RFLP).
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 3, P. 60—66
Key words: Mycobacterium tuberculosis, evolution, whole genome sequencing, spoligotyping, LAM (Latin-American Mediterranean) genotype
ВВЕДЕНИ Е
Характерной особенностью вида Mycobacterium tuberculosis является строго клональная структура популяции как следствие отсутствия горизонтального генетического переноса. Помимо общебиологического смысла такого хода эволюции (обсуждение которого выходит за рамки данного сообщения), этот факт имеет и прикладное, клиническое значение применительно к реализации региональных программ борьбы с туберкулезом. В настоящее время общепризнано, что отдельные генотипы (генетические семейства, сублинии, клональ-ные кластеры) M. tuberculosis отмечены повышенной вирулентностью, транс-миссивностью, или способностью быстрого развития устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Структуру популяции возбудителя туберкулеза в России и других странах постсоветского пространства часто воспринимают через призму доминирования резистентных штаммов генетического семейства Beijing. В целом обоснованный, такой подход упрощает реальность как в количественном, так и в качественном аспектах. В том, что касается собственно структуры популяции, штаммы генетического семейства LAM (Latin American Mediterranean) также являются значимым компонентом популяции M. tuberculosis, особенно в Европейской части бывшего СССР, и составляют до 30 — 40% локальных популяций, например, в центральной России и Белоруссии [7, 15]. Более того, рассматривая патобиологические
особенности штаммов, нужно учитывать, что эмерджентные, потенциально или актуально эпидемические геноварианты отмечены не только среди представителей семейства Beijing, но также и LAM и еще одного (недостаточно оцененного) генотипа Ural.
В свою очередь, это подчеркивает необходимость применения четких, эволюционно надежных молекулярных маркеров для корректного определения таких генетических групп, имеющих клиническую и/или эпидемиологическую значимость. Эволюционно значимые геногруппы могут быть выявлены: (1) на основе детекции валидированных специфических SNP (single nucleotide polymorphism) или геномных делеций, представляющих уникальные и однонаправленные эволюционные события; (2) посредством филогенетического анализа (кластеризации) на основе множества независимых и нейтральных эволюционных маркеров, к которым могут быть отнесены полногеномные SNP или локусы VNTR (variable number of tandem repeats).
Генетическое семейство LAM M. tuberculosis впервые было описано в 2001 году в результате филогенетического анализа относительно глобальной коллекции сполигопрофилей [14]. Прототипным сполготипом LAM является SIT42, в профиле которого отсутствуют сигналы 21-24 и 33-36. Последующее применение эволюционно надежных маркеров подтвердило реальность LAM и позволило более адекватно определить его филогенетические границы. Также можно отметить, что LAM входит в крупную Евро-Американскую линию, хотя и определенную на основании SNP-анализа, но также имеющую характерный маркер на основании сполиготипирования, а именно отсутствие сигналов 33-36.
В наших предыдущих работах на коллекциях штаммов из различных регионов бывшего СССР (Северо-Запад РФ, Белоруссия, Казахстан) и Китая были валидированы ранее описанные специфические SNP в генах Rv0129c и Rv3062 для детекции штаммов LAM [8 — 11]. В настоящем исследовании мы применили комплекс молекулярных маркеров для анализа штаммов LAM в популяции M. tuberculosis в Омской области Западной Сибири, для которой характерен высокий уровень заболеваемости резистентным туберкулезом [1, 2], и расширили их верификацию с использованием полногеномного секве-нирования следующего поколения: WGS (whole genome sequencing)/NGS (next generation sequencing).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы M. tuberculosis были выделены от больных туберкулезом легких, постоянно проживающих в Омской области. ДНК выделяли стандартным методом с использованием SDS, протеиназы К и цетилтриметиламмонийбро-мида для клеточного лизиса.
Сполиготипирование проводили согласно стандартному протоколу с использованием мембраны с иммобилизованными олигонуклеотидами на 43 спейсера локуса CRISPR M. tuberculosis, изготовленной в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ им. Пастера. Профили сполиготипирова-ния сравнивали с международной базой данных SITVIT_WEB (http://www. pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_0NLINE/).
Анализ однонуклеотидного полиморфизма в гене Rv0129c 309G>A, специфического для семейства LAM, проводили методом ПЦР-ПДРФ [11].
Полногеномное секвенирование проводили с использованием платформы MiSeq (Illumina), используя реагенты для получения парных прочтений
длиной по 300 нуклеотидов. Для подготовки ДНК-библиотек для секвени-рования использовали ультразвуковую фрагментацию ДНК и применяли набор NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs). Первичную обработку коротких нуклеотидных прочтений (fastq файлов) проводили с использованием программы Trimmomatic (http://www.usadellab. org/cms/index.php?page=trimmomatic) для удаления адаптеров и нуклеотид-ных прочтений низкого качества. Полученные файлы использовали для выравнивания на референсный геном M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3) для дальнейшего поиска геномных вариантов. Нуклеотидные прочтения выравнивали на референсный геном с использованием инструмента bowtie2, после чего для идентификации и аннотации нуклеотидных полиморфизмов использовали утилиты SAMtools (http://samtools.sourceforge.net). Онлайн-ресурсы Phyresse (https://bioinf.fz-borstel.de/mchips/phyresse/), TGS-TB (https://gph.niid.go.jp/tgs-tb/) и PhyTB (http://pathogenseq.lshtm.ac.uk/ phytblive/index.php) использовали для дополнительной классификации сек-венированных геномов.
Дополнительно штаммы LAM были типированы на наличие специфической инсерции IS6110 в определенной позиции в гене plcA (позиция 2630571 в геноме штамма H37Rv, номер доступа 00962.3 в GenBank), которая является маркером подгруппы внутри LAM, ранее названной LAM-RUS [6].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Изученная коллекция включала 207 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Омской области в 2015-2016 гг. В результате сравнения полученных профилей сполиготипирования с базой данных SITVIT_WEB 11 штаммов (5,3%) было отнесено к генотипу LAM. В то же время, в результате анализа филогенетического SNP в гене Rv0129c к генотипу LAM было отнесено 30 изолятов (14,5%) (табл.). Дополнительно все 30 изолятов LAM были определены как LAM-RUS.
Для четырех изолятов, представляющих разные типы профилей внутри изученной выборки LAM, проведено полногеномное секвенирование с использованием технологии следующего поколения. Таким образом были изучены: штамм SIT42 (классический прототипный профиль для семейства LAM), штамм SIT254 с протяженным блоком делетированных спейсеров, штаммы SIT1451 и SIT_new с усеченными профилями гибридизации при сполиготи-пировании (табл.). Сравнение с базой сполиготипов SITVIT_WEB корректно отнесло первый из штаммов (SIT42) к LAM, в то время как штамм SIT254 был отнесен к семейству T5-RUS1, а для двух последних штаммов их филогенетический статус в SITVIT_WEB определен не был.
Для указанных 4 штаммов проведено полногеномное секвенирование и полученные файлы fastq были загружены в нуклеотидный архив NCBI, проект PRJNA401339. В результате выравнивания на референсный геном M. tuberculosis H37Rv для каждого штамма получен перечень геномных вариантов, включающий однонуклеотидные полиморфмзмы и короткие инсерции и де-леции (vcf файлы). Файлы fastq и vcf были проанализированы с использованием онлайн-ресурсов Phyresse, PhyTB и TGS-TB, с помощью которых была подтверждена принадлежность всех 4 штаммов к LAM. Кроме того, следует отметить в изученной омской выборке штамм с профилем SIT264 с протяженным блоком из 12 делетированных сигналов, отнесенный к семейству T1 в базе SITVIT_WEB. Однако ранее нами была показана принадлежность штам-
Генотипы изолятов LAM M. tuberculosis в Омской области
SIT Семейство по SITVITJWEB LAM SNP Профиль сполпготипированпя Все ЛУ
42 LAM9 LAM 9 1
254 T5-RUS1 LAM 8 3
264 T1 LAM 1 0
560 не определено LAM 1 1
803 LAM9 LAM 1 1
1451 не определено LAM 6 0
2127 T5-RUS1 LAM 1 0
2384 Т2 LAM 1 0
4109 LAM9 LAM 1 1
New (orphan) не определено LAM 1 0
Примечание. H Наличие гибридизации, □ отсутствие гибридизации; ЛУ — лекар-ственноустойчивые, SIT — spoligotype international type, SNP — single nucleotide polymorphism (одно-иуклеотидиый полиморфизм). Для выделенных жирным сполиготипов было сделано полногеномное секвенирование.
ма с таким сполигопрофилем, выделенного в Санкт-Петербурге, к генотипу LAM на основании полногеномного анализа [8].
ОБСУЖДЕНИ Е
Ряд предыдущих исследований штаммов M. tuberculosis генетического семейства LAM показал его клиническую и/или эпидемиологическую значимость, ассоциацию с лекарственной устойчивостью, хотя данные по повышенной вирулентности этих штаммов противоречивы [3, 7]. Тем не менее, в целом это определяет важность корректной детекции штаммов LAM на основе эволюционно надежных генетических маркеров (к которым сполиготипирование отнесено быть не может). Полученные нами результаты показывают серьезную ограниченность правил принятия решения (decision rules), имплементирован-ных в SITVIT_WEB и описанных в работе Demay С. et al. [5] для определения семейства LAM. В результате применения алгоритма SITVIT_WEB значительная часть штаммов LAM в странах бывшего СССР или относится к семейству T, или вообще остается неопределенной (из-за крайней усеченности сполигопрофиля (штамм с профилем SIT1451, табл.). В настоящем исследовании только 5,3% штаммов в Омской коллекции M. tuberculosis было отнесено к LAM в результате сполиготипирования, в то время как в результате применения SNP/WGS маркеров эта цифра выросла почти в 3 раза (до 14,5%).
Технология секвенирования следующего поколения становится все более доступной для полногеномного секвенирования патогенных бактерий, и
M. tuberculosis не является исключением. Подход на основе WGS/NGS позволяет выявить незначительные различия близкородственных геновариантов и успешно применяется как для филогеномных, так и для молекулярно-эпидемиологических исследований. Противоположным с точки зрения дискриминирующей способности является классический метод сполиготипиро-вания. Практически единственным достоинством метода является его техническая простота и, следовательно, возможность быстрого анализа больших коллекций, а также наличие больших баз данных, собранных в результате 20 лет исследований. Прежде всего следует отметить глобальную базу данных SITVIT_WEB, созданную в Институте Пастера Гваделупы [5]. Последняя (все еще неопубликованная) версия этой базы (SITVIT2) содержит данные по более чем 110 000 изолятам, согласно диссертации D. Couvin [4]. Известными и серьезными ограничениями метода сполиготипирования являются как универсальные для всех бактерий (единый локус CRISPR, следовательно, не независимая эволюция спейсеров и т.о. неадекватность филогенетических построений на основе сполиготипов), так и специфические для M. tuberculosis (возможная гомоплазия как результат конвергентной эволюции, неопределенность интерпретации протяженных блоков делетированных сигналов). Глобальной проблемой анализа сполигопрофилей является и догматическое, некритическое восприятие крупных электронных ресурсов и баз данных.
Определение семейства LAM M. tuberculosis на основании сполиготипи-рования (в особенности профилей с протяженными блоками делетированных сигналов, например, SIT254, SIT264, SIT1451) имеет два существенных недостатка, как показано в настоящем и ряде предыдущих исследований в странах бывшего СССР. Во-первых, наличие усеченных профилей сполиготипирова-ния (SIT1451) или профилей с длинными блоками делетированных сигналов (SIT264, SIT254) критически уменьшает количество признаков, пригодных для анализа, и не позволяет делать вывод о генотипе (семействе) штамма даже если алгоритм, применяемый в SITVIT_WEB, и позволяет (хотя и ошибочно) отнести такой штамм, например SIT254 или SIT264, к какой-либо подгруппе внутри семейства T (прежде всего к т.н. T5-RUS1, куда отнесены эти и близкие им производные сполиготипы в SITVIT_WEB). Во-вторых, сполиготип SIT803 представляет пример гомоплазии сполиготипов как результат конвергентной эволюции локуса CRISPR M. tuberculosis. В частности, как показано в данном исследовании (на основании полногеномного анализа) и в опубликованных работах по Северо-Западу России, Казахстану и Грузии (на основании анализа LAM-специфических SNP и мультилокусного VNTR-анализа) [11 — 13], штаммы SIT803 определенно относятся к семейству LAM. В то же время, анализ китайских штаммов с таким сполиготипом не выявил у них LAM-специфического SNP [9]. На построенной нами дендрограмме профилей 24-MIRU-VNTR 186 референс-штаммов M. tuberculosis разных генотипов (MIRU-VNTRplus.org) и 259 типов глобальной коллекции LAM [10] китайские штаммы SIT803 занимали положение далеко за пределами ветви LAM и располагались на периферии ветви семейства S (древо не показано). Все это подчеркивает необходимость осторожности в интерпретации сполигопрофилей с небольшим количеством сигналов гибридизации.
В то же время, даже в настоящее время все более широкого применения полногеномного анализа полезно сопоставлять новые данные со все еще применяемыми старыми маркерами и схемами. Не все лаборатории, особенно в странах с ограниченными ресурсами, могут использовать NGS в качестве
рутинного подхода. Конкретно для детекции штаммов LAM может быть рекомендован подход, включающий (1) первичное сполиготипирование, сравнение с SITVIT_WEB и обязательное уточнение интерпретации профилей в свете экспертного знания; (2) детекцию LAM-специфического SNP (например, с помощью PCR-RFLP).
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 17-04-00367«Популяция Mycobacterium tuberculosis в регионе Западной Сибири: актуальная молекулярная эпидемиология в контексте макроэволюционной реконструкции».
ЛИТЕРАТУРА
1. Пасечник О.А., Дымова М.А., Стасенко В.Л., Татаринцева М.П., Колесникова Л.П., Ляпина Е.С. Генетическое разнообразие лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis в Омской области. Туберкулез и болезни легких. 2017, 7: 33-39.
2. Пасечник О.А., Руднева С.Н., Татаринцева М.П. Динамика эпидемиологических показателей по туберкулезу в Омской области. Туберкулез и болезни легких. 2015, 5: 139140.
3. Barbosa C.B., Lazzarini L.C., Elias A.R. et al. Tuberculosis caused by RDRio Mycobacterium tuberculosis is not associated with differential clinical features. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2012, 16: 1377-1382.
4. Couvin D. Development and management of a global database of circulating genotypes of tubercle bacilli: Molecular methods and web-based tools for mapping, understanding and controlling the epidemic. PhD thesis, Université des Antilles et de la Guyane. Pointe-a-Pitre, Guadeloupe, 2014.
5. Demay C., Liens B., Burguière T. et al. SITVITWEB — a publicly available international mul-timarker database for studying Mycobacterium tuberculosis genetic diversity and molecular epidemiology. Infect. Genet. Evol. 2012, 12 (4): 755-766.
6. Dubiley S., Kirillov E., Ignatova A. et al. Molecular characteristics of the Mycobacterium tuberculosis LAM-RUS family prevalent in Central Russia. J. Clin. Microbiol. 2007, 45 (12): 4036-4038.
7. Ignatova A., Dubiley S., Stepanshina V. et al. Predominance of multi-drug-resistant LAM and Beijing family strains among Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from prison inmates in Tula Region, Russia. J. Med. Microbiol. 2006, 55 (10): 1413-1418.
8. Mokrousov I., Chernyaeva E., Vyazovaya A. et al. Next generation sequencing ofMycobacterium tuberculosis. Emerg. Infect. Dis. 2016, 22 (6): 1127-1129.
9. Mokrousov I., Jiao W.W., Wan K. et al. Stranger in a strange land: Ibero-American strain of Mycobacterium tuberculosis in Tibet, China. Infect. Genet. Evol. 2014, 26: 323-326.
10. Mokrousov I., Vyazovaya A., Iwamoto T. et al. Latin-American-Mediterranean lineage of Mycobacterium tuberculosis: Human traces across pathogen's phylogeography. Mol. Phylo-genet. Evol. 2016, 99: 133-143.
11. Mokrousov I., Vyazovaya A., Narvskaya O. Mycobacterium tuberculosis Latin-American Mediterranean family and its sublineages: in the light ofevolutionary robust markers. J. Bacteriol. 2014, 196 (10): 1833-1841.
12. Niemann S., Diel R., Khechinashvili G. et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage favors the spread of multidrug-resistant tuberculosis in the Republic of Georgia. J. Clin. Microbiol. 2010, 48 (10): 3544-3550.
13. Skiba Y, Mokrousov I., Ismagulova G. et al. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: a country-wide study. Tuberculosis. 2015, 95 (5): 538-546.
14. Sola C., Filliol I., Legrand E. et al. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS1081, IS6110, VNTR, and DR-based spoligo-typing suggests the existence of two new phylogeographical clades. J. Mol. Evol. 2001, 53 (6): 680-689.
15. Zalutskaya A., Wijkander M., Jureen P. et al. Multidrug-resistant Myсobacterium tuberculosis caused by the Beijing genotype and a specific T1 genotype clone (SIT No. 266) is widely transmitted in Minsk. Int. J. Mycobacteriol. 2013, 2: 194-198.
Поступила 25.10.17
Контактная информация: Мокроусов Игорь Владиславович, д.б.н., 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)233-21-49
