CC BY
2210. Gordon M.A., Walsh A.L., Rogerson S.R.K. et al. Three cases of bacteremia caused by Vibrio cholerae O1 in Blantyre, Malawi. Emerg. Infect. Diseases. 2001, 7 (6): 1059-1061.
11. Haiko J., Suomalainen M., Ojala T. et al. Invited review: Breaking barrier — attack on innate immune defences by omptin surface proteases of enterobacterial pathogens. Innate Immun. 2009, 15 (2): 67-80.
12. Lahteenmaki K., Edelman S., Korhonen T.K. Bacterial metastasis: the host plasminogen system in bacterial invasion. Trends in Microbiology. 2005, 13 (2): 79-85.
13. Merrell D.S., Bailey C., Kaper J.B. et al. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. J. Bacteriol. 2001, 183 (9): 2746-2754.
14. Neutra M.R., Frey A., Kraehenbuhl J.P. Epithelial M-cells: gateways for mucosal infection and immunization. Cell. 1996, 86: 345 — 348.
15. Pancholi V, Fischetti V. Alpha-enolase, a novel strong plasmin(ogen) binding protein on the surface of pathogenic streptococci. J. Biol. Chem. 1998, 273 (23): 14503-14515.
16. Pouillot F., Derbise A., Kukkonen M. et al. Evaluation of O-antigen inactivation on Pla activity and virulence ofYersinia pseudotuberculosis harbouring the pPla plasmid. Microbiology. 2005, 151: 3759-3768.
17. Sha J., Erova T.E., Alyea R.A. et al. Surface-expressed enolase contributes to the pathogenesis of clinical isolate SSU of Aeromonas hydrophila. J. Bacteriol. 2009, 191 (9): 3095-3107.
18. Stumpe S., Schmid R., Stefens D.L. et al. Identification of OmpT as the protease that hydrolyzes the antimicrobial peptide protamine before it enters growing cells of E. coli. J. Bacteriol. 1998, 180: 4002-4006.
19. Zhang L., Seiffert D., Fowler B.J. et al. Plasminogen has a broad extrahepatic distribution. Tromb. Haemost. 2002, 87 (3): 493-501.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Мишанькин Б.Н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. Максима Горького, 117/40, р.т. (863)240-22-66
МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
А.А.Вязовая1, Н.С.Соловьева2, В.Ю.Журавлев2, И.В.Мокроусов1, О.А.Маничева2, Б.И.Вишневский2, О.В.Нарвская1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗНЫМ СПОНДИЛИТОМ
1Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии
Цель. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов M. tuberculosis, выделенных из операционного материала больных туберкулезным спондилитом. Материалы и методы. 107 штаммов M. tuberculosis, выделенных в 2007 — 2011 гг. от больных туберкулезом позвоночника, исследовали методами сполиготипирования и MIRU-VNTR типирования по 12 и 24 локусам. Результаты. Доминировали штаммы (n=80) генетического семейства Beijing, из них 78% обладали множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Также обнаружены штаммы генетических семейств: T, H3 (Ural), LAM, Manu, Н4 и S. Дифференцирование 80 штаммов генотипа Beijing методом MIRU-VNTR по 24 локусам выявило 24 варианта (HGI=0,83), включая 7 кластеров, наиболее крупный из которых 100-32 включал 23 штамма (87% — МЛУ). Заключение. Показана ведущая роль штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing в развитии туберкулезного спондилита с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.
Журн. микробиол, 2013, № 5, С. 20—26
Ключевые слова: туберкулезный спондилит, сполиготипирование, MIRU-VNTR
A.A.Vyazovaya1, N.S.Solovieva2, V.Yu.Zhuravlev2, I.V.Mokrousov1, O.A.Manicheva2, B.I.Vishnevsky2, O.V.Narvskaya1
MOLECULAR-GENETIC CHARACTERISTICS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH TUBERCULOUS SPONDYLITIS
1Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, 2St. Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology, Russia
Aim. Molecular-genetic characteristic of M. tuberculosis strains isolated from operation material of patients with tuberculous spondylitis. Materials and methods. 107 strains of M. tuberculosis isolated in 2007 — 2011 from patients with spine tuberculosis were studied by methods of spoli-gotyping and MIRU-VNTR by 12 and 24 loci. Results. Strains of genetic family Beijing dominated (n=80), 78% ofthose had multiple drug resistance (MDR). Strains ofgenetic families T, H3 (Ural), LAM, Manu, H4 and S were also detected. Differentiating of80 strains of Beijing genotype by MIRU-VNTR method by 24 loci revealed 24 variants (HGI=0.83) including 7 clusters, the largest of those (100-32) included 23 strains (87% MDR). Conclusion. The leading role of Beijing genotype M. tuberculosis strains in development of tuberculous spondylitis with multiple drug resistance of the causative agent is shown.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 20—26
Key words: tuberculous spondylitis, spoligotyping, MIRU-VNTR
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы в Российской Федерации наблюдается стабилизация основных эпидемиологических показателей по туберкулезу различных локализаций [6]. Так, удельный вес внелегочного туберкулеза (ВТ) сократился с 9,4% в 1992 г. до 3,4% в 2011 г. [1]. В СевероЗападном Федеральном округе за последние семь лет заболеваемость ВТ снизилась на 21,5%, составив 1,57 случая на 100 тысяч жителей при среднем российском уровне 2,4 на 100 тысяч населения в 2011 г. [1, 3]. Вместе с тем, в структуре ВТ доля впервые выявленных больных с поражением костей и суставов (КСТ) в России увеличилась с 23% в 2006 г. до 33% в 2010 г. и стала превышать таковую при других локализациях [2, 6]. Половина случаев КСТ представлена туберкулезным спондилитом (ТС), который является одним из самых тяжелых ортопедических заболеваний и нередко приводит к развитию необратимых неврологических нарушений и инвалидизации, что представляют серьезную медико-социальную проблему [10, 20, 25]. ТС возникает в результате гематогенной диссеминации возбудителя — Mycobacterium tuberculosis. Несвоевременные выявление и верификация диагноза (от 3 месяцев до 10 лет от начала заболевания), рост числа случаев впервые выявленного лекарственно-устойчивого ТС с многоуровневым поражением позвоночника у взрослых требуют совершенствования этиологической (микробиологической) диагностики заболевания с учетом особенностей биологических свойств возбудителя [3, 10, 20].
В настоящее время в научной литературе имеется немало сведений о генетическом разнообразии штаммов возбудителя туберкулеза легких, тогда как характеристике штаммов M. tuberculosis, выделяемых от больных ТС, посвящены лишь единичные зарубежные публикации [10, 20, 21, 25]. В этой связи, целью нашей работы была молекулярно-генетическая характеристика штаммов M. tuberculosis, полученных от больных ТС в России.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучено 107 штаммов M. tuberculosis, выделенных от эпидемиологически несвязанных взрослых больных (включая 14 ВИЧ-инфицированных) проживающих в различных регионах России: мужчин — 71 (средний возраст 36 лет), женщин — 36 (средний возраст 46
лет) с верифицированным диагнозом ТС, оперированных в клинике костно-суставного туберкулеза СПб НИИФ в 2007 — 2011 гг.
Культивирование операционного материала из очагов деструкции проводили на среде Левенштейна-Йенсена, Финн-2 и в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960. Определение лекарственной чувствительности/устойчивости (ЛЧ/ЛУ) изолятов M. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) осуществляли стандартным непрямым методом абсолютных концентраций и/или с помощью автоматизированной BACTEC MGIT 960. Образцы ДНК выделяли из чистых культур M. tuberculosis стандартным методом [23]. Генотипирование штаммов M. tuberculosis проводили методами сполиготипирования и MIRU-VNTR типирования по 12 и 24 локусам, содержащим тандемные повторы MIRU (02, 04, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40) и ETR (A, B, C), QUB (11b, 26, 4156), Mtub (04, 21, 29, 30, 34, 39) [13, 22]. Число повторов в каждом локусе определяло числовой профиль штамма. Принадлежность штамма к определенному спо-лиготипу, генетическому семейству (линии) и MIRU-VNTR типу устанавливали согласно международным базам данных SITVIT_WEB (http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/ SITVIT_ONLINE/) и MIRU-VNTRplus (http://www.miru-vntrplus.org). Степень родства между MIRU-VNTR профилями штаммов оценивали с использованием алгоритма Neighbor Joining (NJ) и графически отображали с помощью дендрограммы. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы EpiCalc2000. Для количественной оценки дискриминирующей способности схемы MIRU-VNTR типирования рассчитывали индекс дискриминации Хантера-Гастона (HGDI, Hunter Gaston Discriminatory Index) с помощью алгоритма: http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/ DICI/DICI.pl.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Сполиготипирование 107 штаммов M. tuberculosis выявило 19 вариантов — споли-готипов, шесть из которых были представлены кластерами (табл.). К генотипу Beijing были отнесены 80 (75 %) штаммов (сполиготипы SIT1, SIT265 и SIT269); остальные штаммы принадлежали к генетическим семействам T, Н3 (Ural), LAM, Manu, H4 и S.
Как видно из таблицы, ЛЧ обладали 23 (21%) из 107 штаммов M. tuberculosis. МЛУ выявлена у 68 (64%) штаммов (включая 8 из 14 штаммов, выделенных от ВИЧ-инфицированных), причем половина из них одновременно проявляла устойчивость и к остальным препаратам первого ряда (стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду). Подавляющее большинство (91%) МЛУ штаммов принадлежали к генетическому семейству Beijing (р<0,001); среди ЛЧ преобладали штаммы других семейств (не-Beijing), суммарная доля которых составляла 70%.
Анализ мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью M. tuberculosis к рифампи-цину и изониазиду, проводили у 57 (ЛЧ — 7; ЛУ — 50, включая 41 МЛУ) штаммов M. tuberculosis. У 38 Beijing и 3 не-Beijing МЛУ штаммов резистентность к рифампицину была обусловлена заменой rpoВ Ser531->Leu. В остальных случаях выявлены мутации rpoE в кодонах 531, 533, 516, 526 и 511. У 42 (в т.ч. 41 МЛУ) из 44 штаммов M. tuberculosis, фе-нотипически устойчивых к изониазиду, обнаружена замена katG Ser315->Thr. Из них 38 штаммов принадлежали к генотипу Beijing. У четырех (3 — Beijing) штаммов также выявлены мутации в гене inhA. В двух случаях устойчивость штаммов Beijing к изониазиду была обусловлена мутациями Ile335->Val у одного штамма и inhA_T15 — у другого. Мутации в гене ahpC не обнаружены.
Изучение аллельного полиморфизма 80 штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing методом MIRU-VNTR по 12 локусам MIRU выявило девять вариантов с различными числовыми профилями (HGI=0,63), из них четыре — представлены кластерами. Наиболее крупные кластеры MIT16 и MIT17 (согласно SITVIT_WEB) включали 39 и 29 штаммов, соответственно. У остальных 12 штаммов генотипа Beijing определены следующие типы MIT: 86, 101, 135, 571, 592, 642 и 706. Все 5 штаммов MIT 135 проявляли МЛУ.
MIRU-VNTR типирование по 24 локусам штаммов генотипа Beijing выявило 24 варианта (HGI=0,83), в том числе семь кластеров (рис.). Наиболее многочисленные кластеры c числовыми профилями 223325173533424672454433 (код 100-32, согласно MIRU-VNTRplus) и 223325153533424682454433 (код 94-32) включали 23 и 18 штаммов, соответственно.
Анализ аллельного полиморфизма каждого MIRU-VNTR локуса в отдельности продемонстрировал разную степень их вариабельности. Так, наибольшим полиморфизмом отличались локусы QUB26 и MIRU26 (HGDI 0,68 и 0,51, соответственно). Штаммы не различались по числу повторов в одиннадцати локусах: MIRU (2, 4, 16, 20, 23, 24, 27), Mtub (30, 34), ETR (B и C).
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании показано, что 75% из 107 штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных ТС, принадлежали к генетическому семейству Beijing (сполиготип SIT1 — 95%). Для сравнения: удельный вес данного генотипа среди штаммов возбудителя, выделяемых от больных туберкулезом легких на северо-западе России, составляет около 50% [4, 5, 16]. Штаммы Beijing (SIT1) встречаются повсеместно, но их географическое распределение неравномерно. Так, на территории Западной Европы доля генотипа Beijing в популяции M. tuberculosis не достигает 10%, в то время как в странах Восточной Азии (Китай — 86%, Монголия — 50%, Южная Корея — 43%) он доминирует [9, 17, 18, 24]. В странах с высоким бременем туберкулеза (в т.ч. в России) принадлежность возбудителя к данному генотипу ассоциирована с МЛУ при легочной локализации поражения [5, 7, 8, 11, 12, 18, 24]. Штаммы генотипа Beijing характеризует повышенная вирулентность [12, 14, 18] и способность к быстрому распространению в популяции [4, 8].
В мировой литературе встречаются лишь единичные публикации, посвященные молекулярно-генетической характеристике небольших по объему выборок изолятов M. tuberculosis, полученных от больных КСТ и ТС [10]. Так, лишь три (23%) из 13 штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом позвоночника в Тайване (1998 — 2007 гг.), принадлежали к генотипу Beijing, хотя среди штаммов возбудителя легочного туберкулеза данный генотип превалирует (44%) [25]. К генотипу Beijing принадлежали 28,6% из 7 изолятов больных КСТ против 10,8% из 74 штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких на севере Индии (2007 — 2011 гг.) [19, 21].
Дендрограмма MIRU-VNTR профилей 80 штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных ТС.
Sensitive — ЛЧ, S — резистентность к стрептомицину, Poliresistant — устойчивость к двум и более препаратам, MDR — МЛУ. HIV — штаммы, выделенные от ВИЧ-инфицированных больных ТС.
В нашем исследовании 64% штаммов M. tuberculosis, полученных от больных ТС, обладали МЛУ, причем подавляющее большинство штаммов Beijing — за счет мутаций rpoB Ser531->Leu и katG Ser315->Thr (р<0,001), что согласуется с данными, полученными в России при изучении возбудителя туберкулеза легких [4, 5, 7].
Малая дискриминирующая способность сполиготипирования в отношении штаммов генотипа Beijing компенсируется использованием различных схем VNTR-типирования. В целом наиболее информативными оказались локусы MIRU26 (0,51) и QUB26 (0,68), что характерно для российских штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких [10, 15, 16].
MIRU-типирование (12 локусов) штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, выделенных от больных ТС, выявило доминирование типа MIT16 (49%) c числовым профилем 223325153533, что согласуется с данными, полученными для штаммов возбудителя туберкулеза легких в различных регионах РФ [14, 16]. Чуть меньше (36%) была доля штаммов типа MIT17 (223325173533), которая однако превышала таковую (около 20 %) среди штаммов больных с легочной локализацией туберкулеза [15, 16].
Схема MIRU-VNTR типирования по 24 локусам была более информативной (HGI=0,83), нежели по 12 локусам (HGI=0,63), поскольку позволила выделить большее число вариантов. Особый интерес представлял крупный кластер 100-32, включавший 29% штаммов генотипа Beijing, подавляющее большинство (87%) которых были МЛУ. Все штаммы кластера 100-32 имели по 7 тандемных повторов в локусах MIRU26 и QUB26, что характерно для штаммов эпидемиологически и клинически значимого кластера B0, выделенных от больных туберкулезом легких на северо-западе России [5, 15].
Представленные данные свидетельствуют о ведущей роли штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing в развитии туберкулезного спондилита с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.
Авторы благодарят проф. N. Rastogi и D. Couvin за обработку данных, присвоение обозначений SIT/MIT и генетических линий согласно базе данных SITVIT2 Institut Pasteur de la Guadeloupe. Работа выполнена при частичной поддержке Европейской Комиссии (проект ORCHID, FP7, гран-товое соглашение №. 261378).
ЛИТЕРАТУРА
1. Инфекционная заболеваемость в субъектах Российской Федерации за 2010 — 2011гг. Информационный сборник статистических и аналитических материалов.М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012.
2. Картавых А. А., Борисов С. Е., Матвеева М. В. и др. Туберкулез внелегочных локализаций по данным персональных регистров впервые выявленных больных. Туберкулез и болезни легких. 2009,10: 17-26.
3. Левашев Ю.Н. , Мушкин А.Ю., Гришко А.Н. Внелегочный туберкулез в России: официальная статистика и реальность. Проблемы туберкулеза. 2006,11: 3-6.
4. Мокроусов И.В. Генетическое разнообразие и эволюция Mycobacterium tuberculosis. Автореф. дисс. д-ра биол. наук, СПб, 2009.
5. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе. Автореф. дисс. д-ра мед. наук, СПб, 2003.
6. Туберкулез в Российской Федерации, 2010 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации. М., 2011.
7. Balabanova Y, Nikolayevskyy V, Ignatyeva O. et al. Survival of civilian and prisoner drug-sensitive, multi- and extensive drug- resistant tuberculosis cohorts prospectively followed in Russia. PLoS One. 2011, 6 (6): e20531.
8. Bifani P., Mathema B., Kurepina N. et al. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W/Beijing family strains. Trends Microbiol. 2002, 10 (1): 45-52.
9. Brudey K., Driscoll J., Rigouts L. et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. BMC Microbiol. 2006, 6: 23.
10. Garg R., Somvanshi D. Spinal tuberculosis: a review. J. Spinal. Cord. Med. 2011, 34 (5): 440454.
11. Glynn J., Whiteley J., Bifani P. et al. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. Emerg. Infect. Dis. 2002, 8 (8): 843-849.
12. de Steenwinkel J., ten Kate M., de Knegt G. et al. Consequences of noncompliance for therapy efficacy and emergence of resistance in murine tuberculosis caused by the Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2012, 56: 4937-4944.
13. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol. 1997, 35 (4): 907914.
14. Lasunskaia E., Ribeiro S., Manicheva O. et al. Emerging multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence. Microbes. Infect. 2010, 12: 467-475.
15. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A. et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: in search of informative variable-number tandem-repeat loci. J. Clin. Microbiol. 2008, 46 (11): 3576-3584.
16. Nikolayevskyy V., Gopaul K., Balabanova Y. et al. Differentiation of tuberculosis strains in a population with mainly Beijing-family strains. Emerg. Infect. Dis. 2006, 12 (9): 1406-1413.
17. Pang Y.,Song Y.,Xia H. et al. Risk factors and clinical phenotypes of Beijing genotype strains in tuberculosis patients in China. BMC Infect. Dis. 2012, 17 (12): 344-354.
18. Parwati I., van Crevel R., van Soolingen D. Possible underlying mechanisms for successful emergence of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains. Lancet Infect. Dis. 2010, 10 (2): 103111.
19. Purwar S., Chaudhari S., Katoch V et al. Determination of drug susceptibility patterns and genotypes of Mycobacterium tuberculosis isolates from Kanpur district, North India. Infect. Genet. Evol.
2011, 11 (2): 469-475.
20. Rasouli M., Mirkoohi M., Vaccaro A. et al. Spinal tuberculosis: diagnosis and management. Asian Spine J. 2012, 6 (4): 294-308.
21. Sankar M., Singh J., Angelin Diana S. et al. Molecular characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from North Indian patients with extrapulmonary tuberculosis. Tuberculosis (Edinb).
2012, 6: S1472-9792.
22. Supply P., Allix C., Lesjean S. et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (12): 4498-4510.
23. Van Embden J., Cave M., Crawford J. et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993, 31: 406-409.
24. Van Soolingen D., Qian L., de Haas P.E. et al. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia. J. Clin. Microbiol. 1995, 33 (12): 3234-3238.
25. Weng C., Ho C., Dou H. et al. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis isolated from adult patients with tubercular spondylitis. J. Microbiol. Immunol. Infect.2013, 46 (1): 19-23.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Вязовая Анна Александровна, к.б.н.,
197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812) 233-21-49
